一種可用于植物轉(zhuǎn)化的灰蓋鬼傘漆酶基因及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化后適用于植物表達的漆酶序列及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物的血漿銅藍蛋白同屬于多銅氧化酶家族。它最早是從漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)的，隨后陸續(xù)在真菌、植物、部分細菌和昆蟲中也都有發(fā)現(xiàn)。漆酶一般是由含有500左右氨基酸的肽鏈和糖配基組成一種糖蛋白，糖組分包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖等，由于糖基含量的差異，不同來源漆酶的分子量會有較大的差異。漆酶的底物比較廣泛，能夠催化許多化合物的氧化，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、生物色素與甾體激素、金屬有機化合物等。正是由于其底物的多樣性，漆酶可被應用于造紙、環(huán)境污染治理、有機合成、生物及其免疫檢測等諸多領(lǐng)域，成為近年來的研究熱點。
[0003]灰蓋鬼傘菌(Coprinopsis cinerea)屬擔子菌門，層菌綱，傘菌目，鬼傘科，鬼傘屬，具有17種不同的漆酶，本發(fā)明所述的漆酶基因既是其中之一。以野生型基因的序列為基礎(chǔ)，經(jīng)過優(yōu)化使適于在植物中表達，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將優(yōu)化后的漆酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，使轉(zhuǎn)基因擬南芥能表達出有活性的漆酶，轉(zhuǎn)基因植株一方面可用于環(huán)境污染物的生物修復，另一方面也可以做為外源漆酶的替代來源，具有潛在的應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種優(yōu)化后適用于植物表達的漆酶CcLCC3I序列及其應用?；谝吧突蛐蛄袑ζ溥M行優(yōu)化:(一)優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。(二)消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點，便于表達盒構(gòu)建。(三)消除逆向重復序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄終止信號，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。(四)使基因編碼蛋白符合N端原則，以提高翻譯蛋白的穩(wěn)定性。(五)優(yōu)化mRNA 二級結(jié)構(gòu)自由能，以提高基因表達效率。同時刪除組成N端信號肽的16個氨基酸的基因序列。
[0005]所述經(jīng)優(yōu)化后的漆酶CcLCC3I的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
[0006]所述經(jīng)優(yōu)化后的漆酶CcLCC3I的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO 2所不O
[0007]本發(fā)明按照以上原則對原始的CcLCC3基因進行改造，然后進行全基因合成。改造后的基因序列與原序列(GenBank: AAD30966.1)同源性為80.35% (參見圖1)，其編碼的蛋白質(zhì)共含501個氨基酸。
[0008]將基因片段克隆到改造后植物表達載體PYPX158 (參見圖2)中，該載體來源于pCamBIA-1301o
[0009]利用電擊法將上述植物表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，再以得到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化擬南芥，得到轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)鑒定CcLCC3I轉(zhuǎn)入到了擬南芥中，并能表達出有活性的漆酶。該漆酶在介體(ABTS: 2，2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽)存在的條件下，能有效脫色染料孔雀綠、結(jié)晶紫和橙黃G。
[0010]
有益效果
按本發(fā)明合成的基因可以在擬南芥中表達出有活性的漆酶，可做為該漆酶的替代來源，同時在環(huán)境污染物的生物修復方面具有應用潛力。
【附圖說明】
[0011]圖1為卩原始基因序列比對圖2為用于植物表達的pYPX158-6bZ6TJ_/載體
圖3為RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因株系
圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥中漆酶對ABTS的氧化
圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥中漆酶對不同染料的脫色效果
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合【具體實施方式】來進一步闡述本發(fā)明。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的技術(shù)方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0013]本發(fā)明實施中未注明的實驗方法，如連接、轉(zhuǎn)化、相關(guān)培養(yǎng)基的配制等參照分子克隆實驗指南第三版(黃培堂等譯，中國，科學出版社，2002)。植物總RNA的抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司和全式金生物科技有限公司，各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA Ligase購自大連寶生物工程有限公司。其它未注明的化學藥品為分析純級，購自上海國藥集團有限公司。
[0014]實施例1基因植物表達載體的構(gòu)建
將優(yōu)化后的基因序列進行全基因合成，序列如SEQ ID NO I所示。將該基因片段與T/A克隆載體相連(Takara)。轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)，獲得陽性克隆。抽取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)及冊Hl和Sac I雙酶切后，以正確的閱讀框插入到植物表達載體ΡΥΡΧ158中，測序驗證，得到重組質(zhì)粒pYPX158-(參見圖2)。相關(guān)的DNA回收試劑盒、載體、連接酶、核酸內(nèi)切酶均購自Takara公司，DH5 α感受態(tài)由本實驗室保存。
[0015]實施例2:轉(zhuǎn)化擬南芥，具體方法如下:
將pYPX158-CcZ^O/用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，或EHA105，或LBA4404菌株(B1vector C0.，LTD)，得到含有pYPX158-CcZ6TJ/的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。將上述轉(zhuǎn)化子接種于YEB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/ml卡那霉素和75 μ g/ml利福平)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.6-0.8 ;以10, OOOrpm室溫離心lOmin，收集菌體，用等體積5%的新鮮蔗糖溶液懸浮，并加入0.02%的Silwet — 77混勻后轉(zhuǎn)移到燒杯中。每個菌株用300mL轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)2 — 3缽。轉(zhuǎn)化操作中將擬南芥花薹浸入滲透液中，輕輕攪動約1s后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤環(huán)境，水平放置22°C避光培養(yǎng)，24h后去掉保鮮膜直立培養(yǎng)。四天后，再次進行轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化三次。生長約兩個月后，收獲種子，并用50mg/L潮霉素進行轉(zhuǎn)化植株篩選。
[0016]實施例3:轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定稱取約0.1g植物材料進行總RNA的抽提，再以所抽提的總RNA進行cDNA合成，具體方法均參照相應說明書操作進行。進行PCR擴增，所用引物為=Lcc-F:5’ -TGGAAGAGCATCGTAGATAGG-3’ 和 Lcc-R:5’ -GGTGCTCCACATCCTATCCATC-3’，擴增產(chǎn)物為基因中的一段300bp片段。部分植株擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。含有目的產(chǎn)物的為陽性轉(zhuǎn)基因株系。共獲得陽性Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系7個。
[0017]實施例4:轉(zhuǎn)基因擬南芥中漆酶對ABTS的氧化
稱取新鮮植株葉片0.lg，經(jīng)液氮研磨后重懸于PH 3.6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液緩沖液，以10，OOOrpm室溫離心5min，上清即為粗酶液，在200 μ L粗酶液中加入40 μ L ImMABTS在37°C的反應I h。反應完成后檢測420nm下的吸光度(參見圖4)。
[0018]實施例5:轉(zhuǎn)基因擬南芥中漆酶對不同染料的脫色效果
取200 μ L上述粗酶液，加入40 μ L ImM ABTS和10 μ L ImM不同染料，在37°C的反應24 ho比較反應前后，不同染料在特定波長下的吸光度變化，該漆酶有顯著脫色效果。不同染料的檢測波分別為孔雀綠620 nm，結(jié)晶紫590 nm和橙黃G480nm (參見圖5)。
【主權(quán)項】
1.灰蓋鬼傘漆酶CcLCC3I序列，其核苷酸序列如SEQID No I所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漆酶CcLCC3I序列，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQID No 2所示。3.權(quán)利要求1所述的漆酶CcLCC3I序列可以用于轉(zhuǎn)化擬南芥，其特征在于，轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠表達出有活性的漆酶，該酶液對染料有明顯脫色作用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種優(yōu)化后可以用于植物轉(zhuǎn)化的漆酶序列及其應用。所述漆酶CcLCC3I的核苷酸序列如SEQ？ID？No？1，全長1518？bp，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ？ID？No？2，共501個氨基酸。將該基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入擬南芥中，可在擬南芥中表達出有活性的漆酶，該漆酶對染料有明顯脫色作用。
【IPC分類】C12N15/84, A01H5/00, C12N9/02, C12N15/53
【公開號】CN105018505
【申請?zhí)枴緾N201510517482
【發(fā)明人】王波, 姚泉洪, 彭日荷, 田永生, 高建杰, 朱波, 許晶, 付曉燕, 韓紅娟, 王麗娟, 王飛兵, 張 杰
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月22日