肽 gp100 215EaMDQVPESV)和多肽 MART-127l(ELAGIGILTV)由 SBS Genetech Co，Beijing，China.合成。RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA。
[0101] HLA-A2+TAP-缺陷T2細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基37 °C培 養(yǎng)。1 X 106個T2細胞在培養(yǎng)基中分別與20 y M多肽gp100 215E (MDQVPESV)或多肽 MART-127JELAGIGILTV)混和 4 小時。
[0102] A431細胞和293T細胞分別用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)。
[0103] 結合多肽的T2細胞、A431細胞、293T細胞被PBS洗滌和重懸。每種細胞均與10iig 的純化產(chǎn)物共孵育30分鐘。然后細胞被PBS洗滌，重懸，并用Guava EasyCyte流式細胞 儀（Guava Technologies, Hayward, CA, USA)分析。所有數(shù)據(jù)都用 Flowjo software (Tree Star, Ashland, OR, USA)分析。以未反應的G3-DsRed作為陰性對照。
[0104] 結果如圖5所示。圖5A左顯示，GPA7與DsRed形成的蛋白復合物能識別帶有 gp100 215EaMDQVPESV)多肽的T2細胞，而陰性對照G3-DsRed不能。EG2與DsRed形成的蛋 白復合物也不能識別帶有gpl〇〇215EaMDQVPESV)多肽的T2細胞。圖5A右顯示，無論是GPA7 與DsRed形成的蛋白復合物還是EG2與DsRed形成的蛋白復合物，都和陰性對照G 3-DsRed 一樣，不能識別帶有多肽MART-127JELAGIGILTV)的T2細胞。圖5B左顯示，EG2與DsRed形 成的蛋白復合物能夠識別表面表達EGFR的A431細胞，而GPA7與DsRed形成的蛋白復合物 和陰性對照G 3-DsRed都不能。圖5B右顯示，對于293T細胞，無論是EG2與DsRed形成的 蛋白復合物還是GPA7與DsRed形成的蛋白復合物，都和陰性對照G 3-DsRed -樣，都不能識 別。
[0105] 實驗證明，在SrtA的催化下，羧基端帶有LPETG的單區(qū)抗體能位點特異性的和氨 基端帶有3個甘氨酸的DsRed耦合連接形成蛋白復合物。蛋白復合物保留了單區(qū)抗體的抗 原識別特異性，并能染色表達該抗原的細胞。單區(qū)抗體和DsRed能在體外被耦合連接，連接 產(chǎn)物在沒有其他標記試劑的情況下，能直接用于一步染色，在FACS及其他領域有較強的應 用價值。
【主權項】
1. 一種制備多聚體熒光蛋白復合物的方法，為如下（1)或（2): (1) 包括如下步驟： I、 制備A片段，A片段為N端連接有2-7個甘氨酸的、可形成多聚體的熒光蛋白單體； II、 制備B片段，B片段為C端連接有轉肽酶的識別序列的、具有識別功能的蛋白； III、 使A片段和B片段在轉肽酶的作用下進行連接，得到所述熒光蛋白單體與所述具有 識別功能的蛋白的復合物； 所述熒光蛋白單體與具有識別功能的蛋白的復合物為如下中的至少一種：由所述熒光 蛋白單體組成的多聚體，該多聚體中有1個、2個、……、n個熒光蛋白單體均分別與一個所 述具有識別功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于構成所述多聚體的熒光蛋白單體的 數(shù)目； (2) 包括如下步驟：
1. 制備A片段，A片段為C端連接有轉肽酶的識別序列的、可形成多聚體的熒光蛋白 單體； II、 制備B片段，B片段為N端連接有2-7個甘氨酸的、具有識別功能的蛋白； III、 使A片段和B片段在轉肽酶的作用下進行連接，得到所述熒光蛋白單體與所述具有 識別功能的蛋白的復合物； 所述熒光蛋白單體與具有識別功能的蛋白的復合物為如下中的至少一種：由所述熒光 蛋白單體組成的多聚體，該多聚體中有1個、2個、……、n個熒光蛋白單體均分別與一個所 述具有識別功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于構成所述多聚體的熒光蛋白單體的 數(shù)目。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述使A片段和B片段在轉肽酶的作用 下進行連接的方法為：制備含有A片段、B片段和轉肽酶的反應體系，將整個反應體系進行 孵育。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有A片段、B片段和轉肽酶的 反應體系由所述A片段、所述B片段、所述轉肽酶、氯化鈉、氯化鈣和Tris-HCl緩沖液組成。
4. 根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述轉肽酶的識別序列為LPETG; 所述轉膚酶為SortaseA，SortaseB或SortaseC，具體為編碼基因序列為SEQIDNo. 1所 示的蛋白。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法（1)中，所述融合蛋白從N端至C 端的序列為：具有識別功能的蛋白-LPETGGG-可形成多聚體的熒光蛋白單體；所述方法（2) 中，所述融合蛋白從N端至C端的序列為：可形成多聚體的熒光蛋白單體-LPETGGG-具有識 別功能的蛋白。
6. 根據(jù)權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于： 所述方法（1)中，所述A片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為轉肽 酶-LPETGGG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標簽的重組表達質粒中，得到重組表達 載體P-His-轉肽酶-LPETGGG;將熒光蛋白單體的編碼基因插在重組表達載體P-His-轉肽 酶-LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重組表達載體p-His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單 體；將重組表達載體P-His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體導入大腸桿菌中，進行原核表 達，純化，得到從N端至C端序列為His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；將從 N端至C端序列為His-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白用Tris-HCl緩沖液和 氯化鈣的混合溶液室溫孵育，使得HiS-轉肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白斷裂為 序列為His-轉肽酶-LPET的融合蛋白和序列為GGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；用His標 記蛋白純化柱進行純化，收集不帶有His標簽的物質，即得到從N端至C端序列為GGG-熒 光蛋白單體的融合蛋白； 所述方法（1)中，所述B片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為具有識別功能 的蛋白-LPETG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標簽的重組表達質粒中，得到重組表達 載體P-具有識別功能的蛋白-LPETG-His;將P-具有識別功能的蛋白-LPETG-His導入大 腸桿菌中，進行原核表達，純化，得到從N端至C端序列為具有識別功能的蛋白-LPETG-His 標簽的融合蛋白； 所述方法（1)的步驟III中，整個反應體系孵育完畢后，還包括如下步驟：用His標記蛋 白純化柱進行純化，收集不帶有His標簽的物質，即為所述復合物和所述熒光蛋白單體的 混合物；再進行蛋白凝膠電泳純化，即得所述復合物。
7. 根據(jù)權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述可形成多聚體的熒光蛋白單 體為GFP、DsRed或AzmGreen;所述具有識別功能的蛋白為完整抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體或 抗體的Fc片段、受體、受體的配基或MHC復合物； 所述單區(qū)抗體具體為GPA7或EG2。
8. 由權利要求1-7任一所述的方法得到的多聚體熒光蛋白復合物。
9. 權利要求8所述的多聚體熒光蛋白復合物在用流式細胞儀分選表面呈現(xiàn)靶標蛋白 的細胞中的應用；所述靶標蛋白能與所述多聚體熒光蛋白復合物中的具有識別功能的蛋白 相互作用；
10. 權利要求8所述的多聚體熒光蛋白復合物在作為流式細胞儀分析中的兼具標記和 分選功能的試劑中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多聚體熒光蛋白復合物及其應用。該多聚體熒光蛋白復合物，由多聚體熒光蛋白和目的蛋白連接而成；所述多聚體熒光蛋白由若干個熒光蛋白單體組成；所述目的蛋白是能夠與靶標蛋白相互作用的蛋白。蛋白復合物保留了單區(qū)抗體的抗原識別特異性，并能染色表達該抗原的細胞。單區(qū)抗體和DsRed能在體外被耦合連接，連接產(chǎn)物在沒有其他標記試劑的情況下，能直接用于一步染色，在FACS及其他領域有較強的應用價值。
【IPC分類】C07K1-26, C12N15-70, C07K19-00
【公開號】CN104844711
【申請?zhí)枴緾N201410054047
【發(fā)明人】高斌, 王力飛, 崔紅蓮
【申請人】南通表源生物技術有限公司, 中科微生物免疫制劑工程中心南通有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2014年2月18日