自動化酵母出芽測量的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先要求權和相關專利申請
[0002] 本申請要求2012年10月18日提交的美國臨時申請系列No. 61/715,496的優(yōu)先 權利益，所述臨時申請的全部內(nèi)容作為整體通過參考并入本文。
技術領域
[0003] 本發(fā)明總的來說涉及酵母細胞的分析和測量。更具體來說，本發(fā)明涉及用于評估 和測量酵母細胞的酵母出芽、活性（viability)和濃度的高效且有效的方法和組合物。
【背景技術】
[0004] 生物燃料和釀造工業(yè)一直利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為主要 生物體來開始生產(chǎn)CO2和生物乙醇作為產(chǎn)物的發(fā)酵過程。目前，最大的生物燃料過程嚴重 依賴于乙醇生產(chǎn)，其利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)對甘鹿、玉米粉、多糖和廢 水進行發(fā)酵。由于它們的高的乙醇耐受性、最終乙醇濃度、葡萄糖轉化率和工業(yè)發(fā)酵在歷 史上的穩(wěn)健性（historical robustness)，酵母是用于生物乙醇生產(chǎn)的理想組分。（Antoni 等，2007Appl. Microbiol. Biotech, vol. 77, ρρ· 23-35 ;Vert6s 等，2008J. Mol. Microbiol, and Biotech, vol. 15, pp. 16-30 ;Basso 等，2008FEMS Yeast Res. vol. 8, pp. 1155-1163; Nikoli0 等，2009J. Chem. Technolog· Biotech, vol. 84, pp. 497-503 ;Gibbons 等，2009In Vitro Cell. &Developm. Biol. -Plant, vol. 45, pp. 218-228 ;Hu 等，2007Genetics，vol. 175, pp. 1479-1487 ;Argueso 等，2009Genome Res. vol. 19, pp. 2258-2270 ;Eksteen 等， 2003Biotech. and Bioeng.vol. 84, pp. 639-646〇 )
[0005] 酵母出芽是釀酒廠和生物燃料公司用于確定發(fā)酵質(zhì)量的最重要的參數(shù)之一。用 于繁殖和發(fā)酵的酵母接種時間（pitching time)是樣品中出芽酵母的百分率，已知其能 夠估算酵母的生長率。目前，沒有現(xiàn)有的簡單的自動酵母出芽檢測方法。成像流式細胞儀 已被用于進行酵母細胞周期測定以測量出芽百分率。（Meredith等，2008Cytometry Part A，73A:825-833。）然而，成像流式細胞儀相對昂貴并且需要相當大量的維護以及訓練有素 的技術人員進行操作。因此，它不適合于工業(yè)生產(chǎn)背景中的質(zhì)量保證。此外，由于樣品中大 的玉米糖化醪殘渣會堵塞系統(tǒng)中的流體通路，因此基于流動的樣品制備不能用于生物燃料 樣品。
[0006] 用于濃度、活性和酵母出芽百分率的常規(guī)分析方法包括在常規(guī)光學顯微鏡下在血 細胞計數(shù)器中對酵母顆粒進行手動計數(shù)和在鋪板中對菌落形成單位進行菌落計數(shù)。這些方 法是繁瑣和耗時的，并且由于操作人員的主觀性而固有地不一致。為了獲得在發(fā)酵期間酵 母行為的準確體現(xiàn)，需要用于測量樣品的濃度、活性和出芽百分率的自動方法。
[0007] 因此，對用于準確且高效測量酵母的濃度、活性和出芽百分率的自動方法，存在著 未滿足的需求。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明部分是基于用于自動測量酵母出芽百分率的高效和有效方法的發(fā)現(xiàn)。本發(fā) 明克服了以前方法的缺點，通過本發(fā)明的方法可以容易地并準確地分析例如來自于生物燃 料和葡萄酒生產(chǎn)廠的實時樣品。由于本發(fā)明允許高的染色特異性，因此可以有效地測量混 雜的樣品。由于允許快速、準確和同時測定酵母出芽、濃度和活性，本發(fā)明的自動的、基于圖 像的細胞計量方法極大簡化了生物燃料和釀造工業(yè)的測量過程。
[0010] 一方面，本發(fā)明總的來說涉及一種用于自動分析酵母細胞的出芽狀態(tài)的方法。所 述方法包括：在緩沖溶液中用染料對將要進行酵母細胞出芽分析的樣品進行染色；獲取所 述染料染色的樣品的熒光圖像；通過基于計算機的自動化處理分析所述染料染色的樣品的 所述熒光圖像，以確定所述染料染色的樣品中酵母細胞的圖像的縱橫比，由此確定所述樣 品中出芽的酵母細胞的狀態(tài)。
[0011] 另一方面，本發(fā)明總的來說涉及一種用于同時測定酵母出芽和活性的方法。所述 方法包括：將待測樣品在緩沖溶液中用第一染料并用第二染料進行染色；獲取用所述第一 和第二染料染色的樣品的第一熒光圖像，該第一熒光圖像對應于來自于所述第一染料的熒 光；獲取用所述第一和第二染料染色的樣品的第二熒光圖像，該第二熒光圖像對應于來自 于所述第二染料的熒光；通過基于計算機的自動化處理分析所述第一熒光圖像以確定酵母 細胞的縱橫比，由此確定所述樣品中出芽的酵母細胞的狀態(tài)；以及分析所述第二熒光圖像 以確定酵母活性。
[0012] 另一方面，本發(fā)明總的來說涉及一種用于同時測量樣品中酵母細胞的濃度、活性、 出芽百分率的方法。所述方法包括：將待測樣品在具有約5至約12的pH的緩沖條件下用第 一染料并用第二染料進行染色；獲取用所述第一和第二染料染色的樣品的第一熒光圖像， 該第一熒光圖像對應于來自于所述第一染料的熒光；獲取用所述第一和第二染料染色的樣 品的第二熒光圖像，該第二熒光圖像對應于來自于所述第二染料的熒光；以及分析所述第 一和第二熒光圖像，以確定酵母細胞的濃度、活性和出芽百分率。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖1描繪了來自于本發(fā)明的方法的實施例的某些示例性結果，示出了用于對出芽 酵母進行計數(shù)的成像分析方法。
[0015] 圖2描繪了來自于本發(fā)明的方法的實施例的某些示例性結果，示出了從正在生長 的酵母群體測量的出芽百分率。
[0016] 圖3描繪了來自于本發(fā)明的方法的實施例的某些示例性結果，示出了與傳統(tǒng)的手 動計數(shù)方法的比較。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 本發(fā)明解決了以前方法的缺點，并提供了對各種不同樣品例如來自于生物燃料廠 的含有玉米糖化醪和其他殘渣的樣品的實時和準確的分析。由于高的染色特異性，因此可 以有效地測量混雜樣品。通過允許同時分析和測量酵母細胞的活性和濃度，本發(fā)明還提供 了極高的效率和有效性。
[0019] 最近，Nexcelom Bioscience (Lawrence，MA)開發(fā)了 一 種新的成像細胞 計量方法，其能夠使用廉價的一次性計數(shù)板快速測量細胞濃度，僅需20μ1樣品。 (Lai 等，2009J. Clin. Oncology vol. 27, PP. 1235-1242 ;Nott 等，2009J. Biol. Chem. vol. 284, pp. 15277-15288 ；Qiao 等，2009Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biol. vol. 29, pp. 1779-U139 ;Rounbehler 等，2009Cancer Res. vol. 69, pp. 547-553 ; Shanks 等，2009Appl. and Envir. Microbiol, vol. 75, ρρ· 5507-5513 ;Stengel 等，2009Endo crinology, vol. 150, pp. 232-238〇 )
[0020] 利用明場和熒光成像的結合，所述系統(tǒng)能夠自動獲取細胞圖像并使用新的計數(shù)算 法進行處理，以對細胞群體和各種不同細胞類型的活性進行的準確一致的測量。以前已報 道了多種應用，例如免疫細胞、癌細胞、干細胞、昆蟲細胞、脂肪細胞、肝細胞、血小板、藻類 細胞和異質(zhì)性細胞的計數(shù)，GFP轉染的定量，使用臺盼藍或碘化丙啶的活性測定，測量全血 中的WBC。更重要的是，所述方法已被顯示為產(chǎn)生一致的純酵母的濃度和活性測量，在生物 燃料、飲料和烘焙業(yè)中用于質(zhì)量控制。（Nexcelom Bioscience，"使用Oxonol簡單、快速和 一致地測定酵母活性"（Simpe, Fast and Consistent Determination of Yeast Viability using Oxonol)，在 Application Focus:Cellometer Vision 10X, pp. 1-2 中）。
[0021] 本文中公開了 一種新的成像熒光細胞計量方法，其利用Cellometeru Vision (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)，用于在例如來自于運行中的發(fā)酵罐的玉米 糖化醪中確定酵母出芽、濃度和活性。使用本發(fā)明的稀釋緩沖液并用吖啶橙（AO)和碘化丙