一種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)植物化學(xué)物質(zhì)、護(hù)膚品等化妝品的性能評(píng)價(jià)方法，具體涉及一種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日常生活中，人類無(wú)時(shí)無(wú)刻不在收到紫外輻射的傷害，任何發(fā)熱物體當(dāng)溫度高達(dá)1000°C?2000 °C時(shí)就能發(fā)射紫外線。根據(jù)紫外輻射波長(zhǎng)不同，將其分為三個(gè)波段:UVA (320nm ?400nm)，UVB (275nm ?320nm)，UVC (230nm ?275nm)。紫外線根據(jù)能量和波長(zhǎng)的不同能夠引起人表皮不同程度的急性或延遲反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和活性氧(ROS)，造成DNA損壞和突變。UVC做為短波紫外線，能量高其輻射可以直接導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)損傷而造成細(xì)胞凋亡。同時(shí)作為短波，UVC的穿透能力很弱，因此太陽(yáng)光傳到地面的輻射以UVA和UVB為主，但由于大氣層空洞，地面上UVC水平已經(jīng)比早年高出很多。同時(shí)人體皮膚長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，來(lái)自生產(chǎn)環(huán)境中的紫外輻射也影響著人體的健康。目前，有許多研究報(bào)道一些植物化學(xué)物質(zhì)具有極好的抗氧化效果，一些化學(xué)物質(zhì)甚至被應(yīng)用在防曬霜等一系列護(hù)膚品中。但是抗氧化活性高的物質(zhì)是否其抗紫外效果也很好，還有待驗(yàn)證。鑒于此，我們需要通過(guò)某種技術(shù)來(lái)評(píng)估抗紫外輻射效果。同時(shí)紫外輻射造成的是細(xì)胞損傷，需要一種更加可靠的細(xì)胞模型來(lái)評(píng)估物質(zhì)的抗紫外輻射活性。
[0003]傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)抗紫外輻射能力的方法，一般是用動(dòng)物模型，通過(guò)藥物注射或者涂抹在動(dòng)物表皮，這種方法直接，但周期長(zhǎng)，時(shí)效性差。而細(xì)胞培養(yǎng)周期短，見(jiàn)效快，直接可以評(píng)估待測(cè)物質(zhì)是否可以穿過(guò)細(xì)胞膜，作用在被輻射細(xì)胞上，減少細(xì)胞衰亡。測(cè)定細(xì)胞存活率的亞甲基藍(lán)染色法，操作簡(jiǎn)便，顯色清晰。據(jù)申請(qǐng)人所知，目前尚無(wú)細(xì)胞水平上的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法，包含如下步驟:
[0008](I)將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)4?8h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、紫外對(duì)照組和紫外組，其中，紫外組加入含有待測(cè)物的培養(yǎng)基，對(duì)照組和紫外對(duì)照組加入與紫外組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)20?30h后，用紫外線UVC輻照紫外對(duì)照組和紫外組細(xì)胞，對(duì)照組不進(jìn)行任何輻照；當(dāng)紫外對(duì)照組細(xì)胞死亡率為40%?60%時(shí)，結(jié)束紫外線UVC輻照并用PBS清洗三組細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，第三次培養(yǎng)20?30h，其中，所述的待測(cè)物在培養(yǎng)基中的終濃度為A，為待測(cè)物對(duì)IfepG2細(xì)胞無(wú)毒性且不具有抗增殖效果的濃度；
[0009](2)檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算、分析紫外組相對(duì)于紫外對(duì)照組的相對(duì)細(xì)胞存活率，如果相對(duì)細(xì)胞存活率> 100%，則終濃度為A的待測(cè)物具有抗紫外輻射能力，如果相對(duì)細(xì)胞存活率=100%，則終濃度為A的待測(cè)物不具有抗紫外輻射能力；如果相對(duì)細(xì)胞存活率< 100%，則終濃度為A的待測(cè)物具有抗增殖效果；
[0010]所述的基于細(xì)胞水平的抗紫外輻射評(píng)價(jià)方法，還包含如下步驟:
[0011](3)采用細(xì)胞活性染料對(duì)步驟(I)第三次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)處的OD值，按照如下公式計(jì)算紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比:R(%) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外組保護(hù)細(xì)胞未受損傷百分比；Ad:紫外組吸光值；AU:紫外對(duì)照組吸光值；A:對(duì)照組吸光值；然后結(jié)合CalcuSyn軟件計(jì)算細(xì)胞修復(fù)EC50值；
[0012]步驟⑴中所述的細(xì)胞懸浮液濃度為3.0X105?5.0X10 5個(gè)/mL;優(yōu)選為4.0 X 15個(gè) /mL ；
[0013]步驟(I)中所述的首次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為4h，第二次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為24h ;第三次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為24h ;
[0014]步驟(I)中所述的紫外線UVC波長(zhǎng)為230nm?275nm ；
[0015]步驟⑴中所述的紫外線UVC輻照的時(shí)間優(yōu)選為2?5min ;
[0016]步驟(I)中所述的紫外線UVC輻照時(shí)能量均勻，能量為500000?1000000 μ J/cm2；
[0017]步驟⑵中所述的相對(duì)細(xì)胞存活率優(yōu)選通過(guò)下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對(duì)步驟(I)第三次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)處的OD值，按照如下公式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率:V(% ) = Ad/AuX100% ;其中，V:相對(duì)細(xì)胞存活率，Ad:紫外組吸光值，A u:紫外對(duì)照組吸光值；
[0018]步驟(I)中所述的待測(cè)物對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性且不具有抗增殖效果的濃度通過(guò)如下步驟獲得:
[0019]①將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)20?30h后吸出培養(yǎng)基，加入PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對(duì)照組和毒性組，其中，毒性組加入含有不同濃度待測(cè)物的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入與毒性組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)20?30h后，檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算、分析毒性組相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率不大于20%時(shí)，表明該濃度的待測(cè)物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，得到待測(cè)物的安全濃度；
[0020]②將H印G2細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸浮液，首次培養(yǎng)4?8h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗；然后將細(xì)胞分為對(duì)照組和增殖組，其中，增殖組加入含有不同濃度待測(cè)物的培養(yǎng)基，待測(cè)物在培養(yǎng)基中的終濃度不高于待測(cè)物的最大安全濃度；對(duì)照組加入與增殖組等體積的培養(yǎng)基，第二次培養(yǎng)48?72h后，檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算、分析增殖組相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞相對(duì)增殖率，當(dāng)細(xì)胞相對(duì)增值率不小于80%時(shí)，表明該濃度的待測(cè)物對(duì)細(xì)胞不具有抗增殖效果，得到待測(cè)物不具有抗增殖效果的濃度，即為待測(cè)物對(duì)IfepG2細(xì)胞無(wú)毒性且不具有抗增殖效果的濃度；增殖實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)待測(cè)物在一定濃度范圍是否有抗增殖的效果，是否會(huì)影響其抗輻射效果檢測(cè)；
[0021]步驟①中所述的細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度為3.0X 15?5.0X 10 5個(gè)/mL ;優(yōu)選為4.0 X 15個(gè) /mL ；
[0022]步驟①中所述的首次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為24h，第二次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為24h ;
[0023]步驟①中所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率優(yōu)選通過(guò)下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對(duì)第二次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光值，按照如下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:C(% ) = (Ac-A)/AcX 100% ;其中，C:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，A。:對(duì)照組吸光值，A:毒性組吸光值；
[0024]步驟②中所述的細(xì)胞懸浮液濃度為2.0X 15?4.0X 10 5個(gè)/mL ;優(yōu)選為2.4 X 10 5個(gè)/mL ;
[0025]步驟(2)中所述的首次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為4h ;第二次培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為72h ;
[0026]步驟②中所述的細(xì)胞相對(duì)增殖率優(yōu)選通過(guò)下述步驟得到:采用細(xì)胞活性染料對(duì)第二次培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光值，按照如下公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率:P(% ) = A/ACX100% ;其中，P:細(xì)胞相對(duì)增殖率，A。:對(duì)照組吸光值，A:增殖組吸光值；
[0027]所述的培養(yǎng)基為WME培養(yǎng)基，含有體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清、1mM Hepes,2mML-谷氨酰胺、5mg/mL胰島素、0.05mg/mL氫化可的松、50units/mL青霉素、5Omg/mL鏈霉素和100mg/mL慶大霉素；
[0028]本發(fā)明的原理:經(jīng)過(guò)紫外輻照過(guò)的!fepG2細(xì)胞，在正常情況下培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)死亡，且細(xì)胞死亡率與紫外輻照的能量大小成正比，加入一定待測(cè)物的培養(yǎng)基，如果有抗輻射活性，則對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用細(xì)胞存活率升高；如果沒(méi)有抗輻射活性，細(xì)胞則同輻照對(duì)照組細(xì)胞存活率相當(dāng)；如果待測(cè)物具有抗增殖效果，甚至出現(xiàn)輻照加藥組細(xì)胞存活率小于輻照對(duì)照組。
[0029]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0030]本發(fā)明評(píng)估待測(cè)物質(zhì)是否具有抗紫外活性要經(jīng)過(guò)三種方法來(lái)確定，第一，該濃度下對(duì)H印G2無(wú)毒性；第二，該濃度下對(duì)H印G2是否有增殖效果；第三，該濃度下是否保護(hù)HepG2不受紫外輻照影響。采用本評(píng)估方法，能夠在短期內(nèi)得到待測(cè)物質(zhì)是否具有抗紫外輻射活性，評(píng)價(jià)待測(cè)物質(zhì)是否具有抗紫外活性，主要通過(guò)用亞甲基藍(lán)染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，將吸光值換算成細(xì)胞存活率。其準(zhǔn)確性，快速性是現(xiàn)有評(píng)價(jià)方法沒(méi)有辦法比擬的，可廣泛應(yīng)用于各種護(hù)膚品、護(hù)理品和各種活性物質(zhì)活性評(píng)估。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1是未受紫外輻射的正常HepG2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0032]圖2是受到紫外輻射但沒(méi)有藥物保護(hù)的對(duì)照組HepG2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0033]圖3是受到紫外輻射但有終濃度為lOOmg/mL的木立蘆薈皮提取液保護(hù)的紫外組HepG2細(xì)胞形態(tài)圖。
[0034]圖4是不同濃度木立蘆薈皮提取物處理后的HepG2細(xì)胞的毒性和抗增殖的結(jié)果分析圖。
[0035]圖5是經(jīng)過(guò)紫外輻射后，紫外對(duì)照組和不同濃度木立蘆薈皮提取物處理后的紫外組HepG2細(xì)胞存活率的結(jié)果分析圖。
[0036]圖6是不同濃度開(kāi)普蘆薈凝膠提取物處理后的HepG2細(xì)胞的毒性和抗增殖的結(jié)果分析圖。
[0037]圖7是經(jīng)過(guò)紫外輻射后，紫外對(duì)照組和不同濃度開(kāi)普蘆薈凝膠提取物處理后的紫外組HepG2細(xì)胞存活率的結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】