一種維持菌株高效固氮能力的基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可維持菌株高效固氮能力的基因及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 細(xì)菌非編碼RNA通常位于蛋白編碼基因間區(qū)，大小通常在40-500個(gè)核苷酸，可轉(zhuǎn) 錄出RNA序列，但不翻譯成蛋白質(zhì)。近年來，研宄發(fā)現(xiàn)細(xì)菌非編碼RNA在原核生物如環(huán)境脅 迫、物質(zhì)代謝、群體感應(yīng)以及細(xì)菌毒力等諸多生命活動(dòng)過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控功能。
[0003] 在固氮細(xì)菌中，越來越多的非編碼RNA得以鑒定和研宄。這些已經(jīng)闡明的小RNA 的功能大多集中在保守的持家功能、固氮菌對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)、對(duì)逆境脅迫的抵御以及根 瘤菌的共生結(jié)瘤過程。本發(fā)明對(duì)細(xì)菌小非編碼RNA是否直接參與生物固氮的調(diào)控過程進(jìn)行 了初步探索。
[0004] 固氮施氏假單胞菌的非編碼RNA ArsZ序列（RNA序列為SEQ ID NO: 1)中，由對(duì)應(yīng) 的arsZ基因編碼（DNA序列為SEQ ID NO: 2)，該基因編碼區(qū)不具有微生物中典型的始密碼 子和終止密碼子，現(xiàn)有技術(shù)中尚未發(fā)現(xiàn)其能轉(zhuǎn)錄并翻譯成有功能的蛋白質(zhì)，也沒有其用途 方面的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)能特異響應(yīng)氮信號(hào)的基因，并探索其序列特征以及遺傳特性 和作用模式。
[0006] 本發(fā)明人在進(jìn)行施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)轉(zhuǎn)錄組分析過程中，首 次發(fā)現(xiàn)了一種可轉(zhuǎn)錄的有功能性的非編碼RNA基因，并命名為arsZ基因（銨響應(yīng)小RNA， Ammonium-Responsive Small RNA，ArsZ)〇
[0007] 所述非編碼RNA ArsZ (RNA序列為SEQ ID NO: 1)是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 2 的DNA轉(zhuǎn)錄而成的。
[0008] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該基因可特異響應(yīng)氮信號(hào)，參與固氮施氏假單胞菌固氮調(diào)控，能夠維 持菌株高效固氮能力，可以應(yīng)用于獲得具有高效固氮活性的工程菌株。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，所述參與固氮施氏假單胞菌固氮調(diào)控，是在轉(zhuǎn)錄水平上延長(zhǎng) 固氮酶結(jié)構(gòu)組分nifD mRNA的半衰期，穩(wěn)定固氮酶，從而維持固氮施氏假單胞菌高效的固氮 能力。
[0010] 具體來講，本發(fā)明進(jìn)行了如下工作：
[0011] 1、發(fā)現(xiàn)固氮施氏假單胞菌A1501中arsZ基因的功能
[0012] 本發(fā)明人進(jìn)行了非編碼RNA編碼基因 arsZ對(duì)特異信號(hào)的響應(yīng)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)arsZ 基因能夠特異的響應(yīng)氮信號(hào)。
[0013] 將施氏假單胞菌A1501菌在以下幾個(gè)時(shí)相中培養(yǎng)：有氮有氧條件（CNO, K培養(yǎng) 基）、無氮有氧條件（CfO, K培養(yǎng)基中不添加氮源，并且充氬氣排空氣三分鐘，然后注入 0. 5 %的氧氣），并收集菌體，提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過Real-time PCR方法對(duì) arsZ基因在不同脅迫條件下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。
[0014] 結(jié)果顯示，固氮施氏假單胞菌A1501的全基因組中含有arsZ基因的DNA序列，與 有氮有氧條件（CNO)相比，在無氮有氧條件下（CN^arsZ的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高了近2. 5倍， 說明arsZ基因能夠特異的感應(yīng)氮信號(hào)。表明固氮施氏假單胞菌A1501 (P. stutzeri A1501) 中arsZ基因能對(duì)氮信號(hào)做出響應(yīng)。
[0015] 2、arsZ基因的遺傳特性研宄
[0016] 進(jìn)行arsZ基因生物信息學(xué)分析Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTN比對(duì) 分析，表明arsZ基因（DNA序列如SEQ ID NO: 2所示）基因?qū)儆谝活惥哂蟹N特異性，功能仍 未確定的基因家族。
[0017] arsZ基因生物信息學(xué)分析：
[0018] 將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的arsZ的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 2所示）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (如SEQ ID NO: 1所示）在Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄出的RNA ArsZ的序列與數(shù)據(jù) 庫(kù)中的RNA家族中的任何成員不存在同源性，這表明ArsZ可能屬于一類新的功能仍未確定 的RNA家族；
[0019] 與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTN比對(duì)，進(jìn)一步顯示該非編碼RNA的編碼基因 arsZ 的同源序列僅僅在四株施氏假單胞菌和棕色固氮菌中存在（如圖2)，這說明arsZ是一類功 能未知的具有種特異性的功能單元。
[0020] 3、獲得具有高效固氮活性的工程菌株
[0021] 1)構(gòu)建arsZ基因突變株
[0022] 分別將包含該非編碼RNA上下游同源基因序列和抗性盒篩選標(biāo)記的自殺載體轉(zhuǎn) 至P. stutzeri A1501中，利用同源重組的原理獲得arsZ的缺失突變株Δ arsZ。
[0023] 2)構(gòu)建arsZ回補(bǔ)質(zhì)粒
[0024] 首先通過PCR擴(kuò)增獲得完整的arsZ DNA片段，然后將克隆片段進(jìn)行BamHI和 HindIII雙酶切，插入到廣宿主表達(dá)載體pLAFR3的多克隆位點(diǎn)處，最后將arsZ表達(dá)載體 轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl09中獲得具有四環(huán)素抗性的重組表達(dá)菌株E. coli Transl09(parsZ) 〇
[0025] 3)驗(yàn)證arsZ基因的功能
[0026] 采用乙稀還原法測(cè)定野生型A1501菌株和arsZ缺失突變株的固氮酶活性。
[0027] 結(jié)果表明，與野生型菌株相比，AarsZ菌株的固氮酶活能力降低50%，而回補(bǔ)菌 株的固氮酶活性則與野生型相當(dāng)。
[0028] Real-time PCR結(jié)果進(jìn)一步證明arsZ的缺失能夠降低固氮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平， 推測(cè)arsZ可能通過對(duì)氧信號(hào)的響應(yīng)參與到了固氮施氏假單胞菌A1501生物固氮的調(diào)控過 程。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了能轉(zhuǎn)錄成有功能性的非編碼RNA基因 arsZ，且該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（基因序列為SEQ ID N0:1)可維持菌株的高效固氮能力，可應(yīng) 用于獲得具有高效固氮活性的工程菌。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種維持菌株高效固氮能力的方法，特征在于應(yīng)用arsZ基因的 功能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
[0031] 所述方法具體包括克隆完整的arsZ基因的DNA片段序列和構(gòu)建具有高效固氮能 力的重組菌株的步驟。
[0032] 克隆完整的arsZ基因的DNA片段的優(yōu)選方法是從核苷酸序列為SEQ ID NO:2的 DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA基因。
[0033] 為驗(yàn)證和對(duì)比arsZ基因的功能，本發(fā)明還構(gòu)建了 arsZ基因的缺失突變株和回補(bǔ) 株，其中，缺失突變株的構(gòu)建步驟為：
[0034] (1)克隆出含有基因組同源序列和替換arsZ基因的抗性盒篩選標(biāo)記的DNA片段；
[0035] (2)將⑴得到的DNA片段酶切后插入到自殺載體中，得到重組載體；
[0036] (3)將步驟⑵得到的重組載體轉(zhuǎn)化到野生型菌株中，篩選缺失突變株，即arsZ基 因完全敲除的菌株。
[0037] 優(yōu)選的方法如下：
[0038] 步驟（1)中，所述克隆是利用融合PCR方法；
[0039] 步驟（2)中，所述插入到自殺載體，是將arsZ基因插入到自殺載體的多克隆位 占.
[0040] 所述自殺載體是自殺載體pK18mobsacB ;
[0041] 步驟（3)中，所述野生型菌株為固氮施氏假單胞菌。
[0042] 步驟（3)中，所述轉(zhuǎn)化是通過三親接合的方法，所述篩選是通過同源重組篩選 arsZ基因敲除菌株。
[0043] 序列表說明
[0044] 非編碼 RNA ArsZ 的 RNA 序列 SEQ ID NO: 1。
[0045] 非編碼RNA ArsZ的編碼基因 arsZ的DNA序列SEQ ID NO: 2。
[0046] arsZ 基因 PCR 擴(kuò)增特異性引物序列 Pst_2408BamHIF，SEQ ID N0:3。
[0047] arsZ 基因 PCR 擴(kuò)增特異性引物序列 Pst_2409HindIIIR，SEQ ID N0:4。
【附圖說明】
[0048] 圖1為a