評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素p450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法和藥劑的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為評價細(xì)胞因子與細(xì)胞色素 P450的相互作用的方法，例如涉及評價由細(xì) 胞因子引起的細(xì)胞色素 P450的藥物代謝功能的誘導(dǎo)和衰減的方法。另外，本發(fā)明為與細(xì)胞 因子相互作用的藥劑的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，關(guān)于細(xì)胞因子已經(jīng)進(jìn)行了各種研宄。
[0003] 例如，炎癥性的自身免疫疾病的患者的白介素的血藥濃度高于健康人，細(xì)胞色素 P450的代謝功能低于健康人，炎癥時由于分泌至血中的細(xì)胞因子類而CYP3A4的代謝功能 降低，因此藥劑無法排泄，作為結(jié)果，顯示出會引起嚴(yán)重的副作用（非專利文獻(xiàn)1)。對這樣 的患者給予經(jīng)受了細(xì)胞色素 P450的代謝的藥物（Dl)時，估計該患者的代謝功能的降低程 度來給予少于健康人的量。對于這樣的患者組合使用阻礙白介素的受體那樣的、與細(xì)胞因 子相互作用的藥劑（D2)(例如分子靶向藥物）時，降低了的細(xì)胞色素 P450的代謝功能恢 復(fù)，藥物（Dl)的代謝得到促進(jìn)。其結(jié)果，臨床研宄中示出藥物（Dl)的作用減弱化（非專利 文獻(xiàn)2)。出于這樣的背景，分子靶向藥物那樣的藥劑與經(jīng)受了細(xì)胞色素 P450的代謝的藥物 的介由細(xì)胞因子的相互作用的研宄備受關(guān)注。
[0004] 作為該方法之一，可以舉出動物實驗。然而，人與動物有種差，因此有無法準(zhǔn)確地 預(yù)測生物體內(nèi)的反應(yīng)的問題（非專利文獻(xiàn)3)。此外，動物實驗?zāi)菢拥捏w內(nèi)（in vivo)的試 驗與體外（in vitro)系統(tǒng)相比，生產(chǎn)能力性能差。因此，有不適于同時評價大量化合物的 藥物的篩選的問題。
[0005] 出于這樣的背景，要求能夠準(zhǔn)確地預(yù)測生物體內(nèi)的反應(yīng)的基于in vitro的試驗的 評價法。另外，以白介素為代表的細(xì)胞因子類作為藥物開發(fā)靶標(biāo)也受到關(guān)注，近年來要求用 于評價藥劑與細(xì)胞因子的相互作用的in vitro系統(tǒng)。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 非專利文獻(xiàn)
[0008] 非專利文獻(xiàn) I :Kenneth W. Renton 著、"Cytochrome P450 Regulation and Drug Biotransformation During Inflammation and Infection''、Current Drug Metabolism、 2004年 5 月、pp. 235-243
[0009] 非專利文獻(xiàn) 2:Leslie J. Dickmann，Sonal Κ· Patel，Dan A. Rock，Larry C. Wienkersj and J.Greg Slatter 著、"Effects of Interleukin-6(IL-6)and an Anti-IL-6 Monoclonal Antibody on Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatocyte Culture"、DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39、2011 年、pp. 1415-1422
[0010] 非專利文獻(xiàn) 3:C Schmitt，B Kuhnl，X Zhang，AJ Kivitz3and S Grange 著、 uDisease-Drug-Drug Interaction Involving Tocilizumab and Simvastatin in Patients With Rheumatoid Arthritis''、Clinical pharmacology&Therapeutics、VOLUME 89 NUMBER 5、2011 年 5 月、ρρ· 735-740

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明要解決的問題
[0012] 作為in vitro的試驗，非專利文獻(xiàn)3中公開了使用人原代肝細(xì)胞的方法。然而， 人原代肝細(xì)胞對于由供體的基因多態(tài)性、環(huán)境因素導(dǎo)致的藥物動態(tài)基因的表達(dá)量及其誘導(dǎo) 能力的批間差異大。此外，獲得途徑受到限制，因此成本高、操作困難。因此，存在難以使用 多種細(xì)胞因子，以同一批的細(xì)胞一次性評價多個細(xì)胞色素 P450、或者需要較大成本的問題。
[0013] 另一方面，可以使株化肝細(xì)胞增殖。因此，評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝 能力產(chǎn)生的影響的方法中，如果能利用源自人的株化肝細(xì)胞，則可以期待能夠得到廉價且 有重現(xiàn)性的結(jié)果。然而，已知的是，株化肝細(xì)胞的代謝功能所具有的肝細(xì)胞的功能與原代肝 細(xì)胞相比，非常低。例如，使用用來培養(yǎng)細(xì)胞的底部表面平坦的培養(yǎng)容器培養(yǎng)株化肝細(xì)胞 時，有時細(xì)胞色素 P450的代謝能力變?yōu)闇y定極限值以下，無法進(jìn)行分析。這樣的情況下，即 使在不添加細(xì)胞因子的對照組中也可以檢測到代謝功能，測定添加細(xì)胞因子時的代謝功能 的衰減量也是極為困難的。為了克服該問題，已經(jīng)研宄了各種三維培養(yǎng)，但存在操作煩雜、 需要使用特殊的裝置、或為高成本之類的問題。出于這樣的背景，使用株化肝細(xì)胞評價細(xì)胞 因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法尚未開發(fā)。
[0014] 發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法以 及與細(xì)胞因子相互作用的藥劑的篩選方法中利用株化肝細(xì)胞的方法。
[0015] 用于解決問題的方案
[0016] 發(fā)明人等利用使球狀體形狀的株化肝細(xì)胞與包含細(xì)胞因子的試驗溶液接觸1小 時以上且小于96小時后測定細(xì)胞色素 P450的代謝能力的方法解決了上述問題。
[0017] 本發(fā)明的評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法的一個方 案為，使球狀體形狀的株化肝細(xì)胞與包含細(xì)胞因子的試驗溶液在培養(yǎng)容器內(nèi)接觸1小時以 上且小于96小時后，評價細(xì)胞色素 P450的代謝功能的誘導(dǎo)或衰減的有無。發(fā)現(xiàn)：通過形成 球狀體形狀的株化肝細(xì)胞，使所形成的球狀體形狀的株化肝細(xì)胞與試驗溶液接觸適合的時 間，從而能夠測定代謝功能。根據(jù)該方法，測定并評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能 力產(chǎn)生的影響成為可能。
[0018] 另外，本發(fā)明的評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法的 一個方案中，優(yōu)選的是，由前述株化肝細(xì)胞形成的球狀體的直徑的平均值為50 μπι以上且 小于200 μ m，且具有半值寬度范圍內(nèi)的直徑的球狀體為全部球狀體的70%以上。通過球狀 體的直徑的大小為規(guī)定的范圍內(nèi)、且球狀體的直徑的大小的偏差變小，從而可以提高代謝 功能的判定的精度。
[0019] 進(jìn)而，本發(fā)明的評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法的 一個方案中，優(yōu)選的是，前述試驗溶液為無血清培養(yǎng)基。
[0020] 此外，優(yōu)選的是，以健康人的細(xì)胞因子的血藥濃度的平均值的0. 1倍至50倍的范 圍中的一個濃度為基準(zhǔn)，使用前述試驗溶液的細(xì)胞因子濃度為前述基準(zhǔn)的1倍、10倍、100 倍至少這3種濃度的包含前述細(xì)胞因子的各試驗溶液。另外，優(yōu)選的是，以前述細(xì)胞因子在 被分泌的疾病患者的血藥濃度的平均值的0. 1倍至50倍的范圍中的一個濃度為基準(zhǔn)，使用 前述試驗溶液的細(xì)胞因子的濃度為前述基準(zhǔn)的1倍、10倍、100倍至少這3種濃度的包含細(xì) 胞因子的各試驗溶液。
[0021] 本發(fā)明的方法的一個方案中，優(yōu)選的是，在同一孔內(nèi)進(jìn)行將前述株化肝細(xì)胞培養(yǎng) 為球狀體形狀的工序、和使球狀體形狀的前述株化肝細(xì)胞和包含前述細(xì)胞因子的前述試驗 溶液接觸1小時以上且小于96小時的工序。
[0022] 例如，優(yōu)選的是，使用具有多個孔的培養(yǎng)板的一個孔作為前述培養(yǎng)容器來進(jìn)行以 下的各工序。
[0023] (1)在前述一個孔內(nèi)，在包含10%血清的培養(yǎng)基中形成前述株化肝細(xì)胞的球狀體 的工序；
[0024] (2)從前述一個孔吸取前述培養(yǎng)基的工序；
[0025] (3)向前述一個孔中添加包含前述細(xì)胞因子的前述試驗溶液的工序；
[0026] (4)在前述一個孔內(nèi)，使包含前述細(xì)胞因子的前述試驗溶液與前述球狀體接觸1 小時以上且小于96小時的工序。
[0027] 此外，發(fā)明人等利用使球狀體形狀的株化肝細(xì)胞、與包含細(xì)胞因子和藥劑中的任 一者的試驗溶液接觸后測定細(xì)胞色素 P450的代謝能力的方法從而解決了上述問題。
[0028] 本發(fā)明的與細(xì)胞因子相互作用的藥劑的篩選方法的一個方案為，準(zhǔn)備不含前述細(xì) 胞因子和前述藥劑的第一試驗溶液、包含前述細(xì)胞因子且不含前述藥劑的第二試驗溶液、 以及包含前述細(xì)胞因子和前述藥劑的第三試驗溶液，
[0029] 使前述第一試驗溶液至第三試驗溶液與球狀體形狀的株化肝細(xì)胞接觸，
[0030] 測定與前述第一試驗溶液接觸的前述株化肝細(xì)胞的細(xì)胞色素 P450的藥物代謝酶 的功能，取得第一測定值，同樣地測定與前述第二試驗溶液和第三試驗溶液接觸的前述株 化肝細(xì)胞的細(xì)胞色素 P450的藥物代謝酶的功能，取得第二測定值和第三測定值，
[0031] 前述第一測定值大于前述第二測定值且前述第二測定值小于前述第三測定值時， 判定前述藥劑使細(xì)胞色素 P450的藥物代謝功能恢復(fù)。
[0032] 發(fā)現(xiàn)：通過該方法，與細(xì)胞因子相互作用的藥劑的篩選方法中能夠利用株化肝細(xì) 胞。
[0033] 另外，本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選的是，由前述株化肝細(xì)胞形成的球狀體的直徑的 平均值為50 μ m以上且小于200 μ m，并且具有半值寬度范圍內(nèi)的直徑的球狀體為全部球狀 體的70%以上。通過球狀體的直徑的大小為規(guī)定的范圍內(nèi)，且球狀體的直徑的大小的偏差 變小，從而可以提尚代謝功能的判定的精度。
[0034] 進(jìn)而，本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選的是，前述試驗溶液的溶劑為無血清培養(yǎng)基。
[0035] 此外，優(yōu)選的是，前述第三測定值為前述第二測定值的3倍時，判定使細(xì)胞色素 P450的藥物代謝功能恢復(fù)。
[0036] 進(jìn)而，優(yōu)選的是，前述第二試驗溶液和第三試驗溶液的細(xì)胞因子的濃度如下選擇： 使包含至少3種濃度的細(xì)胞因子且不含前述藥劑的溶液與前述株化肝細(xì)胞接觸，對細(xì)胞色 素 P450的藥物代謝酶的功能進(jìn)行測定，選擇所測得的測定值小于前述第一測定值的濃度， 其中所述包含至少3種濃度的細(xì)胞因子且不含前述藥劑的溶液為，以健康人的細(xì)胞因子的 血藥濃度的平均值的0. 1倍至50倍的范圍中的一個濃度為基準(zhǔn)，前述第二試驗溶液和第三 試驗溶液的細(xì)胞因子的濃度為前述基準(zhǔn)的1倍、10倍、100倍至少這3種濃度的包含前述細(xì) 胞因子且不含前述藥劑的溶液。另外，優(yōu)選的是，前述第二試驗溶液和第三試驗溶液的細(xì)胞 因子的濃度如下選擇：使包含至少3種濃度的細(xì)胞因子且不含前述藥劑的溶液與前述株化 肝細(xì)胞接觸，對細(xì)胞色素 P450的藥物代謝酶的功能進(jìn)行測定，選擇所測得的測定值小于前 述第一測定值的濃度，其中所述包含至少3種濃度的細(xì)胞因子且不含前述藥劑的溶液為， 以前述細(xì)胞因子在被分泌的疾病患者的血藥濃度的〇. 1倍至50倍的范圍中的一個濃度為 基準(zhǔn)，前述第二試驗溶液和第三試驗溶液的細(xì)胞因子的濃度為前述基準(zhǔn)的1倍、10倍、100 倍至少這3種濃度的包含前述細(xì)胞因子且不含前述藥劑的溶液。
[0037] 本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選的是，在培養(yǎng)板的同一孔內(nèi)進(jìn)行將前述株化肝細(xì)胞培 養(yǎng)為球狀體形狀的工序、和使球狀體形狀的前述株化肝細(xì)胞與前述第一試驗溶液至第三試 驗溶液接觸的工序。
[0038] 發(fā)明的效果
[0039] 根據(jù)本發(fā)明，評價細(xì)胞因子對細(xì)胞色素 P450的代謝能力產(chǎn)生的影響的方法以及 與細(xì)胞因子相互作用的藥劑的篩選方法中能夠利用株化肝細(xì)胞。
【附圖說明】
[0040] 圖1為示出本發(fā)明的一個實施方式中使用的培養(yǎng)板的整體的圖。
[0041] 圖2A為圖1所示的培養(yǎng)板的II-II線截面圖。
[0042] 圖2B為圖1所示的培養(yǎng)板的其他II-II線截面圖。
[0043] 圖3為示出本發(fā)明的一個實施方式中使用的培養(yǎng)容器的整體的圖。
[0044] 圖4為圖3所示的培養(yǎng)容器的IV-IV線截面圖。
[0045] 圖5A為示出在培養(yǎng)空間中培養(yǎng)球狀體的狀態(tài)的概要圖。
[0046] 圖5B為示出說明在培養(yǎng)空間中培養(yǎng)的球狀體的優(yōu)選尺寸的一例的模式圖的圖。
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