小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生體系的構(gòu)建方法
【專利說明】
[0001] 國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31071671)和天津市科委青年基金項(xiàng)目 (14JCQNJC14900)天津市科技支撐重點(diǎn)（11ZCKFNC00700)資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，涉及小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、再分化、再生植株 以及大田移栽、結(jié)籽一系列過程，在小麥分子育種及小麥基因轉(zhuǎn)化方面有重要應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，在生產(chǎn)上，逆境脅迫和病蟲害制約著小麥產(chǎn)量和 質(zhì)量，培育抗逆、抗病、優(yōu)質(zhì)的小麥品種是解決這一問題的有效途徑之一。目前小麥育種的 主要技術(shù)有基因工程育種、細(xì)胞工程育種、輪回選擇育種等，利用基因工程育種能打破種間 隔離，縮短育種年限，對(duì)小麥進(jìn)行定向改良具有廣闊的應(yīng)用前景。從方法上來說，轉(zhuǎn)基因技 術(shù)可分為依賴和不依賴植物組培兩類，依賴植物組織培養(yǎng)常見的轉(zhuǎn)基因方法有基因槍法和 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。然而與煙草、大豆和水稻等其它作物相比，小麥組織培養(yǎng)再生率低，遺傳轉(zhuǎn) 化難度大，這阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用。優(yōu)化小麥再生體系提高其植株再生 率是小麥轉(zhuǎn)基因研究的重要基礎(chǔ)工作。
[0004] 不同基因型小麥愈傷組織的再生能力差異很大，外植體的選擇也對(duì)植株再生能力 具有很大影響。目前小麥的幼胚（He等，1986)、成熟胚(劉芳等，2010)、花藥(莊家駿等， 1984 ;韓曉峰等，2010)、幼穗（Chin等，1977)等多種材料均已被選作外植體進(jìn)行愈傷組織 誘導(dǎo)和植株再生研究。由于來源于幼胚的愈傷組織再生能力較強(qiáng)，所以大多數(shù)學(xué)者以幼胚 為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)、研究，但小麥幼胚的獲得受季節(jié)限制、幼胚的消毒程度不易控制：消毒 力度小，在后續(xù)的誘導(dǎo)培養(yǎng)中容易染菌；消毒力度大又會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng)，降低誘導(dǎo)率， 與幼胚相比，成熟胚為外植體，具有易于消毒，取材方便，不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，但再分化率 較幼胚低。因此本發(fā)明以成熟胚為外植體，在種子消毒、成熟胚處理、激素濃度、誘導(dǎo)、分化、 生根培養(yǎng)基的組成等進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高頻再生率的成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體 系，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化提供重要的基礎(chǔ)性材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種通過小麥京411成熟胚為外植體，構(gòu)建愈傷組織誘導(dǎo)、植株再 生及獲得再生籽粒體系，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化提供重要的基礎(chǔ)性材料。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生體系的構(gòu)建方法，其特征在于按如下的 步驟進(jìn)行： (1)植物材料：選取色澤、大小均勾的冬小麥栽培品種，70%(w/w)酒精處理5min，無菌 水沖洗2-3次，用50%(w/w)次氯酸鈉消毒30min，無菌水沖洗3次，4°C冷藏2h后取出再用 無菌水沖洗一次；所述的小麥栽培品種指的是：京411、Brock、春麥S10鑒-6、春麥津強(qiáng)5 號(hào)； (2) 誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)基的篩選：通過對(duì)6個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、8個(gè)分化培養(yǎng)基的篩選，獲得成 熟胚從脫分化到再分化以及形成再生苗的系統(tǒng)為：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.Omg*L4， 4-D+200mg.LtH+lOOmg.L^1+25011?.Ltlu，分化和植株再生培養(yǎng)基為MS+10mg.LVT+ 0. 1mg·LhAA，生根培養(yǎng)基為1/2MS;以上所有培養(yǎng)基均添加30g·L1鹿糖，瓊脂粉8. 5g·L\ PH5. 8,在121°C下經(jīng)1.lkg/cm2高壓濕熱滅菌20min; (3) 成熟胚的處理和誘導(dǎo)：取步驟（1)中消毒并低溫處理好的種子，不去掉胚乳，將胚 縱向全切但胚乳不完全切開，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，直徑6cm的培養(yǎng)皿，平均每皿接種20個(gè)， 25°C暗培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿上標(biāo)明品種、培養(yǎng)基、日期和接種外植體數(shù)，培養(yǎng)10d后統(tǒng)計(jì)出愈率， 挑選胚性愈傷組織繼代，每周繼代一次，繼代四次后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光強(qiáng) 2000LUX，每天光照16h，培養(yǎng)溫度為25°C，每15d繼代一次，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率及出 苗率，待分化苗長(zhǎng)至3_4cm時(shí)接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，30d后統(tǒng)計(jì)植株生根率； (4) 組培苗的管理： 待試管苗的根長(zhǎng)4-5cm，生長(zhǎng)一個(gè)月后將其煉苗培養(yǎng)，煉苗營(yíng)養(yǎng)土為經(jīng)高壓蒸汽滅菌后 的泥炭土、蛭石和珍珠巖，其泥炭土 ：蛭石：珍珠巖的質(zhì)量比為6:3:1，煉苗培養(yǎng)2周后將苗 移栽至田間，定期管理，直至植株成熟收獲； 愈傷組織繼代4次后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行再分化，大部分愈傷組織在一周后開始 分化，長(zhǎng)出綠點(diǎn)，15天后開始出現(xiàn)植株幼苗，25天后幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，接入1/2MS生根 培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)30天后移栽煉苗，田間煉苗2周后植株移栽至田間，用一薄層蘆葦草覆 蓋田間麥苗，翌年3月初組培苗正常返青，4月可發(fā)現(xiàn)植株分蘗，植株數(shù)量明顯增多，莖干粗 壯，5月初植株開始抽穗，待麥穗成熟后收割，平均每顆穗約收51粒種子。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生體系的構(gòu)建方法 在提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化率方面的應(yīng)用。特別是在提高成熟胚再生出苗率方面的應(yīng)用，所述的 成熟胚指的是：栽培小麥品種京411的成熟胚。
[0008] 本發(fā)明以冬小麥栽培品種京411、Brock和春麥S10鑒-6、春麥津強(qiáng)5號(hào)四種不同 基因型小麥成熟胚為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選，獲得出愈率較高培養(yǎng)基MS+ 2.Omg.L4-D+200mg.LtH+lOOmg.L^1+25011^.Ltlu。小麥京411 在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 獲得最高誘導(dǎo)率，為95. 38%，因此選取京411進(jìn)行再分化、植株再生體系進(jìn)一步優(yōu)化，其分 化率和再生成苗率最高的培養(yǎng)基為MS+10mg*LVT+ 0. 1mg*LlAA，分化率為100%，成苗 率為 49. 33%。
[0009] 本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下： 1材料與方法 1. 1植物材料 栽培小麥aesiiKiM?L.)京411為農(nóng)藝性狀優(yōu)良的華北地區(qū)當(dāng)家品種，易感 白粉??；抗白粉病栽培小麥Brock;春麥S10鑒-6為強(qiáng)抗白粉病品種，春麥津強(qiáng)5號(hào)為易感 白粉病品種。上述小麥品種現(xiàn)均種植于天津師范大學(xué)生物科技園。
[0010] 培養(yǎng)基 表1誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基的代號(hào)及成分
誘導(dǎo)培養(yǎng)基：分別以MS和NB為基本培養(yǎng)基并添加蔗糖、瓊脂、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素。
[0011] 分化培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖、瓊脂，并根據(jù)添加激素與否及 激素配比不同構(gòu)成8種分化培養(yǎng)基。
[0012] 生根培養(yǎng)基：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖和瓊脂。
[0013] 以上所有培養(yǎng)基均添加蔗糖，瓊脂粉8. 5g，L\PH5.8,在121°C下經(jīng) 1.lkg/cm2高壓濕熱滅菌20min。
[0014] 方法 1. 3. 1種子的處理 選取色澤、大小均勻的小麥種子，70%酒精處理5min，無菌水沖洗2-3次，用50%次氯酸 鈉消毒30min，無菌水沖洗3次，4°C冷藏2h后取出再用無菌水沖洗一次。
[0015] 成熟胚的誘導(dǎo) 取有胚乳支撐的成熟胚，將其縱全切(沿胚軸完全切開至種臍)，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，（直 徑6cm的培養(yǎng)皿，平均每皿接種20個(gè))25°C暗培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿上標(biāo)明品種、培養(yǎng)基、日期和接 種外植體數(shù)，培養(yǎng)l〇d后統(tǒng)計(jì)出愈率。挑選胚性愈傷組織繼代，每周繼代一次，繼代四次后 轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000Lux，每天光照16h，培養(yǎng)溫度為25°C，每15d繼代 一次，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率及出苗率。待分化苗長(zhǎng)至3_4cm時(shí)接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生 根培養(yǎng)，30d后統(tǒng)計(jì)植株生根率。
[0016] 組培苗的管理 待試管苗的根生長(zhǎng)一個(gè)月后(根長(zhǎng)約4-5cm)將其煉苗培養(yǎng)，煉苗營(yíng)養(yǎng)土為經(jīng)高壓蒸汽 滅菌后的泥炭土、蛭石和珍珠巖，其比例為6:3:1。煉苗培養(yǎng)2周后將苗移栽至田間，定期管 理，直至植株成熟收獲。
[0017] 數(shù)據(jù)處理與分析 出愈率=(出愈外植體數(shù)+接種外植體數(shù)）X100% 分化率=(分化出綠點(diǎn)的愈傷數(shù)+接種愈傷數(shù)）X100% 成苗率=(分化出綠芽的愈傷數(shù)+接種愈傷數(shù)）X100% 生根率=(生根成苗的愈傷組織塊數(shù)+接種的愈傷組織塊數(shù)）X100% 所有統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSSStatistics17.0軟件完成，成熟胚的脫分化率比較試驗(yàn)中， 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)分析采用?檢驗(yàn)；愈傷組織分化培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù) 分析米用單因素S_N_K檢驗(yàn)法。
[0018] 所得結(jié)果 2. 1基因型和誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)小麥成熟胚出愈率的影響 將4個(gè)品種的小麥接種在6種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。兩個(gè)冬小麥品種京411和Brock在接種第3天時(shí)，就開始有愈傷組織形成，但兩個(gè)春麥品種春麥S10鑒-6和春麥津強(qiáng)5號(hào) 接種6天才誘導(dǎo)出愈傷組織。由于冬麥和春麥材料出愈的時(shí)間不同，我們連續(xù)觀察了誘導(dǎo) 15天的出愈情況，發(fā)現(xiàn)冬麥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)7天時(shí)，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，可以滿足繼代 培養(yǎng)要求；而春麥需要10天的誘導(dǎo)才能切下繼代培養(yǎng)，因此在誘導(dǎo)培養(yǎng)第10天統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng) 基的愈傷組織出愈率并評(píng)定愈傷組織質(zhì)量。
[0019] 統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其它3個(gè)品種相比，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，小麥京 411成熟胚的平均出愈率最高，且在MSI培養(yǎng)