，其中；-
[0247]連施例1
[0248] 化學(xué)品和酶
[0249] 所有的化學(xué)品是分析級的并且從SigmaA1化ich獲得。在文獻中報道的編碼各種 BVM0酶的基因被在融合至用于輔因子再生的熱穩(wěn)定的亞磯酸脫氨酶（PTDH，EC1. 20. 1. 1) 的N-末端的大腸桿菌中獲得和表達。宿主大腸桿菌細胞然后通過聲處理被溶化W獲得裂 解的細胞部分，并且經(jīng)受離屯、W除去細胞碎片并且獲得澄清的細胞提取物。見如在化ebel 等人的'ExpandingthesetofrhodococcalBaeyerVilligerMonooxygenasesby highthroughputcloning,expressionandsubstratescreening'，Appl.Microbiol. Biottechnol(2011)中描述的方法。
[0巧日]生物催化方案
[0巧1] 轉(zhuǎn)化被在15mlPyrex管中進行。反應(yīng)體積（1ml)含有5mM甲基異丙締基酬， 5uM'還原FAD'，和5uM含有相關(guān)的BVM0的澄清的細胞提取物，在50mMTris-肥1中，pH 7. 5?；旌衔锉辉?4°C在回轉(zhuǎn)式振蕩（orbitalshaking) (200巧m)下解育持續(xù)22小時。為 了確定轉(zhuǎn)化，1ml反應(yīng)體積使用含有作為內(nèi)標(biāo)物的0. 1%均S甲苯（1，3, 5-S甲基苯）的 0. 5ml1-辛醇被萃取。樣品通過禍旋持續(xù)Imin隨后是離屯、步驟巧00化pm)持續(xù)lOmin而 被萃取。有機層被移除，使用M拆〇4干燥并且放置在氣相色譜（GC)小瓶中。GC分析在裝配 有Heliflex⑩AT?-5 柱的ShimadzuGC儀器（GraceDiscoveiySciences)上發(fā)生。W下 的溫度分布被用于分離該組分：在40°C下6min，隨后是W20°C每分鐘增加至250°C。不使 用酶并且使用變化的量的底物（甲基異丙締基酬）和產(chǎn)物（甲基丙締酸甲醋、己酸異丙締 醋）的空白反應(yīng)被在相同的條件下實施并且被用于準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物識別和測定的校 準(zhǔn)曲線。 悅巧 GC分析 悅5引 W下的表1詳細描述通過GC在使用1-辛醇+0.1%均S甲苯從50mMTris-肥1， pH7.5 (AT-5柱，5mM所有的化合物）中萃取之后所生產(chǎn)的化合物的百分數(shù)。所有的S個化 合物（1個底物和2個產(chǎn)物）可W通過GC被可靠地分離。 悅54] 表1
[0巧5]
[0巧引表1示出了發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BVM0酶起作用W產(chǎn)生在底物甲基異丙締基酬上的反 常的氧插入W給出1%甲基丙締酸甲醋產(chǎn)物的產(chǎn)率，并且此外其是在排除了被預(yù)期的正常 的產(chǎn)物己酸異丙締醋下如此進行的。本實施例中的BVM0酶是環(huán)己酬單加氧酶（CHM0)登記 號碼ro06679,其被有機體化odococcusjostiiRHA1天然地生產(chǎn)。
[0257] 把注意力指向被與本說明書同時地或在本說明書之前提交的與本申請有關(guān)的并 且向?qū)Ρ菊f明書的公眾查閱開放的所有的論文和文獻，并且所有的該樣的論文和文獻的內(nèi) 容通過引用并入本文。
[0巧引在本說明書（包括任何伴隨的權(quán)利要求、摘要和附圖）中公開的所有的特征、和/ 或如此公開的任何方法或工藝的所有的步驟可W被在任何組合中組合，除了在其中該樣的 特征和/或步驟中的至少某些是相互地排他性的組合。
[0259]在本說明書（包括任何伴隨的權(quán)利要求、摘要和附圖）中公開的每個特征可W被 用于同一個、等效的或相似的目的的可選擇的特征代替，除非明確地另有聲明。因此，除非 明確地另有聲明，每個所公開的特征僅是等效的或相似的特征的通用的系列的一個實例。 [0%0] 本發(fā)明不限于上文的實施方案的細節(jié)。本發(fā)明擴展至在本說明書（包括任何伴隨 的權(quán)利要求、摘要和附圖）中公開的特征中的任何新穎的特征或任何新穎的組合或擴展至 所公開的任何方法或工藝的步驟中的任何新穎的步驟或任何新穎的組合。
【主權(quán)項】
1. 一種生產(chǎn)甲基丙烯酸烷基酯的工藝，包括以下步驟： (ii)使用Baeyer-Villiger單加氧酶把烷基異丙烯基酮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的甲基丙稀酸燒 基醋。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述烷基異丙烯基酮向所述相應(yīng)的甲基丙烯酸烷 基醋的所述轉(zhuǎn)化是通過使用Baeyer-Villiger單加氧酶的反常氧化。3. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述烷基異丙烯基酮是甲基異丙烯基酮或 乙基異丙烯基酮，優(yōu)選地，甲基異丙烯基酮，并且所生產(chǎn)的所述甲基丙烯酸烷基酯分別地是 甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸乙酯，優(yōu)選地，甲基丙烯酸甲酯。4. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是野生型 酶或被修飾的酶。5. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是野生型 酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是被 修飾的酶。7. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，還包括從原始進料形成烷基異丙烯基酮的步 驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工藝，還包括進行一個或更多個化學(xué)的、生物化學(xué)的或生物 的轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)所述原始進料的步驟。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8中任一項所述的工藝，其中所述原始進料包括2- 丁酮、甲基異 丙基酮、3-戊酮、乙基異丙基酮和甲醛或其衍生物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的工藝，其中所述被修飾的Baeyer-Vi 11 i ger單加氧酶在所述 烷基異丙烯基酮的氧化性轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)甲基丙烯酸烷基酯中與所述野生型的具有同樣的活 性和/或選擇性。11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的工藝，其中可以是所述野生型的所 述Baeyer-Villiger單加氧酶來源于任選地選自以下的細菌屬的細菌：不動桿菌 屬（Acinetobacter)、紅球菌屬（Rhodococcus)、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)、短單胞 菌屬（Brachymonas)、諾卡氏菌屬（Nocardia)、外瓶霉屬（Exophiala)、短桿菌屬 (Brevibacterium)、戈登氏菌屬（Gordonia)、新鞘氨醇菌屬（Novosphingobium)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、喜熱裂孢菌屬（Thermobifida)、黃色桿菌屬（Xanthobacter)、分枝桿菌 屬（Mycobacterium)、叢毛單胞菌屬（Comamonas)、喜熱裂抱菌屬（Thermobifida)和假單胞 菌屬（Pseudomonas) 〇12. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的工藝，其中可以是所述野生型的所 述Baeyer-Villiger單加氧酶來源于任選地選自以下的真菌屬的真菌：赤霉屬 (Gibberella)、曲霉屬（Aspergillus)、Maganporthe、柱抱屬（Cylindrocarpon)、彎抱 屬（Curvularia)、內(nèi)臍懦孢屬（Drechslera)、酵母屬（Saccharomyces)、假絲酵母屬 (Candida)、小克銀漢霉屬（Cunninghamella)、柱孢屬（Cylindrocarpon)、和裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces) 〇13. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的工藝，其中可以是所述野生型的所述 Baeyer-Villiger單加氧酶來源于古菌。14. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是I型、 II型或O型Baeyer-Villiger單加氧酶。15. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是選自 以下的酶組中的一種的I型Baeyer-Villiger單加氧酶：環(huán)己酮一氧化物酶、4-羥基苯乙 酮單加氧酶、環(huán)十五酮單加氧酶或丙酮一氧化物酶。16. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧 酶選自：選自以下的酶組中的一種的I型Baeyer-Villiger單加氧酶：環(huán)己酮單加 氧酶（CHMO)EC 號 1. 14. 13. 22 (GenBank :BAA86293. 1);苯基丙酮單加氧酶（PAMO) EC 號 1. 14. 13. 92(Swiss-Prot :Q47PU3) ;4_ 羥基苯乙酮單加氧酶（HAPMO)EC 號 1. 14. 13. 84(GenBank :AAK54073. 1);丙酮單加氧酶（ACMO) (GenBank :BAF43791. 1);甲 基酮單加氧酶（MEKA) (GenBank :ABI 15711. 1);環(huán)十五酮單加氧酶（CPDMO) (GenBank : BAE93346. 1);環(huán)戊酮單加氧酶（CPMO) (GenBank :BAC22652. 1);和類固醇單加氧酶（STMO) (GenBank :BAA24454. 1) 〇17. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶是環(huán)己 酮一氧化物酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶、環(huán)十五酮單加氧酶或丙酮一氧化物酶，其可以任選 地選自以下的酶中的一種：來自醋酸1?不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus)NCIMB 9871的環(huán)己酮單加氧酶、來自黃黃色桿菌（Xanthobacter flavus)的環(huán)己酮單加氧酶 (GenBank :CAD10801. 1)、來自紅球菌 Rhodococcus sp. HI-31 的環(huán)己酮單加氧酶（GenBank : BAH56677. 1)、來自 Rhodococcus jostii RHAl 的環(huán)己酬單加氧酶、來自 Brachymonas petroleovorans的環(huán)己酬一氧化物酶（GenBank :AAR99068. 1)、4_羥基苯乙酬單加氧 酶（Q93TJ5. 1)、環(huán)十五酮單加氧酶（GenBank :BAE93346. 1)、或來自戈登氏菌Gordonia sp. TY-5 的丙酮單加氧酶（Genbank :BAF43791. 1)。18. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶在上述 工藝的反應(yīng)混合物中作為無細胞提取物或合成酶存在。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的工藝，其中在所述反應(yīng)混合物中存在的烷基異丙烯基酮底 物的濃度是在約l〇g/L至200g/L之間。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的工藝，其中在所述反應(yīng)混合物中存在的烷基異丙烯基 酮底物的濃度是以重量計所述反應(yīng)混合物的至少約10%。21. 根據(jù)權(quán)利要求1至17所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶在所述反 應(yīng)混合物中在宿主有機體細胞內(nèi)存在。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的工藝，其中在上述反應(yīng)混合物中存在的烷基異丙烯基酮底 物的濃度小于對宿主細胞有毒的濃度極限。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的工藝，其中在上述反應(yīng)混合物中存在的烷基異丙烯基酮底 物的濃度是在約0. 2g/L至50g/L之間。24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23中任一項所述的工藝，其中在上述反應(yīng)混合物中存在的烷基 異丙烯基酮底物的濃度是以重量計所述反應(yīng)混合物的至少約1%。25. 根據(jù)權(quán)利要求21至24中任一項所述的工藝，其中在所述反應(yīng)混合物中存在的宿主 細胞的濃度在約lg/L至100g/L之間。26. 根據(jù)權(quán)利要求21至25所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶在宿主細 菌細胞內(nèi)或可選擇地宿主真菌細胞內(nèi)或可選擇地古菌細胞內(nèi)存在。27. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中原位產(chǎn)物移除系統(tǒng)在所述反應(yīng)過程中與 底物供入策略共同地實施。28. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中通過所述Baeyer-Villiger -氧化物酶 的甲基丙烯酸烷基酯：異丙烯基酯生產(chǎn)的比率是至少1:5。29. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger -氧化物酶以至 少1%選擇性的絕對水平把所述烷基異丙烯基酮轉(zhuǎn)化為所述甲基丙烯酸烷基酯。30. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的工藝，其中所述Baeyer-Villiger單加氧酶以至少 20 %的相對水平把所述烷基異丙烯基酮轉(zhuǎn)化為所述甲基丙烯酸烷基酯。31. -種制備甲基丙烯酸烷基酯的聚合物或共聚物的方法，包括以下步驟： (iii) 根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項制備甲基丙烯酸烷基酯； (iv) 任選地，酯交換所述甲基丙烯酸烷基酯以生產(chǎn)已酯交換的甲基丙烯酸烷基酯； (ii)使在（i)或（ii)中被制備的所述甲基丙烯酸烷基酯或所述已酯交換的甲基丙烯 酸烷基酯聚合，任選地連同一種或更多種共聚單體，以生產(chǎn)其聚合物或共聚物。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述甲基丙烯酸烷基酯選自甲基丙烯酸甲酯或 甲基丙烯酸乙酯。33. 根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述已酯交換的甲基丙烯酸烷基酯從所述 甲基丙烯酸烷基酯通過與合適的醇的酯交換被制備。34. 根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項所述的方法，其中所述已酯交換的甲基丙烯酸烷基 酯選自甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基 丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸環(huán)己酯、甲基丙烯酸異冰片酯、甲基丙 烯酸2-羥基乙酯和甲基丙烯酸羥丙基乙酯、甲基丙烯酸苯氧基乙酯、甲基丙烯酸十六酯。35. 根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中所述醇選自C3-C18醇，其可以是線性的或 支鏈的、脂肪族的、芳香族的、環(huán)狀的或部分環(huán)狀的或部分芳香族的并且任選地被羥基、鹵 代、環(huán)氧或氨基基團取代和/或被雜原子中斷。36. 根據(jù)權(quán)利要求31至35中任一項所述的方法，其中所述共聚單體選自單烯鍵式不飽 和的羧酸和二羧酸和它們的衍生物。37. -種聚甲基丙烯酸烷基酯均聚物或共聚物，從根據(jù)權(quán)利要求31至36中任一項所述 的方法被形成。
【專利摘要】用于甲基丙烯酸烷基酯特別是甲基丙烯酸甲酯的生產(chǎn)的工藝被提供，在其中Baeyer-Villiger單加氧酶被用于通過反常的不對稱的氧插入把烷基異丙烯基酮底物轉(zhuǎn)化為相關(guān)的甲基丙烯酸烷基酯。本發(fā)明向關(guān)鍵的工業(yè)單體，特別是用于聚合物例如聚甲基丙烯酸甲酯的生成的工業(yè)單體提供基于生物的路線。
【IPC分類】C12P7/62, C07C67/42
【公開號】CN104995168
【申請?zhí)枴緾N201380073392
【發(fā)明人】格雷厄姆·羅納德·伊斯特漢, 大衛(wèi)·威廉·約翰遜, 馬克·威廉默斯·弗拉杰, 雷姆科·特斯基比·溫特
【申請人】璐彩特國際英國有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2013年12月20日
【公告號】CA2895644A1, EP2935196A1, US20150299743, WO2014096850A1