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蜘蛛牽引絲蛋白優(yōu)化表達(dá)方法

文檔序號(hào):9231107閱讀:770來源:國知局
蜘蛛牽引絲蛋白優(yōu)化表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種生物領(lǐng)域重復(fù)序列蛋白的優(yōu)化表達(dá)方法,具體是指一種絡(luò)新 婦屬蜘蛛(Nephilaclavipes)的牽引絲蛋白MaSp的表達(dá)生產(chǎn)優(yōu)化。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然蜘蛛牽引絲蛋白,是由蜘蛛體內(nèi)大懸壺腺體分泌形成的一種蛋白質(zhì)多聚體, 素有"蜘蛛生命線"之稱;擁有高強(qiáng)度、高彈性、高斷裂功的機(jī)械性能,同時(shí)具有良好的生物 相容性、生物可降解性等優(yōu)良特性,是自然界中綜合性能最好的天然生物材料之一。其主要 由兩種蛋白質(zhì)組成,蜘蛛牽引絲蛋白1和蜘蛛牽引絲蛋白2(MaSpl&2)。這兩種牽引絲蛋白 都是高分子量蛋白,分子量主要分布在250 -350kDa之間;之前研宄表明,MaSpl主要負(fù)責(zé)剛 性性能而MaSp2負(fù)責(zé)彈性性能。兩種蜘蛛牽引絲蛋白都是由三部分構(gòu)成,N -端的結(jié)構(gòu)域、 大分子量高度重復(fù)片段、C-端的結(jié)構(gòu)域,其中的高度重復(fù)序列對于其性能起到重要的作用, 絡(luò)新婦屬蜘蛛牽引絲蛋白的全基因序列尚未報(bào)道,只有部分cDNA核心序列被解析。天然蜘 蛛絲蛋白富含丙氨酸和甘氨酸,丙氨酸富集區(qū)可以形成疏水的b -折疊晶體結(jié)構(gòu),是蜘蛛絲 蛋白具有高強(qiáng)度的重要原因。然而,由于蜘蛛的強(qiáng)烈自我保護(hù)意識(shí)和地域攻擊性,難以通過 大規(guī)模養(yǎng)殖蜘蛛來獲得大量蜘蛛絲蛋白。
[0003] 針對這個(gè)問題,人們通過設(shè)計(jì)氨基酸序列并人工合成氨基酸和基因序列,隨后導(dǎo) 入到不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)重組蜘蛛牽引絲蛋白。特別是從90年代蜘蛛牽引絲蛋白1 和2的cDNA序列被部分解析后,人們對這種由蛋白質(zhì)構(gòu)成、具有優(yōu)良特性的新生物合成材 料探宄和發(fā)掘越來越多。隨著基因技術(shù)和基因化學(xué)合成方法的建立和發(fā)展,利用活細(xì)胞的 合成體系創(chuàng)造新蛋白質(zhì)的基因工程技術(shù)日臻完善;國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行了人工合成蜘 蛛絲蛋白的嘗試(I. Lewis R. V.,Hinman M.,Kothakota S.,F(xiàn)ournier M. J. Expression and purification of a spider silk protein:a new strategy for producing repetitive proteins.Protein expression and purification. 1996, 7(4) :400 - 406 ;2. Fahnestock S.R.,Bedzyk L.A.Production of synthetic spider dragline silk protein in pichia pastoris. Applied microbiology and biotechnology. 1997,47 (I):33 - 39 ; 3. Arcidiacono S·,Mello C·,Kaplan D·,Cheley S. , Bayley H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology. 1998, 49 (I) :31- 38 ;4.Fahnestock S. R. , Irwin S. L Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology. 1997, 47 (I) :23 - 32; 5. LazarisAnthoulaj Arcidiacono StevenjHuang YuejZhou Jiang-FengjDuguay Francois, Chretien Nathalie, Welsh Elizabeth A. Soares,Jason W. , Karatzas Costas N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295(5554) :472 - 476 和 6. Scheller Jlirgenj Glihrs Karl - Heinz, Grosse Frank,Conrad Udo. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature biotechnology. 2001,19(6):573 - 577)ο
[0004] 專利文獻(xiàn)號(hào)W02004/016641公布了編碼來自Euprosthenopssp的MaSpl蛋白的內(nèi) 部重復(fù)部分的核苷酸序列,但并沒有表達(dá)蛋白質(zhì)。專利文獻(xiàn)號(hào)W02003/057727公開了重組 蜘蛛絲蛋白多肽在哺乳細(xì)胞系中的表達(dá),但分子量較低,不能很好的模擬天然蜘蛛牽引絲 的特性。專利文獻(xiàn)號(hào)EP 2 330 186 Bl公布了在大腸桿菌中生產(chǎn)了與天然蜘蛛牽引絲蛋白 相媲美的重組蜘蛛牽引絲蛋白1并采取了代謝工程的手段提高了胞內(nèi)gly -tRNA的含量實(shí) 現(xiàn)了產(chǎn)量的數(shù)十倍的提高,基因操作較為復(fù)雜。
[0005] 大腸桿菌具有遺傳背景研宄透徹、易于繁殖培養(yǎng)、細(xì)胞易于破碎、成本低廉、基因 水平操作簡單等特點(diǎn),是最常用的蛋白表達(dá)體系之一。然而,目前已報(bào)道的利用大腸桿菌生 產(chǎn)蜘蛛絲蛋白存在產(chǎn)量低的問題,尤其是高分子量高重復(fù)序列的蜘蛛牽引絲蛋白的表達(dá)量 低。因此探索一種簡單、方便,并顯著提高蜘蛛牽引絲蛋白產(chǎn)量的策略具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足,提出一種蜘蛛牽引絲蛋白優(yōu)化表達(dá)方法, 在大腸桿菌中首先構(gòu)建高分子量重組蜘蛛牽引絲蛋白質(zhì)粒并表達(dá)生產(chǎn),通過降低培養(yǎng)溫度 提高蛋白產(chǎn)量;隨后在發(fā)酵罐的水平上結(jié)合高密度發(fā)酵和降低培養(yǎng)溫度的策略,實(shí)現(xiàn)了細(xì) 胞量和表達(dá)水平的雙重提高。本發(fā)明能夠有效克服高度重復(fù)的重組蜘蛛牽引絲蛋白在生產(chǎn) 發(fā)酵過程中表達(dá)量低的缺陷;為蜘蛛絲蛋白及類似高度重復(fù)序列蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)研宄和應(yīng) 用提供了良好借鑒意義。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008] 本發(fā)明包括以下步驟:
[0009] 步驟1)設(shè)計(jì)絡(luò)新婦屬重組蜘蛛絲蛋白,并使用兩個(gè)同尾酶NheI和SpeI進(jìn)行無縫 拼接,合成出含有不同長度的蜘蛛牽引絲蛋白的重組質(zhì)粒,并以大腸桿菌作為宿主表達(dá)生 成工程菌;
[0010] 所述的絡(luò)新婦屬重組蜘蛛絲蛋白,具體是指:絡(luò)新婦屬(Nephilaclavipes)蜘蛛 牽引絲蛋白MaSpl和2,其中MaSpl單體核心序列的氨基酸序列如Seq ID No. 1所示,即: Ν' - GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG - C',來源于文獻(xiàn) Xu Ming and Randolph V.Lewis*, Structure of a protein superfiber:Spider dragline silk. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990,87,7120 - 7124。
[0011] 人工設(shè)計(jì)的MaSpl單體核心序列的核苷酸序列,如Seq ID No. 2所示,即: 5? -GGTCGCGGCGGTCTGGGTGGCCAGGGTGCAGGTGCGGCTGCGGCTGCAGGCGGTGCTGGCCAAGGTGGCT ACGGCGGCCTGGGTTCTCAGGGT - 3'。
[0012] 其中MaSp2單體核心序列的氨基酸序列如Seq ID No. 3所示,即: Ν' - GPGGYGPGQQGPSGPGSA8GPGGYGPGQQ - C',來源于文獻(xiàn) Micchael B. Hinman and Randolph V. Lewis*, Isolation of a clone encoding a second dragline silk fibroin. The Journal of Biological Chemistry. 1992,267:19320 - 19324〇
[0013] 人工設(shè)計(jì)的MaSp2單體核心序列的核苷酸序列,如Seq ID No. 4所示,即: 5 ' -GGTCCTGGTGGTTATGGTCCAGGTCAACAGGGTCCATCTGGTCCAGGTAGTGCAGCGGCTGCGGCAGCAG CGGCAGGTCCTGGAGGTTATGGTCCTGGTCAGCAA _ 3'。
[0014] 所述的蜘蛛牽引絲蛋白的核心序列的重復(fù)數(shù)目在8~96之間
[0015] 步驟2)對步驟1得到的工程菌進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng),然后通過低溫 培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化量產(chǎn),具體步驟包括:
[0016] 2. 1)從冷凍狀態(tài)下將工程菌接種至培養(yǎng)基中常溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),獲得種子液;
[0017] 所述的培養(yǎng)基為含有抗生素的LB培養(yǎng)基。
[0018] 所述的常溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)是指:在30°C、220rpm條件下培養(yǎng)14h。
[0019] 2. 2)將種子液接種至培養(yǎng)基中進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)。
[0020] 所述的接種是指:種子液和培養(yǎng)基的體積比為1 :1〇〇。
[0021] 所述的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或R/2培養(yǎng)基。
[0022] 所述的R/2培養(yǎng)基的組分含量:2g/L磷酸氫二銨、6. 75g/L磷酸二氫鉀、0. 85g/L 檸檬酸、5mL/L微量金屬溶液、10g/L葡萄糖、0. 7g/L七水硫酸鎂。
[0023] 所述的微量金屬溶液成分為:10g/L七水硫酸亞鐵、2. 25g/L七水硫酸鋅,lg/L五 水硫酸銅、〇. 5g/L五水硫酸錳、0. 23g/L十水硼酸鈉、2g/L二水合氯化鈣和0. lg/L鉬酸銨。
[0024] 所述的二級(jí)種子培養(yǎng)是指:在30 °C、220rpm下培養(yǎng)至對數(shù)生長初期OD6tltl= 0. 4~ 2. 0〇
[0025] 2. 3)向菌落中進(jìn)一步加入誘導(dǎo)劑至終濃度為ImM,然后在不超過25°C、220rpm的 環(huán)境下進(jìn)行低溫培養(yǎng)。
[0026] 所述的誘導(dǎo)劑采用異丙基-β - D -硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。
[0027] 所述的低溫培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為16°C。
[0028] 所述的低溫培養(yǎng)前優(yōu)選進(jìn)一步對二級(jí)種子進(jìn)行發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例1示意圖;
[0030] 圖中:A為構(gòu)建重組蜘蛛牽引絲蛋白質(zhì)粒方法簡圖;B為部分構(gòu)建質(zhì)粒信息示意 圖。
[0031] 圖2為MaSp2 - 64聚體在不同溫度條件下進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)示意圖;
[0032] 圖中:A為LB天然培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)溫度的生產(chǎn)情況的示意圖,B為R/2合成 培養(yǎng)基不同培養(yǎng)溫度的生產(chǎn)情況的示意圖;其中箭頭所指為目標(biāo)蛋白位置。
[0033] 圖3為不同類型的高分子量重組蜘蛛牽引絲蛋白在不同溫度進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)的示 意圖;
[0034] 圖中:A為MaSp2 - 80聚體,B為MaSpl - 96聚體;其中箭頭所指為對應(yīng)目標(biāo)蛋白 位置。
[0035] 圖4為低分子量蜘蛛牽引絲蛋白MaSp2 - 8聚體和MaSp2 - 16聚體表達(dá)生產(chǎn)不意 圖;
[0036] 圖中箭頭所指為對應(yīng)目標(biāo)蛋白位置。
[0037] 圖5為高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組蜘蛛牽引絲蛋白MaSp2 - 64聚體示意圖;
[0038] 圖中:A為30°C下表達(dá)生產(chǎn),B為16°C下表達(dá)生產(chǎn)示意圖;其中箭頭所指為目標(biāo)蛋 白位置。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明,本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
[0040] 本實(shí)施例中分別構(gòu)
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