一種多聚體熒光蛋白復(fù)合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多聚體熒光蛋白復(fù)合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單區(qū)抗體來(lái)自于胳能的重鏈抗體（Hamers-Casterman, Atarhouch et al. 1993)。 重鏈抗體缺失重鏈第一恒定域和輕鏈，其單鏈的穩(wěn)定性是由于可變域第二框架區(qū)4個(gè)氨基 酸的取代（1\ /[1171(161'11^118,4七31'11011(3116七31.1994;￥11，6113111'011(116七31.1997)。單區(qū)抗體也 可來(lái)自于常規(guī)抗體的可變域（Chen, Zhu et al. 2008)。
[0003] Discosoma紅色熒光蛋白，與從VICTORIA水母的綠色熒光蛋白（GFP)同源，是 一個(gè)來(lái)自珊瑚Discosoma的紅色突光蛋白（Matz, Fradkov et al. 1999)。紅色突光蛋白 (DsRed)的晶體結(jié)構(gòu)表明，其以四聚體形式存在（Yarbrough, Wachter et al. 2001)。由于 野生性DsRed有成熟緩慢等主要缺點(diǎn)（Baird，Zacharias et al.2000)，研究人員將DsRed 的突變，突變體克服了緩慢成熟的缺點(diǎn)并提高了溶解度（Bevis and Glick2002;Yanushe vich，Staroverov et al.2002)。除了在558nm最佳激發(fā)處激發(fā)，DsRed的也可通過(guò)共焦 顯微鏡和流式細(xì)胞儀中標(biāo)準(zhǔn)的488nm激光所激發(fā)（Hawley，Telford et al. 2001)。作為 融合伴侶，DsRed通過(guò)基因手段與各種蛋白質(zhì)連接，用于免疫檢測(cè)試領(lǐng)域（Peipp, Saul et al.2004;Huang，Chen et al.2006)。而且由于它的四聚體的形式，該融合蛋白它會(huì)自動(dòng)多 聚化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備多聚體熒光蛋白復(fù)合物的方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的制備多聚體熒光蛋白復(fù)合物的方法，為如下（1)或（2):
[0006] (1)包括如下步驟：
[0007]I、制備A片段，A片段為N端連接有2-7個(gè)甘氨酸的、可形成多聚體的熒光蛋白 單體；
[0008]II、制備B片段，B片段為C端連接有轉(zhuǎn)肽酶的識(shí)別序列的、具有識(shí)別功能的蛋白；
[0009] III、使A片段和B片段在轉(zhuǎn)肽酶的作用下進(jìn)行連接，得到所述熒光蛋白單體與所述 具有識(shí)別功能的蛋白的復(fù)合物；
[0010] 所述熒光蛋白單體與具有識(shí)別功能的蛋白的復(fù)合物為如下中的至少一種：由所述 熒光蛋白單體組成的多聚體，該多聚體中有1個(gè)、2個(gè)、……、n個(gè)熒光蛋白單體均分別與一 個(gè)所述具有識(shí)別功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于構(gòu)成所述多聚體的熒光蛋白單 體的數(shù)目；
[0011] (2)包括如下步驟：
[0012]I、制備A片段，A片段為C端連接有轉(zhuǎn)肽酶的識(shí)別序列的、可形成多聚體的熒光 蛋白單體；
[0013] II、制備B片段，B片段為N端連接有2-7個(gè)甘氨酸的、具有識(shí)別功能的蛋白；
[0014] III、使A片段和B片段在轉(zhuǎn)肽酶的作用下進(jìn)行連接，得到所述熒光蛋白單體與所述 具有識(shí)別功能的蛋白的復(fù)合物；
[0015] 所述熒光蛋白單體與具有識(shí)別功能的蛋白的復(fù)合物為如下中的至少一種：由所述 熒光蛋白單體組成的多聚體，該多聚體中有1個(gè)、2個(gè)、……、n個(gè)熒光蛋白單體均分別與一 個(gè)所述具有識(shí)別功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于構(gòu)成所述多聚體的熒光蛋白單 體的數(shù)目。
[0016] 上述方法中，所述使A片段和B片段在轉(zhuǎn)肽酶的作用下進(jìn)行連接的方法為：制備含 有A片段、B片段和轉(zhuǎn)肽酶的反應(yīng)體系，將整個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行孵育。
[0017] 上述方法中，所述孵育的溫度為37°C，所述孵育的時(shí)間為2-3小時(shí)；
[0018] 上述方法中，所述含有A片段、B片段和轉(zhuǎn)肽酶的反應(yīng)體系由所述A片段、所述B 片段、所述轉(zhuǎn)肽酶、氯化鈉、氯化鈣和Tris-HCl緩沖液組成，各種物質(zhì)在反應(yīng)體系中的濃度 為：A片段l-50iiM、具體為5iiM，B片段10-500iiM、具體為50iiM，轉(zhuǎn)肽酶l-50iiM、具體為 10iiM，氯化鈉l-500mM、具體為lOOmM，氯化鈣l-100mM、具體為10mM。
[0019] 上述方法中，所述反應(yīng)體系的pH值為6. 0-8. 5、具體為7.5 ;所述Tris-HCl緩沖液 的濃度為10_500mM、具體為300mM。
[0020] 上述方法中，所述轉(zhuǎn)肽酶的識(shí)別序列為L(zhǎng)PETG ;所述2-7個(gè)甘氨酸為3個(gè)甘氨酸； 所述轉(zhuǎn)膚酶為Sortase A，Sortase B或Sortase C，具體為編碼基因序列為SEQ ID No.l所 示的蛋白。
[0021] 上述方法中，所述方法（1)中，所述融合蛋白從N端至C端的序列為：具有識(shí)別功 能的蛋白-LPETGGG-可形成多聚體的熒光蛋白單體；所述方法（2)中，所述融合蛋白從N端 至C端的序列為：可形成多聚體的熒光蛋白單體-LPETGGG-具有識(shí)別功能的蛋白。
[0022] 上述方法中，制備A片段或制備B片段均可通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí) 現(xiàn)，原核表達(dá)系統(tǒng)具體可為大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)具體可為昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及酵母表達(dá)系統(tǒng)。
[0023] 本發(fā)明中一個(gè)優(yōu)選的方式為如下：
[0024] 所述方法（1)中，所述A片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為轉(zhuǎn)肽 酶-LPETGGG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒中，得到重組表達(dá) 載體p-His-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG ;將熒光蛋白單體的編碼基因插在重組表達(dá)載體p-His-轉(zhuǎn)肽 酶-LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重組表達(dá)載體p-His-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單 體；將重組表達(dá)載體P-His-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體導(dǎo)入大腸桿菌中，進(jìn)行原核表 達(dá)，純化，得到從N端至C端序列為His-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；將從 N端至C端序列為His-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白用Tris-HCl緩沖液和 氯化鈣的混合溶液室溫孵育，使得Hi s-轉(zhuǎn)肽酶-LPETGGG-熒光蛋白單體的融合蛋白斷裂為 序列為His-轉(zhuǎn)肽酶-LPET的融合蛋白和序列為GGG-熒光蛋白單體的融合蛋白；用His標(biāo) 記蛋白純化柱進(jìn)行純化，收集不帶有His標(biāo)簽的物質(zhì)，即得到從N端至C端序列為GGG-熒 光蛋白單體的融合蛋白；Tris-HCl緩沖液和氯化鈣的混合溶液中氯化鈣的濃度為10mM ;
[0025] 所述方法（1)中，所述B片段按照如下方法制備：將從N端至C端序列為具有識(shí)別 功能的蛋白-LPETG的融合蛋白的編碼基因插入帶有His標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒中，得到重 組表達(dá)載體P-具有識(shí)別功能的蛋白-LPETG-His ;將p-具有識(shí)別功能的蛋白-LPETG-His 導(dǎo)入大腸桿菌中，進(jìn)行原核表達(dá)，純化，得到從N端至C端序列為具有識(shí)別功能的蛋 白-LPETG-His標(biāo)簽的融合蛋白；
[0026] 所述方法（1)的步驟III中，整個(gè)反應(yīng)體系孵育完畢后，還包括如下步驟：用His標(biāo) 記蛋白純化柱進(jìn)行純化，收集不帶有His標(biāo)簽的物質(zhì)，即為所述復(fù)合物和所述熒光蛋白單 體的混合物；再進(jìn)行蛋白凝膠電泳純化，即得所述復(fù)合物。
[0027] 上述方法中，所述可形成多聚體的熒光蛋白單體為GFP、DsRed或AzmGreen ;所述 具有識(shí)別功能的蛋白為完整抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體或抗體的Fc片段、受體、受體的配基 或MHC復(fù)合物；
[0028] 上述方法中，所述單區(qū)抗體具體為GPA7或EG2。
[0029] 上述方法中，每個(gè)紅色熒光蛋白DsRed單體的編碼基因序列如SEQ ID No. 5所示；
[0030] 上述方法中，所述GPA7的編碼基因序列如SEQ ID No. 3中第1-375位核苷酸所 示；
[0031] 上述方法中，所述EG2的編碼基因序列如SEQ ID No. 4中第1-384位核苷酸所示；
[0032] 由上述任一所述的方法得到的多聚體熒光蛋白復(fù)合物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 由上述任一所述的方法得到的多聚體熒光蛋白復(fù)合物在用流式細(xì)胞儀分選表面 呈現(xiàn)靶標(biāo)蛋白的細(xì)胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述靶標(biāo)蛋白能與所述多聚體熒 光蛋白復(fù)合物中的具有識(shí)別功能的蛋白相互作用；
[0034] 由上述任一所述的方法得到的多聚體熒光蛋白復(fù)合物在作為流式細(xì)胞儀分析中 的兼具標(biāo)記和分選功