專利名稱：小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化
方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，自1992年Vasil等將GUS/Bar基因?qū)胄←湯@得首 例轉(zhuǎn)基因小麥以來，轉(zhuǎn)基因小麥研究有了長足的發(fā)展，小麥轉(zhuǎn)基因的常用方法為基因槍法 (microprojectilebombardment)、花粉管通道法(polly tube pathway)禾口農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 (Agrobacterium mediated transformation)。由于小麥不是農(nóng)桿菌的天然宿主及禾谷類 植物沒有損傷反應(yīng)現(xiàn)象，所以基因槍轉(zhuǎn)化一直是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，盡管小麥遺傳 轉(zhuǎn)化的方法不少，但各種方法的轉(zhuǎn)基因效率很低，一個重要的原因是轉(zhuǎn)化方法不成熟?；?槍轉(zhuǎn)化的受體多為幼胚、成熟胚及其體細(xì)胞愈傷組織，但這些受體在基因槍轟擊后再生率 低已成為一個限制因子，同時，經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化體細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)基因株是一個外源基因雜合 體，須經(jīng)再自交2代才能選出轉(zhuǎn)化基因完全純合的個體，育種程序復(fù)雜。離體培養(yǎng)中花藥愈 傷組織高頻率的再生特性及當(dāng)代加倍純合特點(diǎn)已引起了人們的重視，利用花藥愈傷組織進(jìn) 行遺傳轉(zhuǎn)化，不僅愈傷組織再生特性好，而且再生苗直接加倍后即可成為基因型完全純合 的穩(wěn)定雙倍體。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種小麥花藥愈 傷組織基因槍轉(zhuǎn)化方法，該方法利用小麥花藥愈傷組織再生頻率高、再生株加倍即為純合 二倍體的特點(diǎn)，通過基因槍轟擊、小麥花藥愈傷組織再生與再生株染色體加倍，快速、高效 地進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化，克服了傳統(tǒng)的小麥體細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化中，體細(xì)胞愈傷組織再生特性差、 遺傳轉(zhuǎn)化效率低的缺陷。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案 —種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟 1)小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小 麥幼穗，在2°C 4t:條件下低溫放置2天； 低溫放置后的小麥幼穗經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在花藥愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，于25°C 27t:條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織； 所述的小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物 質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D) :2. 0mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0. 5mg/L，蔗糖 100000mg/L，瓊脂粉5000mg/L ; 調(diào)整花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力1.0kg/cm2) 滅菌20分鐘; 2)高滲培養(yǎng)小麥花藥組織誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后陸續(xù)產(chǎn)生花藥愈傷組織，分批挑選小
3米粒大小、顏色、質(zhì)地一致的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h ;所述的高滲培養(yǎng)
基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基再附加0. 2mol/L甘露醇和0. 2mol/L山梨醇；
3)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化經(jīng)高滲培養(yǎng)后的花藥愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法 進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為金粉直徑l.Oym，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為 6. 0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1 y g/60 y g，每皿材料轟擊1次；
4)恢復(fù)培養(yǎng)基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)8h，然 后轉(zhuǎn)移到小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)6h ; 5)分化篩選培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng)6h后的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行光 照分化篩選培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25 28t:，光照度30001x，每天光照12h ;
所述的分化篩選培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W14，以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下 物質(zhì)6-呋喃基氨基嘌呤(KT) :2.0mg/L， a-奈乙酸(NAA) :0. lmg/L，酪蛋白500mg/L，生 物素0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉5000mg/L ; 調(diào)整分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力1.0kg/cm2)滅菌20
分鐘；經(jīng)基因槍轟擊、恢復(fù)生長的花藥愈傷組織在分化篩選培養(yǎng)基上分化出芽苗。 6)壯苗、生根培養(yǎng)待花藥愈傷組織分化的芽苗長至2 3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯
苗培養(yǎng)基上，于25°C 、3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)； 所述的壯苗、生根培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W14，以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，W14通 用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，添加a _奈乙酸(NAA)O. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉 5000mg/L ; 調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力1.0kg/cm2)滅菌20 分鐘； 7)染色體加倍在壯苗、生根培養(yǎng)基上根、苗生長健壯的花粉植株及時移栽到營 養(yǎng)缽中，于15°C 、 1500Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，用含0. 05%的 秋水仙素和1. 5%的二甲基亞砜的染色體加倍液注射分蘗節(jié)，對花粉植株進(jìn)行染色體加倍， 注射在清晨8 10時進(jìn)行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25 ii L，花粉植株經(jīng)染色體 加倍后得到加倍純合個體； 8)分子檢測并篩選用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對加倍純合個體進(jìn)行分子檢測，篩選 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株。 本發(fā)明的小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法與傳統(tǒng)的體細(xì)胞愈傷組織基因 搶轉(zhuǎn)化相比，本發(fā)明的基因槍轟擊后的花藥愈傷組織再生頻率高，再生株經(jīng)染色體加倍后 可直接獲得轉(zhuǎn)基因純合穩(wěn)定株，克服了傳統(tǒng)的體細(xì)胞愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化中，愈傷組織再 生頻率低、轉(zhuǎn)化株基因雜合，須經(jīng)自交2代選擇純合體的技術(shù)弊端，提高了小麥遺傳轉(zhuǎn)化和 分子育種效率，轉(zhuǎn)化效率達(dá)8%以上。


圖1基因槍轟擊后的花藥愈傷組織高頻率再生
圖2經(jīng)RT-PCR檢測的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)基因再生植株
以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
—、具體實(shí)施例 實(shí)施例1 : 本發(fā)明的小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟 1)小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小
麥幼穗，在2t:條件下低溫放置2天； 低溫放置后的小麥幼穗經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在花藥愈傷組織誘導(dǎo)培
養(yǎng)基上，于25t:條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織； 小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) :2. 0mg/L，酪蛋白:500mg/L，生物素0. 5mg/L，蔗糖100000mg/ L，瓊脂粉:5000mg/L ; 調(diào)整花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力1.0kg/cm2) 滅菌20分鐘。 通用培養(yǎng)基W14的配方為硝酸鉀(KN03) :2000mg/L，磷酸二氫氨(NH4H2P04): 380mg/L，氯化牽丐(CaC12 2H20) :140mg/L，硫酸鎂(MgS04 7H20) :200mg/L，硫酸鉀 (K2S04) :700mg/L，硫酸亞鐵(FeS04 7H20) :27. 8mg/L，乙二酸四乙鈉(Na2EDTA) :37. 3mg/ L，硫酸錳(MnS04 4H20) :8mg/L，硫酸鋅(ZnS04 7H20) :3. Omg/L，硼酸(H3B03) :3. Omg/ L，碘化鉀(KI) :0. 5mg/L，鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) :0. 005mg/L，硫酸銅(CuS04 5H20): 0. 025mg/L，氯化鈷(CoC12 6H20) :0. 025mg/L，鹽酸硫胺素2mg/L，鹽酸吡哆鋅0. 5mg/L， 煙酸0. 5mg/L，甘氨酸:2mg/L ; 2)高滲培養(yǎng)小麥花藥組織誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后陸續(xù)產(chǎn)生花藥愈傷組織，分批挑選小 米粒大小、顏色、質(zhì)地一致的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h ;高滲培養(yǎng)基為愈 傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基再附加0. 2mol/L甘露醇和0. 2mol/L山梨醇； 3)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化經(jīng)高滲培養(yǎng)后的花藥愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法 進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為金粉直徑l.Oym，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為 6. Ocm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1 y g/60 y g，每皿材料轟擊1次；
4)恢復(fù)培養(yǎng)基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)8h，然 后轉(zhuǎn)移到小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)6h ; 5)分化篩選培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng)6h后的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行光 照分化培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為2『C，光照度30001x，每天光照12h ; 分化篩選培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W14，以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì) 6-呋喃基氨基嘌呤(KT) :2.0mg/L， a-奈乙酸(NAA) :0. lmg/L，酪蛋白500mg/L，生物素: 0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉5000mg/L ; 調(diào)整分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5. 6，置于高壓滅菌鍋(壓力1. 0kg/cm2)滅菌20
分鐘；經(jīng)基因槍轟擊、恢復(fù)生長的花藥愈傷組織在分化篩選培養(yǎng)基上分化出芽苗。 6)壯苗、生根培養(yǎng)待花藥愈傷組織分化的芽苗長至2 3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯
苗培養(yǎng)基上，于25°C 、3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)； 壯苗、生根培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，將W14通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一 半，添加a —奈乙酸(NAA)O. 5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉:5000mg/L ;
調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為5. 6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘(1. 0kg/cm2);
7)染色體加倍在壯苗、生根培養(yǎng)基上根、苗生長健壯的花粉植株及時移栽到營 養(yǎng)缽中，于15°C 、 1500Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，用含0. 05%的 秋水仙素和1. 5%的二甲基亞砜的染色體加倍液注射分蘗節(jié)，對花粉植株進(jìn)行染色體加倍， 注射在清晨8 10時進(jìn)行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25 ii L，花粉植株經(jīng)染色體 加倍后得到加倍純合個體； 8)分子檢測并篩選用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對加倍純合個體進(jìn)行分子檢測，篩選 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株。 實(shí)施例2 :本實(shí)施例與實(shí)施例1的步驟相同，區(qū)別在于本實(shí)施例的步驟1)中低溫
放置的溫度為4t:，低溫放置后的小麥幼穗于27t:條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組
織；步驟5)中分化篩選培養(yǎng)溫度為25°C。 實(shí)施例3 :本實(shí)施例與實(shí)施例1的步驟相同，區(qū)別在于本實(shí)施例的步驟1)中低溫
放置的溫度為2t:，低溫放置后的小麥幼穗于26t:條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組
織；步驟5)中分化篩選培養(yǎng)溫度為27°C。
二、本發(fā)明的方法的試驗(yàn)研究及結(jié)果 發(fā)明人于2008年以普通小麥小偃22X西農(nóng)213、花育888X西農(nóng)213及矮敗X 小偃22三個雜交組合的巳代為材料，經(jīng)巳代花藥組織離體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，選取質(zhì)地致 密的180塊花藥愈傷組織用本發(fā)明的方法進(jìn)行基因槍轟擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)與再生，獲得 了 69個再生苗，經(jīng)RT-PCR檢測，獲15個轉(zhuǎn)基因陽性植株，轉(zhuǎn)化效率達(dá)8. 3% 。
權(quán)利要求
一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟1)小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)選取小麥花粉細(xì)胞發(fā)育至單核中期到單核晚期的小麥幼穗，在2℃～4℃條件下低溫放置2天；低溫放置后的小麥幼穗經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)』ㄋ幗M織接種在花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25℃～27℃條件下遮光培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織；所述的小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2.0mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖100000mg/L，瓊脂粉5000mg/L；調(diào)整花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；2)高滲培養(yǎng)小麥花藥組織誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后陸續(xù)產(chǎn)生花藥愈傷組織，分批挑選小米粒大小、顏色、質(zhì)地一致的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h；所述的高滲培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基再附加0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇；3)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化經(jīng)高滲培養(yǎng)后的花藥愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因槍轟擊參數(shù)為金粉直徑1.0μm，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為6.0cm，可裂膜壓力為1100Pa，每槍金粉/DNA用量為1μg/60μg，每皿材料轟擊1次；4)恢復(fù)培養(yǎng)基因槍轟擊后的花藥愈傷組織在上述高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)8h，然后轉(zhuǎn)移到小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)6h；5)分化篩選培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng)6h后的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行光照分化篩選培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；所述的分化篩選培養(yǎng)基選用通用培養(yǎng)基W14，以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)6-呋喃基氨基嘌呤(KT)2.0mg/L，α-奈乙酸(NAA)0.1mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉5000mg/L；調(diào)整分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋(壓力1.0kg/cm2)滅菌20分鐘；經(jīng)基因槍轟擊、恢復(fù)生長的花藥愈傷組織在分化篩選培養(yǎng)基上分化出芽苗。6)壯苗、生根培養(yǎng)待花藥愈傷組織分化的芽苗長至2～3片葉時轉(zhuǎn)移到生根、壯苗培養(yǎng)基上，于25℃、3000Lx光照條件下進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)；所述的壯苗、生根培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基W14為基準(zhǔn)，并將W14通用培養(yǎng)的無機(jī)鹽濃度降低一半，添加α-奈乙酸(NAA)0.5mg/L，蔗糖30000mg/L，瓊脂粉5000mg/L；調(diào)整壯苗、生根培養(yǎng)基的pH值為5.6，置于高壓滅菌鍋滅菌20分鐘；7)染色體加倍在壯苗、生根培養(yǎng)基上根、苗生長健壯的花粉植株及時移栽到營養(yǎng)缽中，于15℃、1500Lx光照條件下緩苗，待完全緩苗且進(jìn)一步生長10天后，用含0.05％的秋水仙素和1.5％的二甲基亞砜的染色體加倍液注射分蘗節(jié)，對花粉植株進(jìn)行染色體加倍，注射在清晨8～10時進(jìn)行，共3次，每隔一天注射1次，每次用量25μL，花粉植株經(jīng)染色體加倍后得到加倍純合個體；8)分子檢測并篩選用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對加倍純合個體進(jìn)行分子檢測，篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥花藥愈傷組織基因槍遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟花藥愈傷組織誘導(dǎo)；高滲培養(yǎng)；基因槍轟擊轉(zhuǎn)化；恢復(fù)培養(yǎng)；分化篩選培養(yǎng)；壯苗、生根培養(yǎng)；染色體加倍；分子檢測并篩選。與傳統(tǒng)的體細(xì)胞愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化相比，本發(fā)明的基因槍轟擊后的花藥愈傷組織再生頻率高，再生株經(jīng)染色體加倍后可直接獲得轉(zhuǎn)基因純合穩(wěn)定株，克服了傳統(tǒng)的體細(xì)胞愈傷組織基因搶轉(zhuǎn)化中，愈傷組織再生頻率低、轉(zhuǎn)化株基因雜合，須經(jīng)自交2代選擇純合體的技術(shù)弊端，提高了小麥遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種效率，轉(zhuǎn)化效率達(dá)8％以上。
文檔編號C12N15/87GK101748152SQ20101010081
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者任慧莉, 史勇, 崔志剛, 權(quán)軍利, 李春蓮, 白延紅, 陳耀鋒, 陳鑫 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)