復(fù)合酶法拆分制備旋光純r－（－）坦索洛新的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于手性化合物制備領(lǐng)域，涉及旋光純坦索洛新的制備方法，特別涉及以 復(fù)合酶催化拆分制備R-（一）坦索洛新的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸坦索洛新（tamsulosinhydrochloride)化學(xué)名稱為（R)_(5) [2-[[2_2_ 氧基 苯氧基]一乙基]氨基]丙基]一 2-甲氧基苯磺酰胺鹽酸鹽，是由日本山之內(nèi)制藥公司 研發(fā)的aIa-腎上腺素受體拮抗劑。1992年7月通過美國FDA批準(zhǔn)，1993年首次在日本 上市，商品名為FLOMAX，1996年在中國上市，商品名為哈樂（HARNAL)，本品可降低前列腺平 滑肌張力，改善因前列腺肥大而引起的排尿障礙，臨床主治良性前列腺增生。
[0003] 坦索洛新屬于手性藥物，它的外消旋體制備方法為已知的方法（CN- 102206176A)，即將4 一甲氧基一 3 -磺酰胺基苯丙酮與甲酸胺在鈀一碳催化下得到關(guān)鍵中 間體5 -（2 -胺基丙基）一 2 -甲氧基苯橫酰胺，再與2 -（2 -乙氧基苯氧基）溴乙燒縮 合反應(yīng)，制備成坦索洛新外消旋體（RS)- 5 - [2 - [[2 - [2 -乙氧基苯氧基]乙基]氨 基]丙基]一2-甲氧苯磺酰胺。
[0004] 目前市場上銷售的坦索洛新外消旋體均以化學(xué)法來完成拆分和消旋。但是化學(xué)拆 分法存在收率低，拆分劑消耗大以及反應(yīng)條件苛刻等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供了復(fù)合酶法拆分制備旋光純R-（一）坦索洛新的 方法，以達(dá)到反應(yīng)條件溫和，選擇性高和收率高的目的。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實現(xiàn)： 坦索洛新的結(jié)構(gòu)式：
坦索洛新的分子式：C20N28N205S 分子量：408. 51 CAS號：106133 - 20 - 4 熔點：226 - 228°C. 坦索洛新的結(jié)構(gòu)式如式I所示，為手性化合物。而作為藥物應(yīng)用的坦索洛新需要得到 旋光純的R-（一）坦索洛新然后進(jìn)一步鹽酸化。
[0007] 因此本發(fā)明提供了一種復(fù)合酶法拆分制備旋光純R-（一）坦索洛新的方法，以坦 索洛新外消旋體為底物，在固定化重組脂肪酶B和重組消旋酶的耦合作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完 成坦索洛新的動態(tài)動力學(xué)拆分，得到旋光純R-（一）坦索洛新。
[0008] 由式I所示，坦索洛新的手性中心為一甲基基團(tuán)，因此本發(fā)明選擇脂肪酶 B(CALB)，消旋酶(海因酶）對其外消旋體的拆分，該酶系具有在疏水性很差的溶劑中仍具有 較高的活性。
[0009] 脂肪酶是一類絲氨酸水解酶通常其活動中心是一個由天冬氨酸一組氨酸一絲氨 酸或組氨酸一絲氨酸一谷氨酸組成的三聯(lián)體，在催化反應(yīng)中絲氨酸的羧基向底物酯類或酰 胺中的羰基碳原子發(fā)起親核進(jìn)攻，形成酶一酰胺中間體，隨后其它親核試劑如水，胺，醇和 過氧化氫等進(jìn)攻酶一酰基中間休，酶將?；D(zhuǎn)移到酰基受體上，而自身復(fù)原又可以重復(fù)這 一過程。
[0010] 脂肪酶的催化活動中心匹配的對映反應(yīng)速度高于不匹配的對映實體，實現(xiàn)對外消 旋體的拆分，在外消旋動力學(xué)拆分的同時，慢反應(yīng)對應(yīng)的對映體在催化劑的作用下持續(xù)外 消旋化，轉(zhuǎn)化為快反應(yīng)對映體，這樣目標(biāo)產(chǎn)物即單一對映體，理論產(chǎn)率可以達(dá)到100%。
[0011] 動態(tài)動力學(xué)拆分（DKR)是底物外消旋化和對映體拆分同時進(jìn)行的過程，底物的一 種對映體連續(xù)外消旋化最終實現(xiàn)構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，這就是成功的進(jìn)行DKR的重要組成部分，然而 底物的外消旋動力學(xué)拆分是各自要特定的反應(yīng)條件的，因此必須考慮平衡這兩方面的因 素。
[0012] 為了解決動力學(xué)拆分最大的理論產(chǎn)率問題，需要在動力學(xué)拆分方法中增加一個未 知反應(yīng)的對映體的循環(huán)過程，主要的方法有分離，對映體的消旋重復(fù)拆分，但是分離只是簡 單的針對反應(yīng)過的對映體，而沒有充分利用底物，只能縮短反應(yīng)時間，最大理論產(chǎn)率仍然沒 有改變。由于脂肪酶只能針對一種特定的對映體反應(yīng)，不能與另一構(gòu)象的對映體反應(yīng)，不能 改變最大產(chǎn)率只有50%的缺陷。
[0013] 金屬一酶配伍的DKR是近10年來取得很大進(jìn)展，其中主要是過渡金屬配合物與脂 肪酶B配伍為主。過渡金屬的外消旋有兩種方式，1是通過氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)來實現(xiàn)外消旋，2是 通過形成一烯丙基來產(chǎn)生外消旋化作用，其中銠，鈀，釕的配合物顯示出良好的外消旋 催化性能，其理論產(chǎn)率可達(dá)100%，但是，過渡金屬的價格貴，而且含有殘留物。
[0014] 而本發(fā)明選擇用消旋酶取代過渡金屬，價格低，無殘留，收率高。消旋酶的種類繁 多，目前主要用于氨基酸的改型即DL的轉(zhuǎn)型上。
[0015] 作為本發(fā)明的一種實施方式，選擇脂肪酶為南極假絲酵母 產(chǎn)的脂肪酶13(041^)，消旋酶為惡臭假單胞菌（/5616^〇^?〇/?(36 1/^2^/(3)產(chǎn)的海因酶。
[0016] 而南極假絲酵母菌和惡臭假單胞菌均可為市售可得。
[0017] 脂肪可分順式和反式兩種分子結(jié)構(gòu)，而能兼顧二者的脂肪酶同時對水溶液和非水 溶液都的很強(qiáng)的催化作用的屬南極假絲酵母產(chǎn)的脂肪酶B(CALB)。
[0018] 消旋酶為惡臭假單胞菌產(chǎn)的海因酶（hycjan〇inaSe，EC3. 5. 2. 2)，目前海因酶主 要用于生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸，尚未有用于生產(chǎn)坦索洛新類化學(xué)物的報道。
[0019] 南極假絲酵母產(chǎn)的脂肪酶B和有惡臭的假單胞菌產(chǎn)的海因酶，產(chǎn)酶菌均為野生 菌，它們的酶表達(dá)量均較低，產(chǎn)酶活低和產(chǎn)酶量亦低，不適宜直接用于產(chǎn)業(yè)化。因此為提高 其酶表達(dá)量和酶活，分別將南極假絲酵母脂肪酶B基因組和惡臭假單胞菌海因酶基因組重 組整合到畢赤酵母（/3ZcAia 中表達(dá)。
[0020] 畢赤酵母作為真核異源蛋白的宿主菌，易于遺傳操作，還具有以下優(yōu)勢：1。以甲醇 為碳源，其表達(dá)載體含特有的乙醇氧化酶AOXl基因啟動子，能通過甲醇誘導(dǎo)AOXl調(diào)控外源 基因表達(dá)。2。高效表達(dá)，畢赤酵母生長快，能表達(dá)很高的細(xì)胞濃度，外源蛋白表達(dá)可達(dá)細(xì)胞 總蛋白的5 - 40%。3。適于表達(dá)胞內(nèi)或胞外外源蛋白。4。高穩(wěn)定性，插入的外源基因不 存在自主復(fù)制的表達(dá)載體中是和表達(dá)載體一起整合到酵母染色體上，隨染色體一起復(fù)制和 遺傳，避免了外源基因的丟失現(xiàn)象。5。畢赤酵母能對所分泌的蛋白進(jìn)行N- 0-糖其化修 飾，且糖基化程度適中。6。適應(yīng)性強(qiáng)，易于處理，可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長。7。 可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的修飾。8?？蓪ν庠椿虻亩嗫截?。
[0021] 因此本發(fā)明選擇畢赤酵母來表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B和惡臭假單胞菌海因酶 基因。
[0022] 此外，基因劑量對外源目的蛋白表達(dá)有重要影響，一個拷貝的外源蛋白表達(dá)盒足 夠外源蛋白的高表達(dá)，增加拷貝數(shù)既有正效應(yīng)也有負(fù)效應(yīng)，各自影響機(jī)理不同，要提高拷貝 數(shù)既起正效應(yīng)作用，因隨基因劑量增大，會增加外源蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平，外源蛋白的產(chǎn)生要 經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，翻譯執(zhí)疊，糖基化與分泌等步驟，而且需要細(xì)胞能量的供給，不可少一個步驟，它 會因"菌株一表型一外源蛋白"的特定組合以及細(xì)胞不同的生理狀態(tài)而異。
[0023]本發(fā)明選用的外源基因表達(dá)的畢赤酵母由Invitrogen公司提供的試劑盒構(gòu)建， 轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞表達(dá)載體均能在大腸桿菌埃希氏菌GSl15表達(dá)，分泌型載體所含有的信號肽 有：pPICZX和pPIC9K的a-pact的序列。因為畢赤酵母中沒有穩(wěn)定的天然質(zhì)粒，所以攜 帶外源基因的重組載體必須整合到酵母染色體才能實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。整合方式有單交 換和雙交換兩種，單交換整個更具強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。
[0024]為了簡單快速獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化分子，要進(jìn)行目的基因高拷貝克隆的篩選，因此 就需要在載體上引入抗體基因，如抗G418(Kanamycin)的基因，就可以通過提高G418的 濃度來選高拷貝表達(dá)克隆。
[0025]也可通過篩選標(biāo)準(zhǔn)化來達(dá)到高拷貝轉(zhuǎn)化子的外源基因拷貝數(shù)，S卩：多拷貝單元，可 以通過整合時的重復(fù)發(fā)生得以實現(xiàn)發(fā)生頻率通常為5 - 10%，為了篩選出高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子， 可以采取菌落雜交(或打印跡雜交）或增加抗生素濃度(如G418)等方法來進(jìn)行。
[0026]增加外源基因拷貝數(shù)，會增加外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，但外源基因蛋白的產(chǎn)生要經(jīng) 過轉(zhuǎn)錄翻譯、折疊、糖基化分泌等步驟，缺一不可。
[0027] 若蛋白質(zhì)分子量在60Kda以上，則采用mu+sHis基因型，若蛋白質(zhì)分子量在20Kda 以下，則采用mu+His基因型，啟動子有多種組成型：有3 -磷酸甘油醛脫氫酶FLDl啟動 子，PFLDl還有PEX8啟動子(屬于弱啟動子)，因為啟動子是基因表達(dá)的關(guān)鍵元件，直接關(guān)系 到表達(dá)水平。最常用的啟動子AOXl僅受甲醇誘導(dǎo)，但此啟動子不適用于食品工業(yè)，因大量 甲醇的存在有火災(zāi)隱患?？梢赃x用不以甲醇為唯一誘導(dǎo)物的PGAP/PFLD/PDAS和PADX2， 還例如從畢赤酵母基因組文庫中克隆到一個新的3-磷酸甘油脫氫酶基因（GAP)的啟動子 PGAP/可在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸誘導(dǎo)下表達(dá)。
[0028]信號肽序列： 表達(dá)蛋白的分泌需要信號肽引導(dǎo)并沿一定途經(jīng)才能分泌至細(xì)胞外，畢赤酵母一般利用 兩種來源信號肽序列，一是外源基因本身攜帶的信號肽序列，但酵母表達(dá)系統(tǒng)不能完全利 用外源蛋