陸地棉轉化事件lf-icr22及其特異性鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及陸地棉轉化事件LF-ICR22及其特異性鑒定 方法。
【背景技術】
[0002] 轉化事件是由外源基因在基因組插入位點的上下游側翼區(qū)和外源基因構成的分 子結構。通常，外源基因轉化植物可W得到一個轉化體群體，運個轉化體群體包含大量獨立 的事件，其中每個事件都是獨特的。外源基因在植物中的表達受到外源基因所插入的染色 體位置的影響。運可能源自染色質結構或者整合位點附近轉錄調控元件的影響。相同基因 在不同轉化事件中的表達水平具有很大的差異，在表達的空間或時間模式上也可能存在差 異。而且外源基因的插入也可能會影響內源基因的表達。因此，每個獨立轉化事件對受體 植物的影響都是不同的。獲得能有效表達外源基因，同時不影響植株本身農(nóng)藝性狀的植物 轉化事件在培育轉基因作物新品種中具有重要的應用價值。
[0003] 棉花作為重要的經(jīng)濟作物，是紡織工業(yè)的重要原料，是國防工業(yè)重要的戰(zhàn)略物質， 在國民經(jīng)濟中發(fā)揮著作用。棉花纖維細胞是自然界中天然存在的最長的細胞，是研究細胞 伸長調控機制的最佳材料；陸地棉是栽培最為廣泛的栽培種，目前全球棉花產(chǎn)量的95%源 于陸地棉，伴隨著勞動力成本的提高，棉花機械化采摘是未來發(fā)展得必然趨勢。長度與比強 度都在30W上的優(yōu)質纖維棉花是生產(chǎn)上所必須的，但由于我國引進陸地棉的時間不足100 年，長纖維陸地棉資源材料相對匿乏，導致傳統(tǒng)的育種方法很難在短期內產(chǎn)生適合生產(chǎn)上 應用的改良的纖維品質的棉花。
[0004] 前人研究表明棉纖維發(fā)育可分成四個重疊的時期分別為：纖維發(fā)育的起始期（開 花前1天至開花后2-3天）、纖維伸長期（開花后3天至25天）、次生壁加厚期（開花后15 天至45天）及成熟期（開花后45天至50天）。開花后15天是纖維的快速伸長期，纖維伸 長速率最快可達到2mm/天。纖維的長度是纖維品質的重要指標，纖維發(fā)育的機制研究為纖 維品質的改良奠定了基礎。

【發(fā)明內容】
陽0化]本發(fā)明的一個目的是提供一種轉基因棉花的培育方法。
[0006] 本發(fā)明轉基因棉花的培育方法為將外源DNA片段插入目的棉花基因組第A09號染 色體的第65694545-65696799位間，替換掉第A09號染色體的第65694545-65696799位間 2253bp的堿基序列，得到轉基因棉花；
[0007] 所述轉基因棉花的纖維品質高于所述目的棉花；
[0008] 所述外源DNA片段為含有化KCS6基因的DNA分子。
[0009] 上述方法中， 陽010] 所述外源DNA片段的核巧酸序列為序列表中序列1 ;
[0011] 所述外源DNA片段在所述轉基因棉花的上游側翼片段為所述目的棉花基因組第 A09號染色體的自第65694545位核巧酸起向其上游方向延伸得到的長度為ο至5肺的任意 一個DNA片段；
[0012] 所述外源DNA片段在所述轉基因棉花的下游側翼片段為所述目的棉花基因組第 Α09號染色體的自第65696799位核巧酸起向其下游方向延伸得到的長度為0至5肺的任意 一個DNA片段。
[0013] 上述方法中，
[0014] 所述上游側翼片段為序列表中序列2所示的核巧酸；
[0015] 所述下游側翼片段為序列表中序列3所示的核巧酸；
[0016] 所述轉基因棉花的纖維品質高于所述目的棉花體現(xiàn)在如下BD-B13):
[0017] Β1)轉基因棉花纖維的長度高于所述目的棉花；
[0018] Β2)轉基因棉花纖維的比強度高于所述目的棉花；
[0019] Β3)轉基因棉花纖維的整齊度高于所述目的棉花；
[0020] Β4)轉基因棉花的巧棉產(chǎn)量高于所述目的棉花；
[0021] Β5)轉基因棉花的株高高于所述目的棉花；
[0022] Β6)轉基因棉花的葉片長度高于所述目的棉花；
[0023] Β7)轉基因棉花的葉片寬度高于所述目的棉花；
[0024]Β8)轉基因棉花的葉柄長度高于所述目的棉花；
[0025] Β9)轉基因棉花的葉柄寬度高于所述目的棉花；
[00%] Β10)轉基因棉花的單鈴數(shù)高于所述目的棉花；
[0027] Β11)轉基因棉花的成鈴數(shù)高于所述目的棉花；
[002引 Β12)轉基因棉花的果枝數(shù)高于所述目的棉花；
[0029]Β13)轉基因棉花的衣分高于所述目的棉花；
[0030] 所述外源DNA片段通過含有所述外源DNA片段的重組載體導入所述目的棉花；
[0031] 所述目的棉花為陸地棉。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述轉基因棉花為轉基因棉花LF-ICR22。
[0034] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測或輔助檢測植物樣品是否來源于上述轉基 因棉花LF-ICR22或其后代的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的用于檢測或輔助檢測植物樣品是否來源于上述轉基因棉花 LF-ICR22或其后代的方法包括如下步驟：
[0036] 檢測所述植物樣品的基因組DNA中是否含有DNA片段Α，
[0037] 所述DNA片段A由上述外源DNA片段在所述轉基因棉花LF-ICR22的上游側翼片 段、上述外源DNA片段和上述外源DNA片段在所述轉基因棉花LF-ICR22的下游側翼片段組 成；
[0038] 若所述植物樣品的基因組DNA含有所述DNA片段A，則所述植物樣品為或候選為所 述轉基因棉花LF-ICR22或其后代；
[0039] 若所述植物樣品的基因組DNA不含有所述DNA片段A，則所述植物樣品不為或候選 不為所述轉基因棉花LF-ICR22或其后代。
[0040] 上述方法中，
[0041] 所述方法為如下1)或2)或3): 柳42] 1)直接測序；
[00創(chuàng) 2)用引物對1和/或引物對2對植物樣品的基因組DNA進行PCR擴增，若有目的 擴增產(chǎn)物，則所述植物樣品來源于所述轉基因棉花LF-ICR22或其后代； W44] 所述引物對1為能夠擴增由所述外源DNA片段5'端和緊鄰其的所述上游側翼序列 部分或全部片段組成的DNA分子甲的引物對；其對應的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子甲；
[0045] 所述引物對2為能夠擴增含有所述外源DNA片段3'端和緊鄰其的所述下游側翼序 列的部分或全部組成的DNA分子乙的引物對；其對應的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子乙；
[0046] 3)用能特異結合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探針對所述待測植物樣品 DNA進行Southern雜交，若能雜交得到雜交片段，則所述植物樣品來源于所述轉基因棉花 LF-ICR22或其后代。
[0047] 上述方法中， W48]。中，所述引物對1由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所 示的單鏈DNA分子組成； W例所述引物對2由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單 鏈DNA分子組成。
[0050] 本發(fā)明還有一個目的是提供用于檢測樣品是否來源于所述轉基因棉花LF-ICR22 或其后代的試劑盒。
[0051] 本發(fā)明提供的用于檢測樣品是否來源于所述轉基因棉花LF-ICR22或其后代的試 劑盒包括上述引物對1和/或上述引物對2。
[0052] 上述轉基因棉花LF-ICR22在育種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0053] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種獲得纖維品質提高的棉花的方法。
[0054] 本發(fā)明提供的獲得纖維品質提高的棉花的方法包括如下步驟：
[0055] (1)按照上述方法獲得轉基因棉花；
[0056] (2)將所述轉基因棉花自交或雜交，得到繁育后代，按照上述方法鑒定所述繁育后 代，得到目標植株；
[0057] 所述轉基因棉花的保藏編號為CCTCCNO.P201516。
[0058] 本發(fā)明最后一個目的是提供用于轉基因棉花的培育的產(chǎn)品。
[0059] 本發(fā)明提供的用于轉基因棉花的培育的產(chǎn)品為如下a)-c):
[0060] a)上述上游側翼片段和上述下游側翼片段； 陽06Ub)上述外源DM片段； 陽06引C)與上述外源DNA片段相關的生物材料；
[0063] 所述生物材料為下述A1)至A11)中的任一種：
[0064] A1)含有上述外源DNA片段的表達盒； 陽0化]A2)含有上述外源DNA片段的重組載體；
[0066] A3)含有A1)所述表達盒的重組載體；
[0067] A4)含有上述外源DNA片段的重組微生物；
[0068] A5)含有A1)所述表達盒的重組微