黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標記及其專用引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標記，特別涉及與黃瓜靶斑病抗病基因 Cca 連鎖的分子標記及其在黃瓜種質(zhì)資源選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜（Cucumis Sativus. L)在世界上廣泛栽培，中國是世界上黃瓜栽培面積最大、 總產(chǎn)量最高的國家。
[0003] 黃瓜棒孢葉斑病，又稱祀斑病，是一種世界性分布的病害。目前已成為危害黃瓜露 地和保護地栽培的重要病害之一，尤以越冬溫室、冬春溫室、春大棚等保護地內(nèi)發(fā)生嚴重。 主要危害葉部，病斑初呈淡褐色后變褐綠色，嚴重時葉片枯死。該病導(dǎo)致落葉率低于5 %時， 病情擴展慢，約2周，而后一周內(nèi)發(fā)展快，落葉率可由5 %發(fā)展至90 %。棚室內(nèi)反季節(jié)種植黃 瓜在冬春季節(jié)和初夏均易流行發(fā)病。田間發(fā)病率一般在10% -25%，嚴重時為60% -70%， 造成損失達30%以上。靶斑病采用化學防治效果不理想，不僅使生產(chǎn)投入增加且會造成環(huán) 境安全隱患，倒茬嫁接使技術(shù)困難和勞動成本增加。因此選育抗病品種是解決靶斑病危害 的最佳途徑。
[0004] 黃瓜靶斑病抗病基因影響黃瓜對靶斑病的抗性，它的研究將會推動抗病育種進 程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標記進行標記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中十分有效。分 子標記是在DNA水平上對目標性狀進行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點， 可在苗期進行選擇，加快育種進程。因此，開發(fā)用于輔助鑒定黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的分 子標記十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標記 及其專用引物和應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] -種黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴增出來的核 苷酸序列之一：序列表中SEQ IDN0:1和SEQ ID NO: 2、序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
[0008] 獲得上述黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標記的引物如下：1)獲得黃瓜靶斑病抗病連 鎖分子標記CcaSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;2)獲得黃瓜靶斑病抗 病連鎖分子標記CcaSNP2的引物為序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
[0009] 利用上述引物對，通過常規(guī)PCR法可得到上述分子標記。
[0010] 本發(fā)明涉及的與黃瓜抗靶斑病共分離的dCAPs標記CcaSNPl，是利用抗/感遺傳 群體（母本:WF2757,抗靶斑??；父本：新泰密刺，感靶斑?。┻M行精細定位和克隆獲得的。 通過利用150株的F2:3群體對靶斑病抗病基因 Cca進行初步定位，然后利用2000株的F2群 體對Cca基因進行精細定位到80kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)含3個基因，分別是NB-ARC抗病 基因、BHC-Iike轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因和33-like肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因，其中NB-ARC 基因經(jīng)過驗證分析，被證實為靶斑病抗病基因 Cca的重要候選基因。通過對比研究Cca基 因在抗/感黃瓜材料中的序列差異，發(fā)現(xiàn)一個SNP位點，依據(jù)http://helix, wustl. edu/ dcaps/dcaps. html，在線設(shè)計軟件，開發(fā)設(shè)計了與抗/感祀斑病緊密連鎖的dCAPs分子標記 CcaSNPl。同時利用CcaSNPl標記分析2000多株遺傳群體材料，結(jié)合田間靶斑病接種鑒定 研究，發(fā)現(xiàn)CcaSNPl標記與抗感靶斑病緊密連鎖，達到共分離。
[0011] 本發(fā)明涉及的另一個黃瓜抗靶斑病SNP2關(guān)鍵位點，其在抗病基因 Cca中導(dǎo)致了氨 基酸編碼的變化。該SNP位點是通過對不同遺傳背景的黃瓜靶斑病抗感材料進行基因組重 測序獲得的，通過對多個黃瓜抗感材料進行重測序，利用BWA-Samtools(vO. I. 12a，mpileup 按照默認參數(shù)）軟件分析Cca基因在不同材料中的SNP位點，結(jié)合黃瓜基因組9930-V2和基 因組注釋，發(fā)現(xiàn)Cca基因的210位存在單堿基差異SNP2位點（由G到A)。并利用該SNP2 位點設(shè)計標記，獲得CcaSNP2分子標記，通過分析上述黃瓜材料的基因型，結(jié)合田間靶斑病 接種鑒定材料抗感病表型，發(fā)現(xiàn)CcaSNP2標記分析的基因型與抗感表型一致，證明CcaSNP2 可作為靶斑病緊密連鎖分子標記，篩選黃瓜材料。
[0012] 上述分子標記或引物在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng)用。
[0013] 在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標記CcaSNPl在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng) 用的具體方法為：以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO: 1和序列 表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然后采用MaeII內(nèi)切酶對 PCR產(chǎn)物酶切，如果得到165bp的酶切產(chǎn)物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶 切產(chǎn)物，則待測黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測黃瓜材料為WF2757或者長春密刺，或 者以WF2757和/或長春密刺作為親本得到的子代；
[0014] 在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標記CcaSNP2在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng) 用的具體方法為：以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID N0:3和序 列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然后采用XbaI內(nèi)切 酶對PCR產(chǎn)物酶切，如果得到164bp的酶切產(chǎn)物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到134bp 的酶切產(chǎn)物，則待測黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測黃瓜材料為BANNA HUANGGUA， 或者 CUCUMIS HARDWICKII，或者 DI HUANGGUA，或者以 BANNA HUANGGUA 和 / 或者 CUCUMIS HARDWICKII作為親本得到的子代，或者以DI HUANGGUA作為親本得到的子代，或者DI HUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII作為親本得到的子代，或者以BANNA HUANGGUA和DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
[0015] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] 本發(fā)明的dCAPs標記CcaSNPl和CcaSNP2與黃瓜靶斑病抗病存在緊密連鎖關(guān)系 (共分離），可鑒定目的基因黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的存在，實現(xiàn)對抗病植株的間接選擇， 由于不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可用于早代選擇，縮短育種年限，提高育種效 率，為進行黃瓜靶斑病抗病育種提供技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0017] 圖1是黃瓜靶斑病抗病基因 Cca定位連鎖圖譜，其中左圖黃瓜靶斑病基因初定位 示意圖，中間兩個圖為靶斑病抗病基因精細定位示意圖，右圖為80kb區(qū)間范圍內(nèi)基因分布 情況及基因注釋；
[0018] 圖2是Cca基因 CcaSNPl分子標記在某一群體中酶切驗證結(jié)果示意圖；
[0019] 圖3是Cca基因 CcaSNP2分子標記在某一群體中酶切驗證結(jié)果示意圖；
[0020] 圖4是Cca基因 CcaSNPl分子標記在未知另一群體中的酶切鑒定結(jié)果示意圖；
[0021] 圖5是Cca基因 CcaSNP2分子標記在另一未知群體中的酶切結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不限于此。
[0023] 實施例1 :黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的獲得
[0024] -、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca初步定位和精細定位
[0025] 具體的定位方法包括以下步驟：
[0026] A、黃瓜靶斑病抗病基因定位研究親本及遺傳群體：
[0027] 分別選擇WF2757 (母本）和新泰密刺（父本）為抗感親本，構(gòu)建150株的F2:3群 體和超過2000株的F2大群體。其中，父本新泰密刺和母本W(wǎng)F2757購自北京市農(nóng)作物種質(zhì) 資源庫。
[0028] B、黃瓜靶斑病抗病基因定位研究病情指數(shù)調(diào)查：
[0029] 將親本及各群體的種子用紗布包裹，溫湯浸種，28°C恒溫催芽后播于50孔穴盤 中，在空調(diào)溫室育苗，育苗基質(zhì)為滅菌的珍珠巖或營養(yǎng)土。
[0030] 黃瓜棒抱葉斑病病原菌多主棒抱菌[Corynespora cassiicola(Berk. Curt.) Wei.]是通過高葦?shù)仍谖墨I（河北青縣黃瓜棒孢葉斑病病原菌種群分化的研究，華北農(nóng)學 報，2011,26(5) :9-15)中記載的分離方法獲得的。采用闞琳娜等（黃瓜褐斑病防治藥劑的 活體篩選，中國蔬菜，2007 (4) : 22~24)的方法制備黃瓜靶斑病菌液，濃度為I X IO5個孢子 /mL，血球計數(shù)板測定孢子濃度。于黃瓜幼苗期進行懸浮菌液噴霧接種，用小型手持噴霧器 將制備好的懸浮菌液均勻地噴灑于黃瓜葉片上，以葉片有水滴流淌為度。接種后置于25°C 光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。進行3次重復(fù)，每次重復(fù)30株。
[0031] 按上述方法接種后7~IOd進行病情調(diào)查。病情分級標準為：0級：無病斑；1級： 病斑面積占整個葉面積的5%以下；2級：病斑面積占5%~25% ;3級：病斑面積占26%~ 50% ;4級：病斑面積占51 %~75% ;5級：病斑面積達75%以上。其中2以下為抗病，3以 上為感病類型。
[0032] 對親本及各群體的病情進行精確統(tǒng)計。
[0033] C、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的初步定位：
[0034] 利用 Cavagnar 等（Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber. BMC Genomics，2010, 11:569)發(fā)表的黃瓜高密度遺傳圖引物信息和和本實 驗室開發(fā)的Indel和SNP引物信息（參見表1中序號為1-8的引物信息），結(jié)合150株的 F2群體病情指數(shù)的精確統(tǒng)計，對親本和后代群體進行分子標記分析，編碼采集親本及群 體單株的基