一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法。利用本方法，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)需要表達(dá)的外源基因連接到同一畢赤酵母表達(dá)載體，在該表達(dá)載體中，每個(gè)基因都位于彼此獨(dú)立的表達(dá)框內(nèi)；用構(gòu)建的共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因高效且同時(shí)穩(wěn)定整合到畢赤酵母基因組中。該方法為實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)在同一畢赤酵母細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)提供了有效的新方法。
【專利說明】一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法，具體來說涉及兩個(gè)及以上基因共轉(zhuǎn)化酵母并獲得多基因整合到同一畢赤酵母基因組中的方法，該酵母轉(zhuǎn)化子中各外源基因在相同且又彼此獨(dú)立的基因表達(dá)調(diào)控元件控制下具有獨(dú)立表達(dá)的能力。
【背景技術(shù)】
[0002]甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用非常廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。以Pichia pastorisCP.pastoris，畢赤巴斯德酵母)為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):①具有特有強(qiáng)力醇氧化酶基因AOXl啟動(dòng)子，用甲醇可以嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；②作為真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白可以進(jìn)行翻譯后加工和修飾；③易于利用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度連續(xù)培養(yǎng)，大量表達(dá)目的產(chǎn)物；④營養(yǎng)要求低，生長快，可以在廉價(jià)的非選擇性培養(yǎng)基中生長表達(dá)量高，許多蛋白可達(dá)到克/升及以上水平；⑥在P.pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外；⑦糖基化程度低。利用啟動(dòng)子A0X1，已在畢赤酵母中高效表達(dá)了 HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素C片段和基因工程抗體等多種外源基因。該系統(tǒng)是一種以提高表達(dá)量并保持生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，非常適宜擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模。該系統(tǒng)表達(dá)的Gphelon制劑等早已獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的。
[0003]到目前為止，雖然有數(shù)千個(gè)外源基因?qū)崿F(xiàn)了在畢赤酵母中的表達(dá)，但這些都是單一的外源基因在畢赤酵母中表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)兩上或以上基因在同一畢赤酵母中表達(dá)，目前主要方法有:(I)將多個(gè)需 要表達(dá)的外源基因融合再轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行表達(dá)；(2)將外源基因串聯(lián)于一個(gè)讀碼框架內(nèi)，利用IRES實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的各自表達(dá)；(3)分別構(gòu)建外源基因的表達(dá)載體，先將其中的一個(gè)轉(zhuǎn)化畢赤酵母，得到酵母轉(zhuǎn)化子，然后將另一個(gè)基因再次轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)入一個(gè)基因的酵母中，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因同時(shí)整合到酵母基因組中。然而，以上3種方法都存在明顯的不足:首先，將不同的通過PCR連接，進(jìn)行融合再構(gòu)建表達(dá)載體。這種方法所得到的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物只能是兩個(gè)基因融合的產(chǎn)物，并且將基因進(jìn)行融合表達(dá)的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的分泌表達(dá)量很低，其低水平分泌表達(dá)的主要原因之一可能是兩亞基的基因片段融合所得到的融合基因片段明顯變大，這可能影響到基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)的分泌；其次，將兩個(gè)亞基串聯(lián)于一個(gè)讀碼框架內(nèi)，利用IRES實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)基因的各自翻譯，從而獲得目標(biāo)蛋白。但是，利用該方法得到的產(chǎn)物的表達(dá)量往往非常低。其原因主要在于，兩個(gè)或多個(gè)基因串聯(lián)于同一個(gè)讀碼框內(nèi)，再加上IRES序列，基因片段比融合表達(dá)的基因片段更大，在僅有共同的表達(dá)調(diào)控元件調(diào)空下，尤其是在唯一的啟動(dòng)子控制下，會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而很難獲得高水平分泌表達(dá)的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子；最后，分別構(gòu)建外源基因的表達(dá)載體，先將其中的一個(gè)轉(zhuǎn)化畢赤酵母，得到酵母轉(zhuǎn)化子，然后將另一個(gè)基因再次轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)入一個(gè)基因的酵母中，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因同時(shí)整合到酵母基因組中的方法往往較難篩選到兩個(gè)基因同時(shí)插入的酵母轉(zhuǎn)化子，因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)化第二種基因時(shí)，第一個(gè)基因很可能被從染色體中重組而去除掉；若要得到3個(gè)及個(gè)以上基因共表達(dá)的酵母轉(zhuǎn)化子概率更低，很難篩選到所有基因都整合的酵母轉(zhuǎn)化子。因此，建立一種快速、簡便的多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的方法將有助于實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因在酵母中共表達(dá)，為重組蛋白尤其是包含兩個(gè)以上不同亞基的外源蛋白在畢赤酵母中共表達(dá)提供一種新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，本發(fā)明提供一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法，利用本方法，可以實(shí)現(xiàn)將需要表達(dá)的多個(gè)外源基因克隆到同一畢赤酵母表達(dá)載體中，在該表達(dá)載體中，每個(gè)基因都位于彼此獨(dú)立的表達(dá)框內(nèi)；同時(shí)，用構(gòu)建的該表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，其生長出的酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR分析，可以得到同時(shí)含有全部多個(gè)基因的酵母轉(zhuǎn)化子，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)整合到酵母基因組中，每個(gè)基因都在相同且獨(dú)立的表達(dá)調(diào)控元件控制下，可以實(shí)現(xiàn)獨(dú)立且共同表達(dá)。該方法為實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)在酵母中彼此獨(dú)立表達(dá)提供了一種新的有效方法。
[0005]解決上述問題的技術(shù)方案如下(以共轉(zhuǎn)2個(gè)基因?yàn)槔?:
DPCR分別擴(kuò)增2個(gè)目標(biāo)基因(命名為A基因和B基因，本發(fā)明中A、B基因分別以常用的綠色熒光蛋白基因eGFP和紅色熒光蛋白基因Cherry為代表)，分別構(gòu)建目標(biāo)基因的酵母表達(dá)載體(以酵母分泌表達(dá)載體PPICZ α為例)pPICZ a -A和pPICZ a -B ；
2)BglI1-BamH I雙酶切表達(dá)載體pPICZ α-A，得到A基因酵母的獨(dú)立表達(dá)框“Box_A”；BamH I單酶切pPICZ α -B，將“Βοχ_Α”和酶切后的pPICZ α -B進(jìn)行連接，得到同時(shí)含有A基因及B基因的酵母表達(dá)載體載體pPICZ α Α/Β ；
3)電轉(zhuǎn)化畢赤酵母， 涂布YPDZ抗性平板，轉(zhuǎn)化子長出后，利用A基因及B基因的引物PCR法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)A和B基因插入到酵母基因組中的情況，挑選出既能擴(kuò)增出A基因又能擴(kuò)增出B基因的轉(zhuǎn)化子即為共表達(dá)Α、B基因的酵母轉(zhuǎn)化子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1是eGFP和Cherry基因的PCR結(jié)果；圖2是共表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖；圖3是共表達(dá)畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證圖。
【具體實(shí)施方式】
[0007]本發(fā)明選用畢赤酵母X-33菌株，整合性表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA載體均購自美國Invritrogen公司。所用培養(yǎng)基配方如下:
I) YPDZ平板:完全溶解I g酵母提取物，2g蛋白胨，1.8 g瓊脂粉，定容到80 mL，121°C蒸氣高壓滅菌15-20 min，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至60°C加入經(jīng)滅菌的10%葡萄糖溶液20 mLUOOI^L I mg/mL的Zeicin,倒10 cm平板,每個(gè)平板倒15 mL,室溫避光冷卻1_2小時(shí)后于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?) LBZ平板:NaCl 0.5 g，蛋白胨I g，酵母提取物0.5 g，1.8 g瓊脂粉，蒸餾水定容到100 L，高壓滅菌，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至60°C加入25 μ? I mg/mL的Zeicin，倒10cm平板，每個(gè)平板倒15mL，室溫避光冷卻1_2小時(shí)后于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0008]一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法，主要包括以下步驟:
1、克隆eGFP基因:
設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以含有eGFP成熟基因的質(zhì)粒為模板(DNA序列為:ATGGTG AGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAACGGCGG )，用特異引物擴(kuò)增出完整 eGFP 基因片段，PCR條件為:94°C預(yù)變性，45min，一個(gè)熱循環(huán)；94 °C熱變性30 s，55 °C褪火30 s，72 V延伸45 s，30個(gè)熱循環(huán)；72 °C復(fù)性10 min，PCR結(jié)果如圖1所示。所獲得的擴(kuò)增片斷連接到PMD20-T載體(購自于廣州TAKARA公司)，核酸測(cè)序鑒定，測(cè)定序列與Genebank公布的 eGFP 的序列一致。PCR 擴(kuò)增引物為:eGFP_for: 5’ -GCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3，；eGFP -rev: 5? -CCGCGGTTGTACAGCTCGTCCATG -3，。其中,GGATCC 為 EcoRI位點(diǎn)，CCGCGG為Sac II位點(diǎn)；
2、構(gòu)建畢赤酵母分表達(dá)載體pPICZa A/eGFP
I)用EcoR I和Sac Π雙酶切重組質(zhì)粒eGFP /pMD20_T，獲得目的片斷eGFP，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司):質(zhì)粒eGFP /pMD20_T 15 μ L ;10X緩沖液 5 μ L ；EcoR I 5 U ；Sac Il 5 U ;加無菌水至 50 μ L ;2)用 EcoR I和 Sac II雙酶切pPICZ α Α,獲得載體片斷，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司):質(zhì)粒 pPICZ a A 15 μ L ；10Χ 緩沖液 5 μ L ；EcoR I 5 U ；Sac II 5 U ;加無菌水至50 yL;3)由I)及2)步后所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行；4)回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，目的基因準(zhǔn)確插入到含有分泌信號(hào)α-因子的分泌型載體讀碼框內(nèi)，反應(yīng)體系如下:質(zhì)粒PPICZaA片段I μ L ;目的片段落強(qiáng)3 yL;10X緩沖液I yL;T4連接酶0.5 μ L ;加無菌水至10 μ L0經(jīng)連接得重組載體 pPICZ α Α/eGFP ；
3、克隆Cherry基因:
設(shè)計(jì)一對(duì)引物， 以含有Cherry成熟基因的質(zhì)粒為模板(DNA序列為:ATGGA TTCGGACCGGCCATTACGGCCGCGTATCACGGCCAGGGCGGCCATGCTGTGCTGCATCAGAAGAACTAAACCGGTTGAGAAGAATGAAGAGGCCGATCAGGAGCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGACCCACCGGTAGCATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA)，用特異引物擴(kuò)增出Cherry基因片段，PCR條件為:94°C預(yù)變性，45min，一個(gè)熱循環(huán)；94 °C熱變性30 s，55 °C褪火30 s，72 °C延伸55 s，32個(gè)熱循環(huán)；72 °C復(fù)性10 min, PCR結(jié)果如圖1所示。所獲得的擴(kuò)增片斷連接到pMD20_T載體(購自于廣州TAKARA公司)，測(cè)定序列與Genebank公布的Cherry的序列一致。PCR擴(kuò)增引物為:Cherry-for: 5， -GCGGATCCATGGA TTCGGACCGGCCATTAC-3， ；Cherry-rev:GCTCTAGATTGTACAGCTCGTCCATG-3，；其中，GGATCC 為 EcoR I 位點(diǎn)，CCGCGG 為 Xba I 位點(diǎn)；
4、構(gòu)建畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZa A/Cherry
I)用EcoR I和Xba I雙酶切重組質(zhì)粒Cherry /pMD20_T,獲得目的片斷Cherry,反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司):質(zhì)粒Cherry/pMD20-T 15 μ L ;IOX 緩沖液 5μ L ;EcoR i 3 U ；Xba I 5 U ;加無菌水至 50 μ L ;2)用 EcoR I 和 Xba I 雙酶切pPICZ α A，獲得載體片斷，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司):質(zhì)粒 pPICZ a A 15 μ L ; 10X 緩沖液 5 μ L ;Xba I 5 U ；EcoR I 5 U ;加無菌水至 50 μ L ;3)由I)及2)步后所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行；4)回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，目的基因準(zhǔn)確插入到含有分泌信號(hào)α-因子的分泌型載體讀碼框內(nèi)，反應(yīng)體系如下:質(zhì)粒pPICZ a A IyL;目的片段3yL;10X緩沖液I μ L ;T4連接酶0.5 μ L ;加無菌水至10 μ L。經(jīng)連接得重組載體pPICZ a A/Cherry ；
5、共表達(dá)載體pPICZα Α-eGFP/cherry的構(gòu)建
Bgl I1-BamH I雙酶切表達(dá)載體pPICZ a/eGFP，得到eGFP基因酵母的獨(dú)立表達(dá)框“Box-eGFP” ；BamH I 單酶切 pPICZ a /Cherry,將 “Box-eGFP” 和酶切后的 pPICZ a /Cherry進(jìn)行連接，LBZ平板篩選轉(zhuǎn)化子`，得到同時(shí)含有eGFP基因及Cherry基因的酵母表達(dá)載體載體PPICZa eGFP/Cherry，表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖如圖2所示。所得的共表達(dá)載體pPICZ a Α-eGFP/cherry經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確；
6、酵母共表達(dá)載體pPICZa eGFP/Cherry電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證
提取共表達(dá)載體pPICZ a eGFP/Cherry,采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達(dá)菌株X_33，并涂布YPDZ抗性平板，于28°C培養(yǎng)2-3天，待轉(zhuǎn)化子長出后，長出的轉(zhuǎn)化子再次涂布于YPDZ高抗性平板(Zeocin濃度為5 mg/L)，待轉(zhuǎn)化子長出后，利用eGFP基因及Cherry基因的引物PCR法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)兩個(gè)基因插入到酵母基因組中的情況。經(jīng)PCR檢測(cè)，隨機(jī)挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子中，得到了 5株能同時(shí)擴(kuò)增出eGFP基因和Cherry基因的酵母轉(zhuǎn)化子，共轉(zhuǎn)化效率達(dá)62.5% ;隨機(jī)挑取PCR驗(yàn)證的共轉(zhuǎn)化畢赤酵母轉(zhuǎn)化子劃線于YPDZ平板，于28°C培養(yǎng)2-3天，長出的轉(zhuǎn)化子再次劃線于YPDZ平板，于28°C培養(yǎng)2_3天，如此傳代10次，隨機(jī)挑選酵母轉(zhuǎn)化子，利用eGFP基因和Cherry基因的特異引物，PCR結(jié)果表明，以eGFP基因的特異引物可以擴(kuò)增出eGFP基因，以Cherry基因的特異引物可以擴(kuò)增出Cherry基因，同時(shí)利用eGFP基因和Cherry基因的特異引物既能擴(kuò)增出eGFP基因，又能擴(kuò)增出Cherry基因，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。PCR結(jié)果說明，利用本方法篩選得到的酵母轉(zhuǎn)化子為同時(shí)含有eGFP基因和Cherry基因的穩(wěn)定酵母轉(zhuǎn)化子，該酵母轉(zhuǎn)化子的eGFP基因和Cherry基因處于相同且彼此獨(dú)立的Aoxl啟動(dòng)子等元件的調(diào)控下，可實(shí)現(xiàn)獨(dú)立表達(dá)。
[0009]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本 發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種多基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母的新方法，其特征在于，利用該方法可以實(shí)現(xiàn)2個(gè)及以上基因共轉(zhuǎn)化畢赤酵母(以共轉(zhuǎn)2個(gè)基因?yàn)槔?，主要包括以下步驟: X PCR分別擴(kuò)增多個(gè)需要在轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中的目標(biāo)基因(命名為A基因、B基因、C基因、D基因……，等等)，分別構(gòu)建目標(biāo)基因的酵母表達(dá)載體(以酵母分泌表達(dá)載體pPICZ α為例)pPICZ a -A、pPICZ a -B、pPICZ a -C pPICZ a -D......，等等；本發(fā)明以共表達(dá)兩個(gè)基因(A基因和B基因，本發(fā)明中A、B基因分別以常用的綠色熒光蛋白基因eGFP和紅色熒光蛋白基因Cherry為代表)為例進(jìn)行說明；.l: Bgl I1-BamH I雙酶切表達(dá)載體pPICZ α -A，得到A基因酵母的獨(dú)立表達(dá)框“Box-A” ；BamH I單酶切pPICZ α -B,將“Βοχ-A”和酶切后的pPICZ α -B進(jìn)行連接，得到同時(shí)含有A基因及B基因的酵母表達(dá)載體載體pPICZ α Α/Β ;以此類推，若要實(shí)現(xiàn)A、B、C三個(gè)基因的表達(dá)，可將pPICZaA/B BamH I單酶切與利用Bgl I1-BamHI雙酶切表達(dá)載體pPICZ a -C所得獨(dú)立表達(dá)框“Box-C”進(jìn)行連接，得到可獨(dú)立表達(dá)的共表達(dá)載體pPICZ a A/B/C，以此類推，可以構(gòu)建更多基因獨(dú)立表達(dá)的多基因共表達(dá)載體(本發(fā)明以共表達(dá)兩個(gè)基因Α、B為例進(jìn)行說明)；1:酵母共表達(dá)載體載體pPICZ α Α/Β電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，涂布YPDZ抗性平板，轉(zhuǎn)化子長出后，利用A基因及B基因的引物PCR法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)A和B基因插入到酵母基因組中的情況，挑選出既能擴(kuò)增出A基因又能擴(kuò)增出B基因的轉(zhuǎn)化子即為共表達(dá)Α、B基因的酵母轉(zhuǎn)化子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的共表達(dá)宿主菌為畢赤酵母，表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，外源基因?yàn)槿我鈨煞N(或兩種以上)需要在酵母中獨(dú)立且共表達(dá)的外源基 因。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103820488SQ201410077200
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】李洪波, 吳東海 申請(qǐng)人:懷化學(xué)院