凝膠提取物(終濃度分別為 200，300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL，即 ImL 培養(yǎng)基中含有的開普蘆薈凝膠提取物分別由200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg開普蘆薈提取得到)的培養(yǎng)基，另外三排孔作為對照組加入空白培養(yǎng)基，將96孔板放到培養(yǎng)箱中第二次培養(yǎng)72h后；將細(xì)胞采用亞甲基藍(lán)染色法進(jìn)行染色，并測定595nm波長處的吸光值，按照如下公式計算分析增殖組相對于對照組的細(xì)胞相對增殖率:P(% ) = A/ACX 100%；其中，P:細(xì)胞相對增殖率，A:增殖組吸光值，A。:對照組吸光值；當(dāng)細(xì)胞相對增值率不小于80%時，表明該濃度的待測物對細(xì)胞不具有抗增殖效果，得到待測物不具有抗增殖效果的濃度，即為待測物對HepG2細(xì)胞無毒性且不具有抗增殖效果的濃度；
[0059]結(jié)果如圖6所示，在待測濃度下，細(xì)胞沒有抗增殖情況出現(xiàn)，所以開普蘆薈凝膠待測濃度都具有細(xì)胞抗輻射實驗的可行性；
[0060](3)將開普蘆薈凝膠提取物lg/mL凍干后用培養(yǎng)基重新溶解備用；將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化下來，離心計數(shù)后，配制成4.0X 15個/mL的細(xì)胞懸浮液；準(zhǔn)備兩塊96孔投射板，外圍加入100 μ L PBS,其他孔加入100 μ L的細(xì)胞懸浮液；將兩塊96孔板放入培養(yǎng)箱中首次培養(yǎng)4h后拿出96孔板，吸出培養(yǎng)基，每孔用100 μ L PBS清洗，其中，一塊96孔板上的三排孔孔作為紫外組，加入含有不同終濃度開普蘆薈凝膠提取物(終濃度分別為 200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL，即 ImL 培養(yǎng)基中含有的開普蘆薈凝膠提取物分別由200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg開普蘆薈提取得到)的培養(yǎng)基，另外三排孔作為紫外對照組，加入空白培養(yǎng)基，另一塊96孔板作為對照組加入空白培養(yǎng)基；將兩塊96孔板放到培養(yǎng)箱中第二次培養(yǎng)24h后；用能量為800000 μ J/cm2的紫外線UVC (波長為230nm?275nm)輻照對照組和紫外組細(xì)胞2?5min，對照組不進(jìn)行任何輻照；當(dāng)紫外對照組細(xì)胞死亡率為50%左右時，結(jié)束紫外線UVC輻照，然后三組細(xì)胞每孔用100 μ L PBS清洗，吸出后重新加入培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中第三次培養(yǎng)24h ;
[0061](4)將步驟(3)中培養(yǎng)后的細(xì)胞采用亞甲基藍(lán)染色法進(jìn)行染色，并測定595nm波長處的吸光值，按照如下公式計算紫外組相對于對照組的相對細(xì)胞存活率:V(% ) = Ad/AuX 100% ;其中，V:細(xì)胞存活率，Ad:紫外組吸光值，Au:紫外對照組吸光值；如果相對細(xì)胞存活率大于100%，則終濃度為A的待測物具有抗紫外輻射能力，如果相對細(xì)胞存活率=100%，則終濃度為A的待測物不具有抗紫外輻射能力；如果相對細(xì)胞存活率小于100%，則終濃度為A的待測物具有抗增殖效果，本實施例中A分別為200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL ；
[0062]結(jié)果如圖7所示，開普蘆薈凝膠只有在較高的濃度下才有明顯的抗輻射效果；
[0063](5)按照如下公式計算紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比:R(% ) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比；Ad:紫外組吸光值；AU:紫外對照組吸光值；A:對照組吸光值；然后結(jié)合CalcuSyn軟件計算細(xì)胞修復(fù)EC50值；開普蘆薈凝膠濃度在800mg/mL時，對死亡細(xì)胞的保護(hù)才達(dá)到60.85% ;效果較木立蘆薈皮差。
[0064]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)4?8h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對照組、紫外對照組和紫外組，其中，紫外組加入含有待測物的培養(yǎng)基，對照組和紫外對照組加入與紫外組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)20?30h后，用紫外線UVC輻照紫外對照組和紫外組細(xì)胞，對照組不進(jìn)行任何輻照；當(dāng)紫外對照組細(xì)胞死亡率為40%?60%時，結(jié)束紫外線UVC輻照并用PBS清洗三組細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，第三次培養(yǎng)20?30h，其中，所述的待測物在培養(yǎng)基中的終濃度為A，為待測物對HepG2細(xì)胞無毒性且不具有抗增殖效果的濃度； (2)檢測細(xì)胞活性并計算、分析紫外組相對于紫外對照組的相對細(xì)胞存活率，如果相對細(xì)胞存活率> 100%，則終濃度為A的待測物具有抗紫外輻射能力，如果相對細(xì)胞存活率=100%，則終濃度為A的待測物不具有抗紫外輻射能力；如果相對細(xì)胞存活率< 100%，則終濃度為A的待測物具有抗增殖效果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于還包含如下步驟: (3)采用細(xì)胞活性染料對步驟(I)第三次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測定檢測波長處的OD值，按照如下公式計算紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比:R(%) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比；Ad:紫外組吸光值；AU:紫外對照組吸光值；A:對照組吸光值；然后結(jié)合CalcuSyn軟件計算細(xì)胞修復(fù)EC50值。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟⑴中所述的細(xì)胞懸浮液濃度為3.0X 15?5.0X 10 5個/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟⑴中所述的紫外線UVC波長為230nm?275nm ； 步驟(I)中所述的紫外線UVC輻照時能量均勻，能量為500000?1000000 μ J/cm2。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的相對細(xì)胞存活率通過下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對步驟(I)第三次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測定檢測波長處的OD值，按照如下公式計算相對細(xì)胞存活率:V(% ) = Ad/AuX 100% ;其中，V:相對細(xì)胞存活率，Ad:紫外組吸光值，A u:紫外對照組吸光值。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的待測物對IfepG2細(xì)胞無毒性且不具有抗增殖效果的濃度通過如下步驟獲得: ①將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)20?30h后吸出培養(yǎng)基，加入PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對照組和毒性組，其中，毒性組加入含有不同濃度待測物的培養(yǎng)基，對照組加入與毒性組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)20?30h后，檢測細(xì)胞活性并計算、分析毒性組相對于對照組的細(xì)胞生長抑制率，當(dāng)細(xì)胞生長抑制率不大于20%時，表明該濃度的待測物對細(xì)胞無毒性，得到待測物的安全濃度； ②將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)4?8h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對照組和增殖組，其中，增殖組加入含有不同濃度待測物的培養(yǎng)基，待測物在培養(yǎng)基中的終濃度不高于待測物的最大安全濃度；對照組加入與增殖組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)48?72h后，檢測細(xì)胞活性并計算、分析增殖組相對于對照組的細(xì)胞相對增殖率，當(dāng)細(xì)胞相對增值率不小于80%時，表明該濃度的待測物對細(xì)胞不具有抗增殖效果，得到待測物不具有抗增殖效果的濃度，即為待測物對H印G2細(xì)胞無毒性且不具有抗增殖效果的濃度。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟①中所述的細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度為3.0X 15?5.0X 10 5個/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟①中所述的細(xì)胞生長抑制率通過下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對第二次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測定檢測波長處的吸光值，按照如下公式計算細(xì)胞生長抑制率:C(% ) = (A^A)/A。X 100%;其中，C:細(xì)胞生長抑制率，A。:對照組吸光值，A:毒性組吸光值。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟②中所述的細(xì)胞懸浮液濃度為2.0X 15?4.0X 10 5個/mL。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法，其特征在于: 步驟②中所述的細(xì)胞相對增殖率通過下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對第二次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測定檢測波長處的吸光值，按照如下公式計算細(xì)胞相對增殖率:P(% ) = A/ACX100% ;其中，P:細(xì)胞相對增殖率，A。:對照組吸光值，A:增殖組吸光值。
【專利摘要】本發(fā)明涉及對植物化學(xué)物質(zhì)、護(hù)膚品等化妝品的性能評價方法，具體涉及一種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評價方法。本發(fā)明在沒有毒性和抗增殖的濃度下，評估待測物質(zhì)的抗輻射效果。采用本評估方法，能夠在短期內(nèi)得到待測物質(zhì)是否具有抗紫外輻射活性，評價待測物質(zhì)是否具有抗紫外活性，主要通過用細(xì)胞活性染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，將吸光值換算成細(xì)胞存活率。本發(fā)明的優(yōu)點在于，HepG2細(xì)胞生長周期短，紫外輻射效果迅速作用在細(xì)胞上，實驗周期短，操作簡便。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】CN105002258
【申請?zhí)枴緾N201510401144
【發(fā)明人】郭新波, 賴沁潤, 劉瑞海, 扶雄
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月9日