噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物及其用圖
【專利說明】噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物及其用途
[0001 ] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明根據(jù)由國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)頒發(fā)的 AA020090和CA016954在政府支持下進(jìn)行。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及噻吩并吡啶化合物的混合二硫 鍵綴合物（mixed disulfide conjugate)以及它們作為用于治療、改善和預(yù)防心血管疾病 的治療劑的用途。
[0004] 引言
[0005] 噻吩并吡啶基化合物廣泛用作用以預(yù)防心臟病發(fā)作和中風(fēng)的抗血小板劑。在這個(gè) 類別中，氯吡格雷（clopidogrel)(波立維（Plavix))、噻氯匹定（ticlopidine)(抵克立得 (Ticlid))和普拉格雷（prasugrel)(伊芬特（Effient))是三種通常使用的前藥。這些藥 劑要求多態(tài)性細(xì)胞色素（P450)介導(dǎo)的氧化性生物活化。所述氧化性生物活化導(dǎo)致緩慢開 始治療作用和若干不利作用，包括嗜中性白細(xì)胞減少癥和血栓性血小板減少性紫癜。
[0006] 需要不要求多態(tài)性細(xì)胞色素（P450)介導(dǎo)的氧化性生物活化的改進(jìn)抗血小板劑。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 氯吡格雷（波立維）、噻氯匹定（抵克立得）和普拉格雷（伊芬特）屬于一類廣泛 用作用以預(yù)防心臟病發(fā)作和中風(fēng)的抗血小板劑的噻吩并吡啶基化合物。然而，若干嚴(yán)重缺 點(diǎn)已與這些藥物相關(guān)聯(lián)，包括缺乏反應(yīng)、毒性和過度出血。這些缺點(diǎn)與它們都是要求由多態(tài) 性細(xì)胞色素P450酶（P450)進(jìn)行氧化性生物活化的前藥的事實(shí)密切相關(guān)。
[0009] 為克服與噻吩并吡啶化合物（氯吡格雷（波立維）、噻氯匹定（抵克立得）和普 拉格雷（伊芬特））相關(guān)的缺點(diǎn)，開發(fā)了噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物。實(shí)際上， 在開發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過程期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的噻吩并吡啶化合物的混合 二硫鍵綴合物能夠在內(nèi)源性谷胱甘肽（GSH)存在下產(chǎn)生活性噻吩并吡啶代謝物（例如能夠 具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代謝物）而不需要由P450進(jìn)行生物活化。這個(gè)方法 不僅繞過由P450達(dá)成的氧化性生物活化過程，而且規(guī)避與噻吩并吡啶基藥物相關(guān)的許多 缺點(diǎn)。舉例來說，因?yàn)樽跃Y合物產(chǎn)生活性代謝物是可預(yù)測的，所以本發(fā)明的噻吩并吡啶化合 物的混合二硫鍵綴合物使給藥一致性改進(jìn)。此外，使用本發(fā)明的噻吩并吡啶化合物的混合 二硫鍵綴合物作為抗血小板劑使毒性降低，因?yàn)椴煌ㄟ^巰基交換反應(yīng)產(chǎn)生毒性反應(yīng)性代謝 物。此外，本發(fā)明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物的治療起效時(shí)間縮短，此使經(jīng)歷 急性心血管事件的患者極大受益。舉例來說，噻吩并吡啶的標(biāo)準(zhǔn)方案要求對患者連續(xù)給藥 3-5天，因?yàn)閮H較小百分比的攝取噻吩并吡啶被轉(zhuǎn)化成活性代謝物。相比之下，本發(fā)明的噻 吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物在少于30min內(nèi)以高產(chǎn)率釋放活性代謝物。此外，本 發(fā)明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物具有超過活性代謝物的優(yōu)越穩(wěn)定性，并且因 此它們可用于定量產(chǎn)生活性代謝物以供在體外進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究。
[0010] 因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物，其 能夠克服與廣泛用作抗血小板劑的噻吩并吡啶基化合物（例如氯吡格雷（波立維）、噻氯匹 定（抵克立得）和普拉格雷（伊芬特））相關(guān)的所述缺點(diǎn)。本發(fā)明不限于噻吩并吡啶化合物 的特定混合二硫鍵綴合物。在一些實(shí)施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物被 描述為式I
包括其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物和/或 前藥；其中R1、R2和R3獨(dú)立地包括使得所得化合物能夠在與內(nèi)源性谷胱甘肽（GSH)相互作 用后產(chǎn)生活性噻吩并吡啶代謝物（例如能夠具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代謝物） 的任何化學(xué)部分。
[0011] 在某一實(shí)施方案中，R1選自由以下組成的組：H、-C0-0CH3和
[0012] 在一些實(shí)施方案中，R3是氯或氟。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，R2選自由以下組成的組：
和
[0014] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物以及 藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)配制以供靜脈內(nèi)（IV)施用的包含噻吩并吡啶 化合物的混合二硫鍵綴合物的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)配制以供靜脈內(nèi) (IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物的藥物組合物用于治療、改善和預(yù) 防動脈粥樣硬化血栓形成。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)配制以供靜脈內(nèi)（IV)施用的包含噻 吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物的藥物組合物用于快速抑制血小板聚集。在一些實(shí) 施方案中，所述經(jīng)配制以供靜脈內(nèi)（IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合 物的藥物組合物在經(jīng)皮冠脈干預(yù)程序（例如冠脈血管成形術(shù)）期間用于快速抑制血小板聚 集。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療、改善或預(yù)防心血管疾病的方法，其包括向患 者施用治療有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物。在一些實(shí)施方案中，所述施 用是靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，心血管疾病選自由以下組成的組：冠狀動脈疾病、外 周血管疾病和腦血管疾病。在一些實(shí)施方案中，化合物使血小板聚集降低（例如通過不可 逆結(jié)合P2Y 12受體）（例如通過阻斷ADP受體）。在一些實(shí)施方案中，化合物能夠在內(nèi)源性谷 胱甘肽存在下產(chǎn)生活性噻吩并吡啶代謝物而不需要由P450進(jìn)行生物活化。在一些實(shí)施方 案中，所述方法進(jìn)一步包括共同施用至少一種選自由以下組成的組的物質(zhì)：HMG-C 〇A還原 酶抑制劑、ACE抑制劑、鈣通道阻斷劑、血小板聚集抑制劑、多不飽和脂肪酸、纖維酸（Fibric Acid)衍生物、膽汁酸螯合劑、抗氧化劑和抗心絞痛劑。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療、改善或預(yù)防患者的血小板于血管上聚集的 方法，其包括向所述患者施用治療有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物。在一 些實(shí)施方案中，所述施用是靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有發(fā)生心血管疾病 (例如冠狀動脈疾病、外周血管疾病和腦血管疾?。┑娘L(fēng)險(xiǎn)或處于所述風(fēng)險(xiǎn)下。在一些實(shí)施 方案中，治療、改善或預(yù)防血小板聚集是通過不可逆結(jié)合P2Y 12受體而發(fā)生。在一些實(shí)施方 案中，治療、改善或預(yù)防血小板聚集是通過阻斷ADP受體而發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，噻吩 并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物能夠在內(nèi)源性谷胱甘肽存在下產(chǎn)生活性噻吩并吡啶代 謝物而不需要由P450進(jìn)行生物活化。
[0018]附圖簡述
[0019] 圖1顯示硫醇還原劑對形成氯吡格雷的活性代謝物（AM)的影響。在0. 1ml 50mM KP緩沖液（pH 7. 4)中產(chǎn)生AM，所述緩沖液含有0. 2mg/ml HLM、0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、 NADPH再生系統(tǒng)和硫醇還原劑。除各自是0. 3mM的CPT、DFT和NPT之外，硫醇還原劑的濃 度是ImM。通過添加5單位G6H)來引發(fā)反應(yīng)，并且在37°C下孵育20min。接著如材料和方 法中所述，以MP衍生物形式定量活性代謝物。報(bào)道的速率是對三個(gè)單獨(dú)測量結(jié)果的平均。 硫醇化合物的縮寫提供于表1中。
[0020] 圖2顯示氯吡格雷的代表性混合二硫鍵綴合物的提取離子色譜圖（EIC)。在37°C 下持續(xù)30min在0. 2ml 50mM KPi緩沖液（pH 7. 4)中產(chǎn)生混合二硫鍵綴合物，所述緩沖液 含有l(wèi)mg/ml HLM、0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、各種硫醇還原劑和NADPH再生系統(tǒng)。如材料和 方法中所述進(jìn)行MS分析。（A)，在m/z 432. 06下的BME綴合物的EIC ; (B)在m/z 482. 08 下的DFT綴合物的EIC ; (C)在m/z 499. 99下的CPT綴合物的EIC ; (D)在m/z 510. 08下的 NPT綴合物的EIC。
[0021] 圖3顯示由HLM產(chǎn)生的AM和氯吡格雷的硫醇綴合物的相對量。在0. 2ml 50mM KP (pH 7. 4)中產(chǎn)生AM和綴合物，如圖2中所述。對于這些分析，將50皮摩爾（S)_氯吡格 雷外加至各樣本中作為IS。如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依賴性掃描模式分析 AM與硫醇綴合物兩者。圖例：空心棒條，m/z 356 (AM)與m/z 322 (IS)的AUC比率；實(shí)心棒 條，相應(yīng)綴合物與IS的AUC比率。
[0022] 圖4顯示CPT的混合二硫鍵綴合物的MS和MS2光譜。如圖2中所述產(chǎn)生綴合物。 如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依賴性掃描模式獲得MS和MS 2光譜。（A) CPT綴合 物的MS光譜；(B) CPT綴合物的母離子m/z 499. 99的MS2光譜；(C)，CPT綴合物的母離子m/ z 501. 94的MS2光譜；(D)，對圖4B中所示的碎裂樣式的指定。
[0023] 圖5顯示由GSH還原氯吡格雷的混合二硫鍵綴合物的動力學(xué)。自含有l(wèi)mg/ml HLM、 0.1 mM 2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系統(tǒng)和各種硫醇還原劑的反應(yīng)混合物制備混合二硫鍵 綴合物，并且使用SPE C18柱進(jìn)行純化，如材料和方法中所述。接著混合純化的綴合物與 ImM GSH和0. 2mg/ml胞質(zhì)溶膠（當(dāng)存在時(shí)）。使用LC-MS/MS分析剩余的綴合物和形成的 AM。圖例：(A)在0. 2mg/ml胞質(zhì)溶膠存在下由ImM GSH還原BME (〇）、CPT ( )、NAC ( ▼ )、DFT( ▲)和NPT( □)的綴合物。（B)在存在和不存在0? 2mg/ml胞質(zhì)溶膠下由ImM GSH 還原CPT綴合物。圖例：（〇），在不存在胞質(zhì)溶膠下的AM形成；（A )，在存在胞質(zhì)溶膠下 的AM形成；（魯），在不存在胞質(zhì)溶膠下的綴合物還原；（▲)，在存在胞質(zhì)溶膠下的綴合物 還原。實(shí)線和虛線是相對于單一指數(shù)函數(shù)的非線性曲線擬合。
[0024] 圖6顯示觀察的在m/z 504下的提取離子色譜圖，其顯示自氯吡格雷的混合二硫 鍵綴合物形成活性代謝物H4。在HLM中產(chǎn)生混合二硫鍵綴合物，并且用SPE柱純化，如圖3 中所述。在MS分析之前，混合二硫鍵綴合物用DTT處理以釋放AM，其接著隨后用MPB衍生。 如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS分析AM-MP衍生物。圖例：A，反式-氯吡格雷-MP (虛 線）和順式-氯吡格雷-MP (實(shí)線）標(biāo)準(zhǔn)物；B，在ImM GSH (虛線）和ImM抗壞血酸（實(shí)線） 存在下獲得的AM-MP ;C，由CPT綴合物獲得的AM-MP ;D，由NPT綴合物獲得的AM-MP ;E，由 DFT綴合物獲得的AM-MP。幅值被乘以2。
[0025] 圖7顯示由氯吡格雷的混合二硫鍵綴合物抑制血小板聚集。在0.3mM CPT和NPT 存在下，自反應(yīng)混合物制備并純化混合二硫鍵綴合物，連同三個(gè)對照樣本含有ImM GSH、不 含有硫醇還原劑或不含有G6ro。將所有樣本都再混懸于0. 5ml PPP中，其中一些用ImM GSH 處理以釋放AM。通過添加10 iiMADP來引發(fā)血小板聚集，并且用聚集計(jì)進(jìn)行記錄。相對于 PRP的聚集百分比使聚集百分比標(biāo)準(zhǔn)化，并且對四個(gè)單獨(dú)測量結(jié)果取平均值。關(guān)于細(xì)節(jié)參見 材料和方法。圖例：PRP，未處理的富含血小板血漿；GSH，含ImM GSH的PRP ;-G6PD，在不存 在G6H)下產(chǎn)生的代謝物；-SH，在不存在任何硫醇還原劑下產(chǎn)生的代謝物；GSH，在存在ImM GSH下產(chǎn)生的代謝物；CPT，在存在0. 3mM CPT下產(chǎn)生的代謝物；CPT+GSH，在存在0. 3mM CPT 下產(chǎn)生，接著用ImM GSH處理的代謝物；NPT，在存在0. 3mM NPT下產(chǎn)生的代謝物；NPT+GSH， 在存在0. 3mM NPT下產(chǎn)生，接著用ImM GSH處理的代謝物。
[0026] 圖8呈現(xiàn)如實(shí)施例X中所述，在重構(gòu)系統(tǒng)中生物合成的純（S)-clopNPT的總離子 色譜圖。在7. 9、8. 6和9. 5min洗脫（S)-clopNPT的三種非對映異構(gòu)體。
[0027] 圖9呈現(xiàn)如實(shí)施例X中所述，雄性NZ白兔在靜脈內(nèi)注射（S) -clopNPT之后的血小 板活性。
[0028] 定義
[0029] 如本文所用的術(shù)語"噻吩并吡啶化合物"是指因其抗血小板活性而被使用的一類 ADP受體/P2Y12抑制劑。實(shí)例包括但不限于氯吡格雷（波立維）、噻氯匹定（抵克立得） 和普拉格雷（伊芬特）。
[0030] 如本文所用的術(shù)語"噻吩并吡啶化合物的混合二硫鍵綴合物"是指能夠在與內(nèi)源 性谷胱甘肽（GSH)相互作用后產(chǎn)生活性噻吩并吡啶代謝物的改性噻吩并吡啶化合物。
[0031] 如本文所用的術(shù)語"前藥"是指母體"藥物"分子的藥理學(xué)無活性衍生物，其要求 在目標(biāo)生理系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化（例如自發(fā)或酶促生物轉(zhuǎn)化）以釋放活性藥物或使前藥轉(zhuǎn) 化（例如以酶促方式、以生理方式、以機(jī)械方式、以電磁方式）成活性藥物。前藥被設(shè)計(jì)來 克服與穩(wěn)定性、水溶性、毒性、缺乏特