Dehp人工包被原dehp-ova及其制備和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小分子有機(jī)污染物的免疫化學(xué)及生物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及有機(jī)合成、 免疫化學(xué)、分子生物學(xué)、理化檢測(cè)等技術(shù)，具體涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯DEHP 人工包被原DEHP-OVA及其制備和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯類(lèi)塑化劑（縮寫(xiě)為PAEs)，又稱(chēng)酞酸酯類(lèi)，是一類(lèi)由鄰苯二甲酸與含 有4-15個(gè)碳的醇發(fā)生費(fèi)歇爾（Fischer)酯化反應(yīng)所形成的酯的重要衍生物的統(tǒng)稱(chēng)。這類(lèi)物 質(zhì)有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下?tīng)顟B(tài)為粘稠液體；液態(tài)條件下溫度范圍寬，流動(dòng)性 大，揮發(fā)性低，不溶于水，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。這類(lèi)物質(zhì)用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲(chóng)劑、潤(rùn)滑劑、乙烯地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料（如 人工心臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個(gè)人護(hù)理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等近千種產(chǎn)品的生產(chǎn)原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 鄰苯二甲酸二（2_乙基）己酯（英文名稱(chēng)：Diethylhexylphthalate，簡(jiǎn)稱(chēng)DEHP)， 又名酞酸雙（2-乙基己）酯，CAS號(hào)為117-81-7,分子式為C24H38O4，分子量為390. 56,無(wú)色液 體，易溶于乙醇、乙醚和礦物油等。該物質(zhì)強(qiáng)毒性，可能會(huì)造成小孩性別錯(cuò)亂、生殖器短小， 對(duì)動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生致癌反應(yīng)；可在人體中累加，可危害男性生殖能力，促使女性性早熟。該物質(zhì) 主要作為塑膠制品（如：軟性PVC產(chǎn)品、醫(yī)療注射用品、玩具等）的增塑劑而廣泛使用。近 些年來(lái)，臺(tái)灣地區(qū)食品中檢測(cè)到該物質(zhì)含量較高，已對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，因此，DEHP在各 類(lèi)食品中的含量引起了社會(huì)的高度關(guān)注。
[0004] 目前對(duì)鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的檢測(cè)手段主要為氣相色譜和高效液相色譜 等儀器檢測(cè)方法，這些方法雖然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的預(yù)處理方法和操作人員的專(zhuān)業(yè)性有 很高的要求。正因?yàn)檫@些方法的處理復(fù)雜、耗時(shí)、儀器價(jià)格昂貴而不適合推廣使用，也不利 于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。為克服這些缺點(diǎn)，尋求一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用 的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的主要研究方向。因此，開(kāi)展研究并建立有效、可靠的塑 化劑的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)相關(guān)的法規(guī)予以保障，成為一項(xiàng)極為重要和迫切的工作。
[0005] 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特 異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和 高靈敏性，非常適合復(fù)雜介質(zhì)中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強(qiáng)、靈敏度 高、方法快捷簡(jiǎn)單、分析通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，使得該類(lèi)方法可以滿足簡(jiǎn)單、快速、靈 敏地檢測(cè)持久性有機(jī)污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等報(bào)道了檢測(cè)體液中 微量物質(zhì)的固相免疫分析技術(shù)，即酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已經(jīng)成為免疫分析方法中重要的組成部分。ELISA方法是 將抗原-抗體之間的免疫反應(yīng)與酶的高效催化特性有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種免疫分析 方法。其中，以親和素-生物素信號(hào)放大系統(tǒng)為基礎(chǔ)的親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分 析方法（BA-ELISA)，以生物素標(biāo)記抗體（抗原），并以酶標(biāo)親和素代替ELISA方法中酶標(biāo)抗 體。親和素是卵白蛋白中的一種堿性糖蛋白，分子量約為68kDa。一個(gè)親和素分子由4個(gè)亞 單位組成，每個(gè)亞單位都可以與一個(gè)生物素分子（分子量為244)特異性結(jié)合。生物素與親 和素結(jié)合特異性強(qiáng)，其親和力比抗原抗體反應(yīng)大得多，親和常數(shù)高達(dá)IO15M^由于一個(gè)親和 素能與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此在檢測(cè)中可提高被固相結(jié)合酶的數(shù)量，進(jìn)而提高檢測(cè)方 法的靈敏度。
[0006]目前尚沒(méi)有親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測(cè)鄰苯二甲酸二（2-乙基） 己酯的相關(guān)報(bào)道。對(duì)于鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯免疫監(jiān)測(cè)方法的建立，制備合格的鄰 苯二甲酸二丁酯人工包被原是建立鄰苯二甲酸二丁酯生物免疫分析檢測(cè)方法的關(guān)鍵，更是 建立鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵。
[0007] 因此，鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制備是采用免疫方法測(cè)定鄰苯 二甲酸二（2-乙基）己酯的基礎(chǔ)，對(duì)于建立塑化劑單體的監(jiān)測(cè)方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和 理論研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種步驟簡(jiǎn)單，速度快，產(chǎn) 率高的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原（DEHP-OVA)的制備和用途；本發(fā)明制備的 塑化劑鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原（DEHP-OVA)為利用包被原、高特異性的多 克隆抗體建立親和素_生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法奠定基礎(chǔ)。該親和素-生物素化 酶聯(lián)免疫吸附分析方法克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法的缺點(diǎn)：樣品預(yù)處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)，檢測(cè)儀器昂貴， 操作人員操作要求高，方法不易于推廣，不能用于環(huán)境污染事故的批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0010] 第一方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原，其結(jié)構(gòu)式如 下：
[0011]
[0012] 第二方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制備方法， 所述方法包括：
與卵清白蛋白（OVA)偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原 (DEHP-OVA)〇
[0014] 優(yōu)選的，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C冰浴遮光條件下進(jìn)行的，反應(yīng)時(shí)間為24~ 36h。所述偶聯(lián)反應(yīng)是在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行的，所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選 自N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜。
[0015] 優(yōu)選的，所述方法還包括離心分離，透析上清液，再次離心分離得到所述鄰苯二甲 酸二（2-乙基）己酯人工包被原的步驟。
[0016]優(yōu)選的，所述鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩爾比 為 1: (5 ~7) : (0? 005 ~0? 05)。
[0017] 優(yōu)選的，所述方法包括將所述鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原溶解于非質(zhì)子 性有機(jī)溶劑中形成半抗原溶液的步驟；所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺或 二甲亞砜。
[0018] 優(yōu)選的，所述鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原是通過(guò)包括如下步驟的方法制 備而得的：
生酯化反應(yīng)，生成4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯；
[0020]S2、在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑存在的條件下，所述4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己 酯和鋅粉在強(qiáng)酸B的作用下發(fā)生還原反應(yīng)，生成鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原，即 DEHP半抗原，化學(xué)名稱(chēng)為4-氨基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯，分子式：C24H39NO4，分子量： 405. 57〇
[0021] 優(yōu)選的，步驟Sl中，4-硝基鄰苯二甲酸、異辛醇、強(qiáng)酸A的摩爾比為1: (5~ 6) : (0. 6~0. 7)，反應(yīng)溫度為120~150°C，酯化反應(yīng)時(shí)間為5~6小時(shí)；所述強(qiáng)酸A選自 濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸。
[0022] 優(yōu)選的，步驟S2中，所述4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯與強(qiáng)酸B、非質(zhì)子性 有機(jī)溶劑和鋅粉的摩爾比為1: (20~25) : (550~580) : (18~20)，（其中非質(zhì)子性有機(jī)溶 劑作為基質(zhì)溶液并不參與反應(yīng)），還原反應(yīng)的溫度為25~30°C，還原反應(yīng)時(shí)間為10~12 小時(shí)；所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自苯或甲苯。所述強(qiáng)酸B選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸。
[0023] 優(yōu)選的，步驟Sl還包括酯化反應(yīng)結(jié)束后蒸餾除去未反應(yīng)的異辛醇和生成的水，再 趁熱將液體倒入冰水中，下層的黃色油狀粗品用10%Na2OV^液洗滌至水層呈無(wú)色，重結(jié) 晶，得到純化后的4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的步驟。
[0024] 優(yōu)選的，步驟S2還包括回流反應(yīng)結(jié)束后用冰水和強(qiáng)堿以終止反應(yīng)，苯萃取反應(yīng) 液，分離、干燥并減壓蒸餾去除有機(jī)相，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為體積比為 1:15的乙酸和正己烷的混合液）純化，得到純化后的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原 的步驟。有機(jī)相以除去苯，后減壓蒸餾，
[0025] 優(yōu)選地，所述采用戊二醛法將鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原與蛋白質(zhì)分子 卵清白蛋白OVA偶聯(lián)制備人工包被原DEHP-OVA具體包括以下步驟：
[0026]B、將DEHP半抗原溶于非質(zhì)子溶劑中，形成DEHP半抗原溶液；卵清白蛋白OVA溶于 PBS中，形成卵清白蛋白溶液；將所述DEHP半抗原溶液滴入卵清白蛋白OVA溶液中形成反 應(yīng)液；
[0027]C、向上述反應(yīng)液中加入戊二醛，攪拌反應(yīng)；
[0028]D、反應(yīng)結(jié)束后，離心分離上清液，將上清液裝入透析袋中透析，離心分離沉淀后得 即得鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原DEHP-0VA。
[0029] 本發(fā)明采用戊二醛法合成鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原，其反應(yīng)方程 式如下：
[0030]
[0031] 上述反應(yīng)方程式中，戊二醛一端的醛基與鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原 4_氨基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的氨基結(jié)合，戊二醛另一端的醛基與卵清白蛋白OVA 一端的氨基結(jié)合，偶聯(lián)脫水，生成了DEHP人工包被原
[0033] 優(yōu)選地，所述DEHP半抗原、戊二醛、OVA的摩爾比為1: (5~7) : (0. 005~0. 05)。
[0034] 優(yōu)選地，步驟C中，所述攪拌時(shí)間為24~36小時(shí)。
[0035] 為充分反應(yīng)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)半抗原與戊二醛、OVA反應(yīng)的摩爾比是1:7:0. 005時(shí)攪 拌反應(yīng)24小時(shí)就可以，當(dāng)半抗原與戊二醛、OVA反應(yīng)的摩爾比是1:5:0. 05時(shí)反應(yīng)就需要36 小時(shí)。
[0036] 優(yōu)選地，步驟B中，所述非質(zhì)子溶劑為N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜；所述將 DEHP半抗原溶液滴入OVA溶液是在0~4°C低溫磁力攪拌下進(jìn)行。所有需要保持蛋白活性 的長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)都需要在低溫情況下進(jìn)行，經(jīng)驗(yàn)表明〇~4°C最合適。
[0037] 第三方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原