微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味膠原多肽的工藝方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及鱈魚(yú)深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地講是微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味膠原 多肽的工藝方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 魚(yú)品在加工的過(guò)程中，必然會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，（包括魚(yú)頭、魚(yú)皮、魚(yú)鰭、魚(yú)尾、魚(yú)骨 及其殘留魚(yú)肉），其重量約占原料魚(yú)的40%-55%。隨著漁業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品的綜合利用也越 來(lái)越引起人們的重視。魚(yú)皮中膠原蛋白的含量最高可達(dá)蛋白質(zhì)總量的80%以上，較魚(yú)體其 它部位高許多。除鴻巢章二等報(bào)道用鱈魚(yú)皮制備明膠和酶解法制備蛋白多肽粉外，其它有 關(guān)魚(yú)皮膠原蛋白的制備和應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道較少。
[0003] 目前制備魚(yú)皮多肽多用酶解法，如東方海洋膠原蛋白多肽。但酶解法生產(chǎn)的多肽 產(chǎn)品存在苦味大和口感差等缺點(diǎn)。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是克服上述已有技術(shù)的不足，而提供微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味 膠原多肽的工藝方法；主要解決現(xiàn)有的酶解法制備魚(yú)皮多肽產(chǎn)品存在苦味大和口感差等問(wèn) 題。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味膠原多肽的工藝方法， 其特殊之處在于，包括如下工藝步驟： a培養(yǎng)基：鱈魚(yú)魚(yú)皮加水，120-150°C高壓蒸汽滅菌3s-30min，得基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，備 用； b樣品的處理：納豆、酒曲、醋曲的處理，將納豆、酒曲、醋曲分別加入無(wú)菌生理鹽水中， 振蕩10-20min，分別10倍梯度稀釋?zhuān)眉{豆、酒曲、醋曲樣品稀釋液； c蛋白質(zhì)高效降解菌的分離純化： 1) 具蛋白酶活性的細(xì)菌的分離，分別取稀釋度1〇_5~10 _7各種樣品稀釋液，涂布于脫 脂牛奶培養(yǎng)基上，35-37?培養(yǎng)24-48h ;挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線2-3 次并鏡檢獲得純種，挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后備用； 2) 具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分離，分別取稀釋度KT3~KT5各種樣品稀釋液， 分別涂布于馬鈴薯和YH)培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)2-5d ;挑取單菌落接種于培養(yǎng)基上，經(jīng)2-3 次平板劃線并鏡檢獲得純種；純化的菌株分別點(diǎn)種于脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上，挑取透明圈 直徑與菌落直徑之比大的菌落，霉菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面，酵母菌接種于YH)培養(yǎng)基 斜面，培養(yǎng)后備用； d產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離純化：分別取各種樣品稀釋液，涂布于脂肪酶篩選培養(yǎng)基上， 35-37?培養(yǎng)24-48h;挑取菌落周?chē)哂邪咨恋砣Φ木?，?jīng)2-3次平板劃線并鏡檢確認(rèn) 為純種，挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后備用； e多菌種鱈魚(yú)皮發(fā)酵工藝：微生物種子制備，將選取的菌種活化后接種至分別裝有相 應(yīng)液體培養(yǎng)基的容器中，霉菌接種至裝有馬鈴薯液體培養(yǎng)基的容器中，酵母菌接種至裝有 YH)液體培養(yǎng)基的容器中，細(xì)菌接種至裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的容器中；霉菌和酵 母菌28-30°C，細(xì)菌35-37°C，160-210r/min搖床培養(yǎng)，制得種子液；將種子液按照一定的菌 體個(gè)數(shù)比，接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，160-210r/min搖床培養(yǎng)30h，測(cè)定水解度；所述的種 子液菌體個(gè)數(shù)比，細(xì)菌：霉菌：酵母菌約為2:1:1 ; f水解度的測(cè)定：總蛋白含量的測(cè)定，采用微量凱氏定氮法；可溶性多肽含量的測(cè)定采 用福林一酷法；水解度的測(cè)定，米用TCA (二氯乙酸）法； 水解度（DH)%=(A-AV〇V^〇,其中％為魚(yú)皮的總蛋白，Λ(為酶解反應(yīng)前魚(yú)皮蛋白中 的TCA可溶性多肽，％為酶解液中的TCA可溶性多肽。
[0006] 進(jìn)一步的，所述的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比（W/V)為1:1. 5,料液比為魚(yú)皮：發(fā)酵 液總體積比。
[0007] 進(jìn)一步的，e步驟所述的種子液接種量為8%。
[0008] 進(jìn)一步的，e步驟所述的發(fā)酵溫度為30°C。
[0009] 本發(fā)明所述的微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味膠原多肽的工藝方法與已有技 術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，1、采用微生物發(fā)酵魚(yú)皮蛋白制備魚(yú)皮多肽，通 過(guò)控制發(fā)酵條件可將蛋白質(zhì)降解成短肽，同時(shí)利用微生物使某些苦味物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，起到 脫苦的作用，可以克服酶解法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品苦味大和口感差等缺點(diǎn)，既可提高魚(yú)皮膠原 蛋白多肽的得率并保證發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有有害物質(zhì)產(chǎn)生，還得到具有更好功能性的蛋白多 肽；2、采用多菌種益生菌發(fā)酵，通過(guò)不同微生物的相互作用，可將魚(yú)皮中的腥味物質(zhì)分解， 達(dá)到脫腥的目的，這是酶法生產(chǎn)的活性多肽不能達(dá)到的；3、利用水產(chǎn)品加工下腳料，提高產(chǎn) 品的附加值，既能減少環(huán)境的污染，降低水產(chǎn)加工的成本，又可以促進(jìn)水產(chǎn)加工廢棄物的綜 合利用；4、鱈魚(yú)皮的水解度可高達(dá)50. 65%。
[0010]
【具體實(shí)施方式】： 為了更好地理解與實(shí)施，下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明；所舉實(shí)施例僅用于解釋本 發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0011] 分離微生物用培養(yǎng)基的制備： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏38，蛋白胨1(^，似(：15 8，蒸餾水100〇1^，？!17.2~7.4， 瓊脂20g，121°C高壓蒸汽滅菌20min ; 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000 mL，瓊脂20g，pH自然，121°C高壓 蒸汽滅菌20min ; YH)培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸餾水lOOOmL，121°C 高壓蒸汽滅菌20min ; 脫脂牛奶培養(yǎng)基：A.牛奶5 g，蒸餾水50 mL;B.瓊脂2g，蒸餾水50mL;將A、B分別 115°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至60°C混勻后倒平板； 脂肪酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨5g，CaCl2 O.lg，酵母膏l(xiāng)g，Tween-80 10mL，瓊脂20g，蒸餾 水lOOOmL，121°C高壓蒸汽滅菌20 min。
[0012] 實(shí)施例1，微生物混合發(fā)酵鱈魚(yú)皮制備無(wú)腥味膠原多肽的工藝方法，步驟如下： 1、 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：鱈魚(yú)魚(yú)皮l〇〇g，蒸餾水50mL，121°C高壓蒸汽滅菌20min，得基礎(chǔ)發(fā) 酵培養(yǎng)基，備用； 2、 樣品的處理：納豆、酒曲、醋曲的處理，分別取市售納豆、酒曲、醋曲lg，并分別加入 99mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩15min，分別10倍梯度稀釋?zhuān)眉{豆、酒曲、醋曲的樣品稀釋液； 3、 蛋白質(zhì)高效降解菌的分離純化：1)具蛋白酶活性的細(xì)菌的分離，分別取KT5~KT7 各種樣品稀釋液1〇〇μL，涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基上，36°C培養(yǎng)36h ;挑取透明圈直徑與菌落 直徑之比大的單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上平板劃線，重復(fù)2-3次平板劃線并鏡檢確 定為純種，挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后備用；2)具蛋白酶活性的霉 菌和酵母菌的分離，分別取1〇_ 3~10_5各種樣品稀釋液ιοομ L，分別涂布于馬鈴薯和Yro培 養(yǎng)基上，29°C培養(yǎng)3. 5d ;挑取單菌落，經(jīng)2-3次平板劃線并鏡檢確認(rèn)為純種；純化的菌株分 別點(diǎn)種于脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上，挑取透明圈直徑與菌落直徑之比大的單菌落，霉菌接種 于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面，酵母菌接種于Yro培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后備用； 4、 產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離純化：分別取KT5~KT7各種樣品稀釋液?οομL，涂布于脂肪酶 篩選培養(yǎng)基上，36°C培養(yǎng)36h;挑取菌落周?chē)哂邪咨恋砣Φ膯尉洌?jīng)2-3次平板劃線 并鏡檢確認(rèn)為純種，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)后備用； 5、 多菌種鱈魚(yú)皮發(fā)酵工藝：微生物種子制備，將選取的菌種活化后接種至裝有IOOmL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，霉菌接種至裝有馬鈴薯液體培養(yǎng)基的三角瓶中，酵 母菌接種至裝有YH)液體培養(yǎng)基的三角瓶中，細(xì)菌接種至裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的 三角瓶中；霉菌和酵母菌29°C，180r/min搖床培養(yǎng)，細(xì)菌36°C，180r/min搖床培養(yǎng)，分別制 得種子液；將各菌株的種子液按照一定的菌體個(gè)數(shù)比，細(xì)菌：霉菌：酵母菌約為2:1:1，接種 量8%，接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比（w/v)為1:1. 5,180r/min搖床 培養(yǎng)30h，發(fā)酵溫度為30°C，測(cè)定水解度； 6、 水解度的測(cè)定：總蛋白含量的測(cè)定，采用微量凱氏定氮法；可溶性多肽含量的測(cè)定 米用福林一酷法；水解度的測(cè)定，米用TCA (二氯乙酸）法； 水解度（〇Η)%=(Α-Λ(ν〇%-Λ〇,其中％為魚(yú)皮的總蛋白，Λ(為酶解反應(yīng)前魚(yú)皮蛋白中 的TCA可溶性多肽，％為酶解液中的TCA可溶性多肽。
[0013] 關(guān)于上述實(shí)施例1的具蛋白酶和脂肪酶活性菌株的分離和純化：從納豆、酒曲和 醋曲中共分離到170株具有蛋白酶和脂肪酶活力的微生物，其中細(xì)菌25株，霉菌25株，酵 母菌120株。其中細(xì)菌BN IV-1，JF0Y3;黑曲菌Η-2;酵母菌JM白，具有較高產(chǎn)酶活性，4 株微生物的菌落形態(tài)和產(chǎn)酶特性見(jiàn)表1。
[0014] 實(shí)施例2,微生物