一種雙標記熒光激活型探針及其檢測dna的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分子及基因標志物檢測技術領域，具體涉及一種雙標記熒光激活 型探針，以及應用該探針在核糖核酸酶H(RNase H)輔助下高靈敏度分析檢測DNA的方法。
【背景技術】
[0002] DNA是生命體重要的遺傳物質(zhì)，對特定序列DNA進行準確、靈敏檢測對于遺傳疾 病、病原性疾病的早期診斷以及對食物、環(huán)境樣品中病原菌檢測都具有十分重要的意義。 DNA的含量檢測通常是通過DNA雜交反應，結(jié)合各種信號標記技術來實現(xiàn)的。如常用的 Southern印跡雜交方法，需要經(jīng)過電泳分離結(jié)合放射性同位素標記或酶標記，利用放射自 顯影或酶反應顯色實現(xiàn)特定序列DNA的定量分析。該方法存在放射性危害等弊端，且檢 測信號無法實時監(jiān)測，需要復雜的操作步驟才能實現(xiàn)信號的讀出。近年來，基于熒光標記 的DNA雜交檢測方法由于設計靈活、操作簡便、實用性強而獲得了廣泛的應用。分子信標 (Molecular Beacon，簡稱MB)探針技術是該類方法的突出代表。MB探針是一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu) 的短鏈DNA，其環(huán)狀部分大約為20個堿基長度，和靶標DNA互補，其莖部雙鏈兩端分別標記 熒光分子和猝滅基團。無靶標DNA時，MB以發(fā)卡結(jié)構(gòu)存在，熒光猝滅。靶標DNA存在時會與 MB的環(huán)狀部分雜交從而打開MB的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使熒光基團和猝滅基團遠離，熒光得以恢復， 產(chǎn)生靶標DNA的特異性熒光信號?；诜肿有艠说腄NA檢測方法能夠?qū)崟r監(jiān)測體系DNA的 含量信息，已獲得了廣泛的應用。但需要指出的是每個靶標DNA分子只能與一個MB探針反 應而僅激活一個熒光分子的熒光，缺乏信號放大機制，使得檢測靈敏度受到了極大的制約。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單的雙標記熒光激活型探針，該 探針在RNase H輔助下能夠?qū)崿F(xiàn)對生物樣品以及核酸擴增反應產(chǎn)物中DNA分子的快速、高 靈敏檢測。
[0004] 解決上述技術問題所采用的技術方案是：所述雙標記熒光激活型探針是與待測 DNA序列堿基互補的5~40個堿基長度的單鏈RNA，或者是與待測DNA序列堿基互補的5~ 40個堿基長度的單鏈DNA，且該DNA序列中有1/5~4/5的堿基是RNA堿基，該探針的一個 末端修飾熒光基團，另一個末端修飾猝滅基團。
[0005] 上述雙標記熒光激活型探針優(yōu)選與待測DNA序列堿基互補的10~30個堿基長度 的RNA，或者優(yōu)選與待測DNA序列堿基互補的10~30個堿基長度的單鏈DNA，且該DNA序 列中有1/2~4/5的喊基是RNA喊基，該探針的兩個末端分別標記5^光基團和粹滅基團。
[0006] 上述的熒光基團為熒光標記物為熒光素類、羅丹明類、香豆素類及它們的衍生 物中的任意一種或花青染料，具體如：6-羧基熒光素（FAM)、羧基四甲基羅丹明、2, 7-二 甲基-4, 5-二氯_6_羧基焚光素（JOE)、四氯_6_羧基焚光素（TET)、六氯-6-甲基焚光 素（HEX)、德克薩斯紅、3H-吲哚菁染料中的任意一種；上述的猝滅基團為黑洞猝滅基團 (BHQ)、4- (4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（Dabcy 1)、[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯 胺（Eclipse)及它們的衍生物中的任意一種。
[0007] 采用本發(fā)明雙標記熒光激活型探針檢測DNA的方法為：將雙標記熒光激活型探 針、核糖核酸酶H、不同濃度待測DNA標準樣品混合，在30~40°C下反應，實時監(jiān)測反應體 系的熒光信號，反應完全后，根據(jù)不同濃度待測DNA標準樣品對應的熒光強度繪制標準曲 線；然后按照上述方法測試待測DNA樣品對應的熒光強度，根據(jù)標準曲線即可實現(xiàn)待測DNA 的定量檢測。
[0008] 上述檢測方法中，優(yōu)選反應體系中雙標記熒光激活型探針的初始濃度為0. 6~ L 2 μ mol/L，核糖核酸酶H的初始活性為2~5U〇
[0009] 本發(fā)明的雙標記熒光激活型探針結(jié)構(gòu)簡單，探針一末端修飾熒光基團，另一末端 修飾猝滅基團，由于兩末端距離接近，熒光被完全猝滅。該探針與待測DNA雜交形成DNA/ RNA雜合雙螺旋結(jié)構(gòu)后，RNase H會高選擇性水解DNA/RNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的RNA，使得熒光 分子遠離猝滅基團，熒光信號得以恢復，而對單鏈RNA及DNA無影響。在此基礎上，游離的 探針會進一步與待測DNA雜交、被RNase H水解并產(chǎn)生熒光信號，如此循環(huán)反復，使得體系 熒光信號得到顯著放大，從而可實現(xiàn)待測DNA的快速、高靈敏度檢測，克服了基于分子信標 等熒光標記技術的DNA雜交檢測方法缺乏有效信號放大機制這一顯著缺點，且基于該探針 的信號放大機制只需要在常溫條件下即可進行，檢測信號可實時監(jiān)測，大大簡化了 DNA檢 測的操作步驟。除用于直接檢測生物樣品中的待測DNA外，該探針還可以進一步與各種核 酸擴增反應相結(jié)合，用于擴增產(chǎn)物中特定DNA序列的定量檢測。
【附圖說明】
[0010] 圖1是雙標記熒光激活型探針信號放大體系用于DNA檢測的原理圖。
[0011] 圖2是實施例1中的雙標記熒光激活型探針檢測不同濃度待測DNA的實時熒光監(jiān) 測圖。
[0012] 圖3是實施例1中的雙標記熒光激活型探針檢測待測DNA的熒光信號與DNA濃度 的線性關系圖。
[0013] 圖4是實施例2中的雙標記熒光激活型探針檢測待測DNA的實時熒光監(jiān)測圖。
[0014] 圖5是實施例2中的雙標記熒光激活型探針檢測待測DNA的熒光信號與DNA濃度 的線性關系圖。
[0015] 圖6是雙標記熒光激活型探針用于滾環(huán)擴增（RCA)產(chǎn)物檢測的原理圖。
[0016] 圖7是實施例3中的雙標記熒光激活型探針檢測RCA產(chǎn)物的實時熒光監(jiān)測圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于 這些實施例。
[0018] 實施例1
[0019] 針對待測DNA序列TAAATGATAGTAGAGTTATGCTAA (由生工生物工程（上海）股份有 限公司提供），設計與其堿基互補的14個堿基長度的RNA，其堿基序列為AUAACUCUACUAUC， 3' -末端標記黑洞猝滅基團（BHQl)、5' -末端標記6-羧基熒光素（FAM)，得到雙標記熒光 激活型探針（由Integrated DNA Technologies(USA)提供），由于距離接近，F(xiàn)AM的焚光信 號被BHQl所猝滅。在I XRNase H緩沖介質(zhì)中加入雙標記熒光激活型探針、RNase H、待測 DNA標準樣品，混合均勻，在37°C下反應，控制反應體系中雙標記熒光激活型探針的初始濃 度為0. 8 μ mol/L、RNase H的初始活性為2. 5U，并控制反應體系中待測DNA標準樣品的初 始濃度分別為〇、1、5、10、20nmol/L，利用St印One實時定量PCR系統(tǒng)檢測反應體系的熒光強 度（F)，檢測原理如圖1所示，熒光強度隨待測DNA標準樣品濃度（C dna)變化的熒光光譜圖 見圖2,并繪制反應120分鐘后熒光強度隨待測DNA標準樣品濃度變化的線性曲線圖，結(jié)果 見圖3。由圖2可見，隨待測DNA標準樣品濃度在0~20nmol/L范圍內(nèi)逐漸升高，反應體系 熒光信號逐漸增強。由圖3可見，熒光強度與待測DNA標準樣品濃度呈線性關系，線性方程 為：
[0020] F = 357. 9+1740. 2 X Cdna
[0021] 相關系數(shù)!為0. 9985,由相關系數(shù)可