用于發(fā)酵制備噴司他丁的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和天然產(chǎn)物的生物合成領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及一種發(fā) 酵制備噴司他丁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 噴司他?。╬entostatin)，又名噴司他汀、噴妥司汀、脫氧助間型霉素，其化學(xué)名 為 ：(8R)-3-(2-脫氧-β-D-赤-戊呋喃糖基）-3,6,7,8_四氫咪唑[4,5-d] [1，3]二氮雜 卓-8-醇（（8R)_3_(2-deoxy-β -D-ribofuranosyl)-3, 6, 7, 8-tetrahydroimidazo[4, 5-d][l，3]diazepin_8-〇l)，化學(xué)式為：C11H16N4O 4,結(jié)構(gòu)式如式（I)。1974 年 Warner Lambert 公司的Peter W.K. Woo等人首次從Streptomyces antiboticus發(fā)酵液中分離得到。噴 司他丁是一種高效的腺苷脫氨酶（ADA)抑制劑，能夠與ADA緊密結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而 使腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量積累脫氧腺苷三磷酸（dATP)和脫氧腺苷，從而使DNA或RNA的合成受 到抑制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。1998年2月美國FDA正式批準(zhǔn)了注射用噴司他丁(商 品名Nipent'")上市，主要用于干細(xì)胞白血?。℉airy cell leukemia, HCL)、慢性淋巴細(xì)胞 白血?。–hroniclympH=ocytic leukemia, CLL)、移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease, GVHD)及蕈樣霉菌?。∕ycosis fungoides)的治療。
[0003]
[0004] 目前，制備噴司他丁主要有化學(xué)合成法和生物合成法。由于噴司他丁特殊的七元 雜環(huán)結(jié)構(gòu)及七元雜環(huán)上的手性醇結(jié)構(gòu)，使得噴司他丁的化學(xué)合成較為困難。目前文獻(xiàn)中報(bào) 道的化學(xué)合成方法路線繁雜，過程中需要提供強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、低溫環(huán)境和使用有毒的有 機(jī)溶劑，且需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行多次提純，工藝復(fù)雜、成本較高，收率較低，故化學(xué)合成不是制 備噴司他丁的理想途徑。生物合成法主要是指液體深層發(fā)酵，在適宜的條件下，通過微生物 的生長與代謝將廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為噴司他丁，整個(gè)生產(chǎn)過程條件溫和，沒有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有毒 試劑的使用，生產(chǎn)成本低于化學(xué)合成法，因而成為噴司他丁合成的主流方法。
[0005] 文獻(xiàn)報(bào)道最優(yōu)方法為2011年上海工業(yè)醫(yī)藥研究所發(fā)明專利（CN102234673A)實(shí)施 例中提供，該方法利用抗生鏈霉菌NRRL3238發(fā)酵制備噴司他丁，其培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 40.0 g/L，細(xì)豆柏 30.0 g/L，大豆蛋白 20g/L，酵母浸粉 5. Og/L，NaC15. Og/L，泡敵 0· 05g/L，溫 度30°C，pH=6. 5,溶氧40%，通氣量0. 5vvm，24h開始流加葡萄糖1-10%。L/h，發(fā)酵周期72h， 噴司他丁產(chǎn)量達(dá)55mg/L。
[0006] 目前，制約噴司他丁生物合成產(chǎn)業(yè)化的主要因素是發(fā)酵工藝不成熟，發(fā)酵液中噴 司他丁濃度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于發(fā)酵制備噴司他丁的發(fā)酵培養(yǎng) 基。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種發(fā)酵制備噴司他丁的方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 一種用于發(fā)酵制備噴司他丁的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括下述組份：碳源3~10g，氮源 21 ~60g，（NH4)2SO4O ~0· 5g，加水至 1L。
[0011] 優(yōu)選的是：碳源為3~7g，氮源為35~50g，（NH4)2SO 4為0~0· 3g。
[0012] 優(yōu)選的是：碳源為4~5g，氮源為42~45g (NH4)2SO4為0~0· lg。
[0013] 碳源優(yōu)選為：葡萄糖、糊精、麥芽糖醇、可溶性淀粉、山梨醇、木糖醇或大米粉。
[0014] 氮源優(yōu)選為：酵母浸粉、麥芽浸粉、高溫豆柏粉、棉籽粉、脫脂豆粉、麩皮和秘魯魚 粉至少一種。
[0015] 一種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，包括如下步驟：
[0016] (1)將鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，在200~ 350r/min，28~34°C搖床中，培養(yǎng)36~72h，得到種子液；
[0017] (2)將種子液按體積接種量為3%~20%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在150~ 300r/min，28~34°C搖床中，培養(yǎng)200~400h，收集發(fā)酵液；
[0018] 或?qū)⒎N子液按體積接種量為6%~10%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為 5L/7L發(fā)酵罐，溫度為30~32°C，通風(fēng)量為0. 5~3vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為100~500r/min，溶氧 與通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)為30%~50%，控制pH=7. 3~7. 9,培養(yǎng)167~389h，收集發(fā)酵液；
[0019] 或?qū)⒎N子液按體積接種量為6%~10%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為 5L/7L發(fā)酵罐，0~24h溫度為32~34°C，24h~312h溫度為31~33°C，312~403h溫度 為33~35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100~500r/min，通風(fēng)量為0. 5~2vvm，溶氧與通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn) 速偶聯(lián)為30%~50%，控制pH=7. 3~7. 9,培養(yǎng)167~389h，收集發(fā)酵液。
[0020] 步驟（1)優(yōu)選為：將鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到搖瓶種子培養(yǎng)基 中，在250~300r/min，32~34°C搖床中，培養(yǎng)48~60h，得到種子液。
[0021] 步驟（2)優(yōu)選為：將種子液按體積接種量為4%~15%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在200~300r/min，30~32°C搖床中，培養(yǎng)272~389h，收集發(fā)酵液；
[0022] 或?qū)⒎N子液按體積接種量為6%~10%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為 5L/7L發(fā)酵罐，溫度為30~32°C，通風(fēng)量為0. 5~3vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為100~500r/min，溶氧 與通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)為35%~40%，控制pH=7. 6~7. 9,培養(yǎng)256~356h，收集發(fā)酵液；
[0023] 或?qū)⒎N子液按體積接種量為6%~10%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為 5L/7L發(fā)酵罐，0~24h溫度為33°C，24h~312h溫度為32°C，312~403h溫度為35°C，攪 拌轉(zhuǎn)速為100~500r/min，通風(fēng)量為0. 5~2vvm，溶氧與通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)為35%~ 40%，控制pH=7. 6~7. 9,培養(yǎng)256~356h，收集發(fā)酵液。
[0024] 發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組份：碳源3~10g，氮源21~60g，（NH4)4SO4O~0. 5g，加水 至1L。
[0025] 優(yōu)選的是：碳源為3~7g，氮源為35~50g，（NH4) 4S04為0~0· 3g。
[0026] 優(yōu)選的是：碳源為4~5g，氮源為42~45g (MM)4SO4為0~0· lg。
[0027] 碳源優(yōu)選為：葡萄糖、糊精、麥芽糖醇、可溶性淀粉、山梨醇、木糖醇或大米粉。
[0028] 氮源優(yōu)選為：酵母浸粉、麥芽浸粉、高溫豆柏粉、棉籽粉、脫脂豆粉、麩皮和秘魯魚 粉至少一種。
[0029] 用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和本發(fā)明的方法，可以使發(fā)酵制備噴司他丁其噴司他丁產(chǎn) 量較高，發(fā)酵能力穩(wěn)定，適于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面用具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受其限制。下述實(shí)施例中所 使用的實(shí)驗(yàn)方法若無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例用所涉及到的原料、試劑等，若 無特殊說明，均可以通過商業(yè)途徑獲得。
[0031] 實(shí)施例1-13 -種用于發(fā)酵制備噴司他丁的發(fā)酵培養(yǎng)基組成見表1
[0032] 表 1
[0034] 表1中各實(shí)施例中的組份加水至1L，配成發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0035] 實(shí)施例14
[0036] 種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖4,酵母浸粉4,麥芽浸粉10,（NH4) 3P042，pH=7. 0~7. 4。
[0037] 實(shí)施例15
[0038] 將鏈霉菌Streptomyces sp. ATCC39365 (購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心American type culture collection),接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基斜面上，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7-10d，待斜面長滿孢子。
[0039] 實(shí)施例16
[0040] 一種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，其特征是包括如下步驟：
[0041] (1)將實(shí)施例15獲得的鏈霉菌Str印tomyces sp.ATCC39365接種到種子培養(yǎng)基 中，在200r/min，28°C搖床中，培養(yǎng)72h，得到種子液；
[0042] (2)將種子液按體積接種量為3%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例2制備）中，在 150r/min，34°C搖床中，培養(yǎng)400h，收集發(fā)酵液。噴司他丁產(chǎn)量為57mg/L。
[0043] 實(shí)施例17
[0044] 一種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，其特征是包括如下步驟：
[0045] (1)將實(shí)施例15獲得的鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到種子培養(yǎng)基 中，在250r/min，32°C搖床中，培養(yǎng)60h，得到種子液；
[0046] (2)將種子液按體積接種量為4%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例2制備）中，在 300r/min，32°C搖床中，培養(yǎng)389h，收集發(fā)酵液。噴司他丁產(chǎn)量為76mg/L。
[0047] 實(shí)施例18
[0048] 一種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，其特征是包括如下步驟：
[0049] (1)將實(shí)施例15獲得的鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到種子培養(yǎng)基 中，在300r/min，32°C搖床中，培養(yǎng)48h，得到種子液；
[0050] (2)將種子液按體積接種量為15%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例4制備）中， 在200r/min，30°C搖床中，培養(yǎng)272h，收集發(fā)酵液。噴司他丁產(chǎn)量為56mg/L。
[0051] 實(shí)施例19
[0052] -種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，其特征是包括如下步驟：
[0053] (1)將實(shí)施例15獲得的鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到種子培養(yǎng)基 中，在350r/min，34°C搖床中，培養(yǎng)36h，得到種子液；
[0054] (2)將種子液按體積接種量為20%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例5制備）中， 在200r/min，28°C搖床中，培養(yǎng)200h，收集發(fā)酵液。噴司他丁產(chǎn)量為59mg/L。
[0055] 實(shí)施例20
[0056] -種發(fā)酵制備噴司他丁的方法，其特征是包括如下步驟：
[0057] (1)將實(shí)施例15獲得的鏈霉菌Str印tomyces sp. ATCC39365接種到種子培養(yǎng)基 中，在200r/min，28°C搖床中，培養(yǎng)72h，得到種子液；
[0058] (2)將種子液按體積接種量為6%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)施例8制備）中，裝 液量為5L/7L發(fā)酵罐，溫度為30°C，通風(fēng)量為0. 5~3