一種11α-羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種11 α -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧黃 體酮的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮全稱16 α，17 α -環(huán)氧-孕甾-4-烯-3, 20-二酮，俗稱沃 氏氧化物，其C11-α -羥化物是激素藥物生產(chǎn)中重要中間體。目前國(guó)內(nèi)16 α，17 α -環(huán)氧黃 體酮的C11- α -羥化物主要利用黑根霉進(jìn)行微生物羥化來(lái)完成，產(chǎn)率一般在45%_75%之間， 且底物投料濃度低（lg/L)，發(fā)酵條件及操作要求較高，副產(chǎn)物種類較多。
[0003] 以下為16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮的Cn- α -羥化反應(yīng)式：
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的，在于提供一種11 α -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法， 利用赭曲霉進(jìn)行微生物羥化，采用流加的方法增加底物投量，提高16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮 C11- α -羥化的轉(zhuǎn)化率，且底物溶劑可以回收循環(huán)利用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種11 α -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，所述方法通過(guò)發(fā)酵赭曲霉、 羥化16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮得到16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮C11- α -羥化物。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵赭曲霉為二級(jí)發(fā)酵，所述一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵的培養(yǎng)基均 為葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0. 2%、泡敵0. 02%配制而成的，均在121°C滅菌 30min〇
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，所述16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮Cll-α -羥化物是在二級(jí)發(fā)酵罐中流加 入底物16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮經(jīng)羥化得到的。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，所述底物16α，17α-環(huán)氧黃體酮1%與Ν，Ν-二甲基甲酰胺2%、吐 溫-800. 3%混合加熱至130°C溶清，流加入二級(jí)發(fā)酵罐。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，流加時(shí)間59~86h，維持發(fā)酵pH6. 0~7. 0,轉(zhuǎn)速200rpm。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，所述赭曲霉的一級(jí)發(fā)酵為初始pH5.0,溫度為28°C時(shí)接入赭曲霉種 子，維持罐壓0. 04~0. 06MP，培養(yǎng)12h。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述赭曲霉種子是由赭曲霉菌接種到小米培養(yǎng)基中獲得的，于27°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天，接種前用無(wú)菌水洗脫。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，所述赭曲霉的二級(jí)發(fā)酵為初始pH5. 0,溫度為28°C時(shí)，以10%的接種 量移入一級(jí)發(fā)酵的種子液，維持罐壓〇. 04~0. 06MP，發(fā)酵4~10h，進(jìn)行底物流加。
[0015] 采用本發(fā)明的發(fā)酵工藝，其底物轉(zhuǎn)化90%以上。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供的工藝方法提高了底物投量及轉(zhuǎn)化率，且底物 溶劑可以回收循環(huán)利用，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的Ila-羥基-16 α，17 α-環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法作 進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 本發(fā)明所述的赭曲霉，購(gòu)自中科院北京微生物研究所，菌號(hào)CGMCC3. 06281。
[0019] 實(shí)施例1 :
[0020] 步驟1、制備斜面種子：將赭曲霉菌株接入滅菌好的小米培養(yǎng)基，于27°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)8天，接種前用無(wú)菌水洗脫；
[0021] 步驟2、一級(jí)種子發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0.2%、泡敵 0. 02%配制一級(jí)種子培養(yǎng)基3L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0時(shí)接入步驟1中 的斜面種子，培養(yǎng)12h;
[0022] 步驟3、發(fā)酵罐發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0. 2%、泡敵0. 02% 配制二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基l〇L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，以10% 接種量移入步驟2的一級(jí)種子，培養(yǎng)6h，菌量達(dá)40%~50% ;
[0023] 步驟4、底物流加：將16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮l〇〇g、N，N-二甲基甲酰胺200g、吐 溫-8030g混合加熱至130°C溶清后，流加入發(fā)酵液中，維持pH6. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，流加59h， 16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率為90. 4%。
[0024] 實(shí)施例2 :
[0025] 步驟1、制備斜面種子：將赭曲霉菌株接入滅菌好的小米培養(yǎng)基，于27°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)8天，接種前用無(wú)菌水洗脫；
[0026] 步驟2、一級(jí)種子發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0. 2%、泡敵 0. 02%配制一級(jí)種子培養(yǎng)基3L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0時(shí)接入步驟1中 的斜面種子，培養(yǎng)12h;
[0027] 步驟3、發(fā)酵罐發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0. 2%、泡敵0. 02% 配制二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基18L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，以10% 接種量移入步驟2的一級(jí)種子，培養(yǎng)4h，菌量達(dá)20%左右；
[0028] 步驟4、底物流加：將16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮180g、N，N-二甲基甲酰胺360g、吐 溫-8054g混合加熱至130°C溶清后，流加入發(fā)酵液中，維持pH6. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，流加78h， 16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率為90. 72%。
[0029] 實(shí)施例3 :
[0030] 步驟1、制備斜面種子：將赭曲霉菌株接入滅菌好的小米培養(yǎng)基，于27°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)8天，接種前用無(wú)菌水洗脫；
[0031] 步驟2、一級(jí)種子發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0.2%、泡敵 0. 02%配制一級(jí)種子培養(yǎng)基3L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0時(shí)接入步驟1中 培養(yǎng)好的斜面種子，培養(yǎng)12h ;
[0032] 步驟3、發(fā)酵罐發(fā)酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸銨0. 2%、泡敵0. 02% 配制二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基18L，121°C滅菌30min，降溫至28°C，初始pH5. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，以10% 接種量移入步驟2的一級(jí)種子，培養(yǎng)10h，菌量達(dá)40%~50% ;
[0033] 步驟4、底物流加：將16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮180g、N，N-二甲基甲酰胺360g、吐 溫-8054g混合加熱至130°C溶清后，流加入發(fā)酵液中，維持pH7. 0,轉(zhuǎn)速200rpm，流加86h， 16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率為91. 14%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種11 a -羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法通過(guò)發(fā) 酵赭曲霉、羥化16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮得到16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮C11- a -羥化物。2. 如權(quán)利要求1所述的11 a _羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述發(fā)酵赭曲霉為二級(jí)發(fā)酵。3. 如權(quán)利要求1所述的11 a _羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮C11- a -羥化物是在二級(jí)發(fā)酵罐中流加入底物16 a，17 a -環(huán) 氧黃體酮經(jīng)羥化得到的。4. 如權(quán)利要求1所述的11 a _羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述底物16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮1%與N，N-二甲基甲酰胺2%、吐溫-800. 3%混合加熱至 130°C溶清，流加入二級(jí)發(fā)酵罐。5. 如權(quán)利要求4所述的11 a -羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在于， 流加時(shí)間為59~86h，維持發(fā)酵pH6. 0~7. 0,轉(zhuǎn)速200rpm。6. 如權(quán)利要求2所述的11 a-羥基-16 a，17 a-環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法，其特征在 于，所述赭曲霉的一級(jí)發(fā)酵為初始PH5. 0,溫度為28°C時(shí)接入赭曲霉種子，維持罐壓0. 04~ 0? 06MP，培養(yǎng) 12h。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧黃體酮的生產(chǎn)方法。所述方法通過(guò)發(fā)酵赭曲霉、羥化16α,17α-環(huán)氧黃體酮得到16α,17α-環(huán)氧黃體酮C11-α-羥化物，所述發(fā)酵赭曲霉為二級(jí)發(fā)酵，所述16α,17α-環(huán)氧黃體酮C11-α-羥化物是在二級(jí)發(fā)酵罐中流加入底物16α,17α-環(huán)氧黃體酮經(jīng)羥化得到的，其流加時(shí)間59～86h，維持發(fā)酵pH6.0～7.0。本發(fā)明的工藝方法，底物流加時(shí)，在發(fā)酵罐中流加59～86h，16α,17α-環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化90%以上，且具有操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，底物溶劑可回收以實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用，具有降低生產(chǎn)成本，經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12P33/20, C12R1/66, C12P33/10
【公開(kāi)號(hào)】CN104946720
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410118939
【發(fā)明人】張道森, 柏挺, 吳慶安, 周秋火
【申請(qǐng)人】上海新華聯(lián)制藥有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月27日