研磨方法
【專利說明】研磨方法
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種處理作物籽粒的改進方法，以提供具有高品質(zhì)的適于將淀粉轉(zhuǎn)化 為單糖和寡糖、乙醇、甜味劑等的淀粉產(chǎn)品。另外，本發(fā)明還涉及一種酶組合物并且涉及本 發(fā)明的組合物的用途，該酶組合物包括一種或多種適于本發(fā)明的方法的酶活性。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 作為大部分作物（例如玉米、小麥、水稻、高粱大豆、大麥或果殼）籽粒的重要成 分，在可以將淀粉用于將淀粉轉(zhuǎn)化為糖（例如右旋糖、果糖）、醇（例如乙醇）和增甜劑之 前，必須使淀粉可供使用并以一種提供高純度淀粉的方式加以處理。如果淀粉包含多于 0.5%的雜質(zhì)（包括蛋白質(zhì)），則它不適于作為淀粉轉(zhuǎn)化工藝的起始材料。為了從作物籽粒 開始提供這樣的純的且高品質(zhì)的淀粉產(chǎn)品，通常研磨籽粒，如將在下文進一步所描述。
[0006] 通常使用濕磨將玉米籽粒分離為其四種基本組分：淀粉、胚芽、纖維以及蛋白質(zhì)。
[0007] 典型地，濕磨方法包括四個基本步驟。首先，將籽粒浸泡或浸漬約30分鐘至約48 小時，以開始使淀粉和蛋白鍵斷裂。該方法的下一步驟涉及粗磨，以破壞果皮并使胚芽與剩 余的籽粒分離。剩余的漿液由纖維、淀粉和蛋白質(zhì)組成，將其細磨并篩選，以將纖維與淀粉 和蛋白質(zhì)分離。在水力旋流器中將淀粉與剩余的漿液分離。然后，可以將淀粉轉(zhuǎn)化為糖漿 或醇，或干燥并銷售為玉米淀粉，或用化學(xué)方法或物理方法修飾以產(chǎn)生改性玉米淀粉。
[0008] 已經(jīng)表明了酶對濕磨方法的浸漬步驟的用途。已經(jīng)顯示，商業(yè)酶產(chǎn)品 Steepzyine? (可獲得自諾維信公司（Novozymes A/S))適于濕磨方法的第一步驟，即將玉 米籽粒浸泡在水中的浸漬步驟。
[0009] 最近，已經(jīng)研發(fā)了"酶研磨（enzymatic milling) "，這是一種改性濕磨方法，該 方法使用蛋白酶以在玉米濕磨過程中顯著減少總的處理時間并消除了對作為加工劑的二 氧化硫的需求。約翰斯頓（Johnston)等人，谷物化學(xué)（Cereal Chem)，81，第626-632頁 (2004)〇
[0010] US 6, 566, 125披露了一種用于從玉蜀黍獲得淀粉的方法，該方法涉及將玉蜀黍籽 粒浸泡在水中以產(chǎn)生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以產(chǎn)生碾磨的玉蜀黍漿液 并用酶（例如，蛋白酶）孵育該經(jīng)碾磨的玉蜀黍漿液。
[0011] US 5, 066, 218披露了一種研磨谷物（尤其是玉米）的方法，該方法包括清洗谷物， 將谷物浸漬在水中以將其軟化，并且然后用纖維素酶研磨谷物。
[0012] WO 2002/000731披露了一種處理作物籽粒的方法，該方法包括將籽粒在水中浸泡 1-12小時，濕磨浸泡的籽粒并用一種或多種酶（包括酸性蛋白酶）處理籽粒。
[0013] WO 2002/000911披露了一種分離淀粉面筋的方法，該方法包括使研磨淀粉經(jīng)受酸 性蛋白酶。
[0014] WO 2002/002644披露了一種洗滌獲得自研磨方法的淀粉面筋分離步驟的淀粉漿 液的方法，該方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗滌淀粉漿液。
[0015] 仍需要改進用于提供適于轉(zhuǎn)化為單糖和寡糖、乙醇、甜味劑等的淀粉的方法。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明提供了一種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下步驟：a)將籽粒浸 泡在水中，以產(chǎn)生浸泡的籽粒；b)碾磨這些浸泡的籽粒；c)在有效量的酶組合物的存在下 處理這些浸泡的籽粒，該酶組合物包括：i) 一種蛋白酶以及ii) 一種纖維素分解組合物，其 中在步驟b)之前、過程中或之后進行步驟c)。
[0018] 在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下 步驟：a)將籽粒浸泡在水中，以產(chǎn)生浸泡的籽粒；b)碾磨這些浸泡的籽粒；c)在有效量的 酶組合物的存在下處理這些浸泡的籽粒，該酶組合物包括：i) 一種蛋白酶，ii) 一種纖維素 分解組合物，該纖維素分解組合物包括1) 一種纖維素酶或一種半纖維素酶，和2) -種GH61 多肽，并且其中在步驟b)之前、過程中或之后進行步驟c)。
[0019] 在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于處理作物籽粒的方法，該方法包括以下 步驟：a)將籽粒浸泡在水中，以產(chǎn)生浸泡的籽粒；b)碾磨這些浸泡的籽粒；c)在有效量的 酶組合物的存在下處理這些浸泡的籽粒，該酶組合物包括：i) 一種蛋白酶以及ii) 一種纖 維素分解組合物，該纖維素分解組合物包括一種纖維素酶或一種半纖維素酶，其中在步驟 b)之前、過程中或之后進行步驟c)，并且其中該蛋白酶以約10% w/w至約65% w/w的酶蛋 白的總量的范圍存在。
[0020] 在一個實施例中，本發(fā)明提供了 GH61多肽用于增強一種或多種酶的濕磨益處的 用途。
[0021] 發(fā)明詳細說明
[0022] 因此，本發(fā)明的目的在于提供處理作物籽粒的改進方法，以提供具有高品質(zhì)的淀 粉。
[0023] 在一個實施例中，有用于本發(fā)明的方法的酶組合物提供以下益處，包括改進淀粉 產(chǎn)量和/或純度，改進面筋品質(zhì)和/或產(chǎn)量，改進纖維、面筋或浸漬水過濾、脫水和蒸發(fā)，更 容易地分離胚芽和/或更好的糖化后過濾及其過程能源節(jié)約。
[0024] 不希望受理論約束，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白酶例如通過使二硫鍵破裂而在淀粉 與蛋白質(zhì)（來自纖維、淀粉和蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)）的相互分離中起更多作用。使用蛋 白酶產(chǎn)生更純的淀粉和更純的面筋級分，而使用纖維素酶和半纖維素酶有助于從纖維級分 中分離淀粉和蛋白質(zhì)復(fù)合體，從而產(chǎn)生干凈得多的纖維和更高的淀粉和面筋或研磨淀粉產(chǎn) 量。上述半纖維素酶和/或纖維素酶之一與上述蛋白酶之一的組合帶來特別的組合益處。 在一些實施例中，有用于本發(fā)明的方法的酶共混物提供協(xié)同效應(yīng)。
[0025] 此外，諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，由于將淀粉和蛋白質(zhì)兩個級分都與纖維 級分更好地分離，根據(jù)本發(fā)明的酶共混物提供了最佳減少的纖維質(zhì)量和蛋白含量最低的纖 維。將淀粉和面筋與纖維分離對于工業(yè)而言是有價值的，因為纖維是濕磨方法中價值最低 的產(chǎn)品，并且較高純度的淀粉和蛋白質(zhì)是令人希望的。
[0026] 出人意料地，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，替換酶組合物中的一些蛋白酶活性可以提供 優(yōu)于僅主要包含蛋白酶活性的另外的類似組合物的改進。這例如可以在成本和易用性的基 礎(chǔ)上為工業(yè)提供益處。
[0027] 酶的宙義
[0028] β-葡糖苷酶：術(shù)語"β-葡糖苷酶"意指一種β-D-葡糖苷葡糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原性β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β -D-葡萄糖。出于本 發(fā)明的目的，根據(jù)文丘里（Venturi)等人，2002,來自嗜熱毛殼菌嗜糞變種的胞外β-D-葡 糖苷酶：產(chǎn)生、純化以及一些生物化學(xué)特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production, purification and some biochemical properties)，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志（J. Basic Microbiol.) 42:55-66 的程序，使 用對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷作為底物來測定β -葡糖苷酶活性。一個單位的β -葡 糖苷酶定義為在25°C、pH 4. 8下，在含有0. 01 % TWEEN? 20的50mM檸檬酸鈉中從作為 底物的ImM對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾的對硝基酚根陰離子。
[0029] β -木糖苷酶：術(shù)語" β -木糖苷酶"意指催化短β - (1 - 4)-寡聚木糖的外切水 解，以從非還原末端除去連續(xù)的D-木糖殘基的β -D-木糖苷木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 37)。 出于本發(fā)明的目的，一個單位的β-木糖苷酶定義為在40°C、pH 5下，在含有0.01% TWEEN? 20的IOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-木糖苷每分鐘產(chǎn) 生1. 0微摩爾的對硝基酚根陰離子。
[0030] 纖維二糖水解酶：術(shù)語"纖維二糖水解酶"意指一種1，4-β-D-葡聚糖纖維 二糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91和E.C. 3. 2. 1. 176)，其催化纖維素、纖維寡糖或任何含 β -1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β -D-糖苷鍵水解，從該鏈的還原端或非還 原端釋放纖維二糖（泰里（Teeri)，1997,晶態(tài)纖維素降解：纖維二糖水解酶功能的新 見角軍(Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技術(shù)趨勢（Trends in Biotechnology)15:160_167;泰里等 人，1998,里氏木霉纖維二糖水解酶：為何對晶態(tài)纖維素如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化學(xué)學(xué)會 學(xué)報（Biochem.Soc. Trans. )26:173-1780。根據(jù)里弗（Lever)等人，1972,分析生物化學(xué) (Anal. Biochem. )47:273-279 ;范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,歐洲生化學(xué)會聯(lián)合 會快報（FEBS Letters)，149:152-156 ;范?帝伯赫和克萊森斯（Claeyssens)，1985,歐洲生 化學(xué)會聯(lián)合會快報，187:283-288 ;以及湯美（Tomme)等人，1988,歐洲生物化學(xué)雜志（Eur. J. Biochem.) 170:575-581所描述的程序來測定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，湯美 (Tomme)等人的方法可以用于測定纖維二糖水解酶活性。
[0031] 纖維素分解酶組合物或纖維素酶或纖維素酶制劑：術(shù)語"纖維素分解酶組合物"、 "纖維素酶"或"纖維素酶制劑"意指一種或多種（例如，若干種）水解纖維素材料的酶。 這類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或多種纖維二糖水解酶、一種或多種β-葡糖 苷酶、或其組合。用于測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括：（1)測量總纖維素分解 活性，和（2)測量單獨的纖維素分解活性（內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶以及β-葡 糖苷酶），如在張（Zhang)等人，纖維素酶改進的展望：篩選和選擇策略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies)，2006,生物技術(shù)進展 (Biotechnology Advances)24:452-481中所綜述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼 (Whatman) N2 1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等， 測量總纖維素分解活性。最常用的總纖維素分解活性測定是使用沃特曼N 2 1濾紙作為底物 的濾紙測定。該測定是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC)(高斯（Ghose)，1987,纖維 素酶活性的測量（Measurement of cellulase activities)，純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure Appl. Chem. )59:257-68)確立的。
[0032] 纖維素材料：術(shù)語"纖維素材料"意指含有纖維素的任何材料。纖維素是脫水纖維 二糖的均聚物，并且因此是一種線性β -(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如 具有一系列取代基以復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露 聚糖。盡管纖維素一般為多態(tài)的，但發(fā)現(xiàn)其在植物組織中主要以平行葡聚糖鏈的不溶性晶 體基質(zhì)存在。半纖維素通常氫鍵合至纖維素以及其他半纖維素，這有助于穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。
[0033] 內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶"意指一種內(nèi)切-1，4-(1，3 ;1，4)-β-D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物（如羧甲基纖維素和羥乙 基纖維素）、地衣多糖中的1，4-β -D-糖苷鍵和混合β -1，3葡聚糖如谷物β -D-葡聚糖或 木葡聚糖以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)切水解。可以通過測量 底物粘度的降低或通過還原糖測定所確定的還原性末端的增加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性 (張（Zhang)等人，2006,生物技術(shù)進展（Biotechnology Advances) 24:452-481)。出于本 發(fā)明的目的，根據(jù)高斯（Ghose)，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure and Appl. Chem.) 59:257-268 的程序，在pH 5、40°C下，使用羧甲基纖維素（CMC)作為底物，測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0034] 家族61糖苷水解酶：術(shù)語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根據(jù)亨利薩特（Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 類(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化學(xué)雜志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利薩特B.和貝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分類（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化學(xué)雜志 316:695-696 屬于糖昔水解 酶家族61的多肽。這個家族中的酶最初基于在一個家族成員中測量到的非常弱的內(nèi) 切-1，4-β -D葡聚糖酶活性而被分類為糖苷水解酶家族。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式是不規(guī) 范的，并且它們不能被視為真正的糖苷酶。然而，基于它們在與纖維素酶或纖維素酶的混合 物結(jié)合使用時增強木質(zhì)纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。
[0035] 半纖維素分解酶或半纖維素酶：術(shù)語"半纖維素分解酶"或"半纖維素酶"意指可 對半纖維素材料進行水解的一種或多種（例如，若干種）酶。參見例如，沙洛姆（Shallom)， D.和肖漢姆（Shoham)，Υ.微生物半纖維素酶（Microbial hemicellulases)，微生物學(xué)新見 (Current Opinion In Microbiology)，2003,6 (3) :219-228)。半纖維素酶是在植物生物質(zhì) 的降解中的關(guān)鍵組分。半纖維素酶的實例包括但不限于，乙?；事毒厶酋ッ?、乙?；揪?糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛 酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。這些酶的底物 即半纖維素是支鏈和線性多糖的異質(zhì)群體，這些多糖經(jīng)由氫與植物細胞壁中的纖維素微纖 維鍵合，從而將它們交聯(lián)成一個穩(wěn)固網(wǎng)絡(luò)。半纖維素還共價附接至木質(zhì)素，從而與纖維素一 起形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變結(jié)構(gòu)和組織要求許多酶的協(xié)同作用以使其完全降 解。半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶（GH)，或是水解乙酸或阿魏酸側(cè)基 的酯鍵的碳水化合物酯酶（CE)。這些催化模炔基于它們一級序列的同源性，可以被分配到 GH和CE家族中。具有總體相似的折疊的一些家族可以進一步被分組為以字母標(biāo)記的氏族 (例如，GH-A)。這些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分類可在碳水化合物 活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)數(shù)據(jù)庫中獲得。可以根據(jù)高斯（Ghose)和 比薩拉（Bisaria)，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure&AppI. Chem.) 59:1739-1752,在適合的溫 度（例如50°C、55°C、或60°C )和pH(例如5. 0或5. 5)下測量半纖維素分解酶活性。
[0036] 具有纖維素分解增強活性的多肽：術(shù)語"具有纖維素分解增強活性的多肽"意指促 進具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強的GH61多肽。在一個方面中，使用 在總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組 產(chǎn)生）或總蛋白質(zhì)重量的2%-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶（如WO 2002/095014中所描述 在米曲霉中重組產(chǎn)生）的纖維素酶蛋白負載量存在的情況下CELLUCLAST? 1.5L(諾維 信公司，巴格斯瓦爾德，丹麥）的混合物作為纖維素分解活性的來源。
[0037] 具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過將達到相同的水解程度所需要的纖維 素分解酶的量降低優(yōu)選至少1. 01倍，例如，至少1. 05倍、至少1. 10倍、至少1. 25倍、至少 1. 5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，來增強由具有纖 維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解。
[0038] 蛋白酶：術(shù)語"蛋白水解酶"或"蛋白酶"意指一種或多種（例如，若干種）酶，其 通過水解多肽鏈中將氨基酸連接在一起的肽鍵而分解蛋白質(zhì)的酰胺鍵。
[0039] 木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：術(shù)語"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活 性"意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于測量木聚糖分解活性的兩種基本方法包 括：（1)測量總木聚糖分解活性，和⑵測量單獨的木聚糖分解活性（例如內(nèi)切木聚糖酶、 β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以 及α -葡糖醛酸酯酶）。木聚糖分解酶測定的最近進展總結(jié)于若干出版物中，這些出版物包 括：另U雷（Biely)和普喬爾德（Puchard)，木聚糖分解酶測