診斷受試者中的肝癌的方法及診斷肝癌的試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本發(fā)明要求于2012年9月21日遞交的美國臨時專利申請61/704, 425,名稱為"診 斷受試者中的肝癌的方法及診斷肝癌的試劑盒（METHODS OF DIAGNOSING LIVER CANCER IN A SUBJECT AND A KIT FOR DIAGNOSING LIVER CANCER)"的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，該專利申請的全 部公開通過整體引用并入本文中以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及診斷受試者中的肝癌的方法，以及評定具有肝硬化的受試者發(fā)展成肝 癌的風(fēng)險的方法。本發(fā)明還涉及診斷肝癌的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0004] 肝細(xì)胞癌（HCC)是全球最常見的癌癥之一并且是癌癥死亡的第二位最常 見的原因，同時具有全球高于50萬例的年發(fā)病率（Kamangar et al (2006). J Clin 0ncol，24,2137-50;Boyle Ρ· (2008) .Annals of Oncology, 19:605-606)。由于診斷晚， HCC患者的結(jié)局仍然很差。目前，血清α-胎蛋白（AFP)水平和超聲波檢查法通常用于 HCC的篩查和診斷。但是，這種途徑的臨床用途因為多種原因而受限。首先，AFP不是 在所有HCC患者中都是升高的，并且AFP可能因為慢性肝病而升高，從而產(chǎn)生令人不滿 意的敏感度和特異性。在20ng/ml的截斷值（cut-off value)處，不同研宄均報道了敏 感度的范圍為41%~64%，并且特異性的范圍為80%~91% (Daniele et al，（2004) Gastroenterology. 2004Nov ; 127 (5Suppl I) :S108-12)。根據(jù) 2005 年出版的美國肝 病研宄學(xué)會（AASLD)的實踐指南，推薦200ng/ml是診斷的截斷點，同時敏感度為22% 且特異性高于 99 % (Trevisani et al, J Hepatol. (2001) Apr ;34 (4) : 570-5, Lok et al.，Gastroenterology (2010) Feb ; 138 (2) : 493-502)。在 2010 年，基于最近研宄的結(jié)果，用 于HCC監(jiān)控的2010AASLD指南推薦超聲單獨用于監(jiān)視，并且不再包括用于監(jiān)視和診斷的AF ?出1'1111&51161'11^11，!1印3如1(^7(2011)]\&11';53(3):1020-22)。另一方面，超聲具有它自己的 局限，難以在具有大塊畸形物的肝硬化的肝臟中檢測腫瘤。此外，超聲的性能高度依賴于操 作者的經(jīng)驗和設(shè)備的精密性，并且生活在不發(fā)達(dá)地區(qū)中的人可能無法使用。由于這些原因， 已經(jīng)投入了大量精力以尋找用于HCC篩查和診斷的更可靠的標(biāo)記物。
[0005] HCC的理想的標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)是特異性且敏感的，并且來自容易獲取的樣本。隨著高密 度微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，近幾年已經(jīng)鑒定出了很多新的標(biāo)記物。一種最初的探索途 徑是尋找HCC腫瘤組織中的線索，諸如磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)和高爾基體蛋白73(GP73) (Liu et al.,World J Gastroenterol. (2010)Sep 21 ； 16 (35):4410-5,Capurro et al, Gastroenterology. (2003) Jul ; 125(1): 89-97)，并且通過 ELISA 或蛋白印跡（Western blot)驗證它們存在于外周血中。一些研宄使用質(zhì)譜繪制血漿中的蛋白圖譜，以鑒定出蛋 白標(biāo)記物，諸如骨橋蛋白（〇PN)(Shang et al，H印atology.(2012)Feb;55(2):483-90)。 其它研宄利用微陣列繪制來自血漿或血清的核酸的圖譜，以鑒定出基因標(biāo)記物或微 RNA(microRNA)標(biāo)記物（Zhou et al，J Clin 0ncol.2011Dec 20;29(36):4781-8·)。在 HCC的新的標(biāo)記物中，得到最廣泛研宄的標(biāo)記物是脫-γ-羧基凝血酶原（DCP)和糖型 AFP (AFP-L3)。盡管，報道稱DCP的敏感度相對較好（74% )，但是它的特異性并不令人滿意 (70% ~86%) (Marerro et al，Gastroenterology. (2009) Jul ;137(1):110_8, Lok et al， 上述）。得到的結(jié)論是，AFP和DCP都不是在檢測早期HCC中補足超聲的最佳方式（Lok et al,上述）。
[0006] 因此，需要找到適于HCC早期檢測的新的標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種診斷受試者中的肝癌的方法。該方法包括確定獲自受試者的樣 品中至少一種標(biāo)記物基因的基因表達(dá)水平，該至少一種標(biāo)記物基因選自由腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)的蛋白3(TNFAIP3)的基因、雙調(diào)蛋白（AREG)的基因和GTP酶IMP家族成員5(GIMAP5) 的基因組成的組。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種評定具有肝硬化的受試者發(fā)展成肝癌的風(fēng)險的方法。該方法 包括確定獲自受試者的樣品中至少一種標(biāo)記物基因的基因表達(dá)水平，該至少一種標(biāo)記物基 因選自由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白3(TNFAIP3)的基因、雙調(diào)蛋白（AREG)的基因和GTP 酶IMP家族成員5(GIMAP5)的基因組成的組。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷受試者中的肝癌的方法。該方法包括：確定獲自受 試者的樣品中的至少一種標(biāo)記物蛋白的存在或量，該至少一種標(biāo)記物蛋白選自由腫瘤壞死 因子α誘導(dǎo)的蛋白3 (TNFAIP3, SwissProt登記號：P21580)、雙調(diào)蛋白（AREG，SwissProt登 記號：P15514)和GTP酶IMAP家族成員5(GIMAP5, SwissProt登記號：Q96F15)組成的組。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種通過確定至少一種標(biāo)記物基因的表達(dá)水平診斷肝癌的試劑 盒，該至少一種標(biāo)記物基因選自由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白3(TNFAIP3)的基因、雙調(diào)蛋 白（AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成員5 (GIMAP5)的基因組成的組。該試劑盒包括與所 述標(biāo)記物基因的核酸分子的至少一種互補的一個或多個寡核苷酸。
【附圖說明】
[0011] 當(dāng)與非限制性的實施例和附圖結(jié)合考慮時，參考詳細(xì)描述將能更好地理解本發(fā) 明，其中：
[0012] 圖1示出了在本發(fā)明中使用的研宄設(shè)計。在中山大學(xué)腫瘤防治中心（Sun Yat-Sen University Cancer Center)、廣州第八人民醫(yī)院（中國）征集的一組28位個體用于初始 發(fā)現(xiàn)的組中。這28位患者包括10位被診斷患有HCC的患者，12位被診斷患有慢性肝炎的 患者和6位健康患者。使用高密度基因微陣列繪制從HCC患者和慢性肝炎患者及健康個體 分離的白血球（WBC)中的基因表達(dá)圖譜。在初始基因篩選之后，在中山大學(xué)腫瘤防治中心、 廣州第八人民醫(yī)院還征集了一組50位被診斷患有HCC的患者、50位被診斷患有慢性肝炎 的患者，這些患者用于建立練習(xí)群并且用于開發(fā)3-基因邏輯模型。這一模型在60位被診 斷患有HBV和HCC的患者及90位患有慢性肝炎的患者（CHB患者）的獨立隊列中得到了證 實，這些患者在新加坡中央醫(yī)院和新加坡國立癌癥中心及中山大學(xué)腫瘤防治中心征集。在 該研宄中總共包含256位個體（250位患有HCC或CHB的患者、6位健康個體）。除了健康 對照之外，所有患者對乙型肝炎病毒的表面抗原都是陽性的（HBsAg陽性）。
[0013] 圖2示出了研宄參與者的臨床特征，其中圖2A在表1中示出了在廣州中山大學(xué)腫 瘤防治中心征集的患者的臨床特征，并且圖2A在表2b中示出了在新加坡中央醫(yī)院和新加 坡國立癌癥中心征集的患者的臨床特征。來自廣州的75位患者被診斷患有HCC并且128 位是慢性肝炎患者，而來自新加坡的35位患者被診斷患有HCC并且12位是慢性肝炎患者。
[0014] 圖3在表3(圖3A)中示出了在本發(fā)明的練習(xí)組中鑒定出的9種顯著性基因的差 異性表達(dá)和診斷特性（表3)。該練習(xí)組（練習(xí)群）包含50位被診斷患有HCC的患者和50 位被診斷患有慢性肝炎的患者。圖3B示出了標(biāo)記物TNFAIP3(曲線（a))、雙調(diào)蛋白（AREG) 基因（曲線（b))、NFKBlA(曲線（c))、NFKB1Z (曲線（d))和CD83(曲線（e))的曲線下面積 (ROC)。圖3C示出了標(biāo)記物GTP酶IMAP家族成員6 (GIMAP6)(曲線（a))、GTP酶IMAP家族 成員4 (GIMAP4)(曲線（b))、GTP酶IMP家族成員5 (GIMAP5)的基因（曲線⑷）和GTP酶 IMP家族成員8(GIMAP8)(曲線（e))的R0C。圖3A和圖3B中的曲線下面積（AUC)以95% 的置信區(qū)間示出。
[0015] 圖4示出了在練習(xí)組（圖4A)和測試組（圖4B)中的不同標(biāo)記物模型的ROC(接 受者工作特征）曲線分析。更詳細(xì)地講，示出了用于單獨的腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白 3(TNFAIP3)的基因（曲線（a))的ROC曲線分析，或用于TNFAIP3與雙調(diào)蛋白（AREG)的基因 和GTP酶IMAP家族成員5 (GIMAP5)的基因組合（曲線（b))的ROC曲線分析。圖4中的曲 線下面積（AUC)以95%的置信區(qū)間示出。通過逐步邏輯回歸（正演法（forward method)) 開發(fā)模型。由優(yōu)勢比計算是HCC的概率，并且以0至1范圍內(nèi)的得分給出該是HCC的概率。
[0016] 圖5示出了在不同的截止點（cutoff point)，來自練習(xí)組和測試組的用于單獨的 TNFAIP3基因或用于TNFAIP3基因與AREG基因和GIMAP5基因組合的ROC分析的敏感度（真 陽性率（TPR))和特異性（1-假陽性率（FPR))在55%至92%之間。
[0017] 圖6示出了在104位HCC患者和108位CHB患者中，對單獨的TNFAIP3基因（曲 線（a))或TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因的組合（曲線（b))，以及血清AFP(曲線 (C))的ROC曲線分析。
[0018] 圖7示出了在14位已經(jīng)被診斷患有巴塞羅那臨床肝癌（BCLC)A期HCC的患者和 140位