一種EphrinB2高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及EphrinB2高表達(dá)的非癌細(xì)胞的構(gòu)建，特別涉及一 種基于外源重組質(zhì)粒的EphrinB2高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酪氨酸激酶受體（RTK)是一個龐大的家族，在生物體的生命活動中擔(dān)當(dāng)著非常重 要的作用。RTK的胞外區(qū)是結(jié)合配體結(jié)構(gòu)域，配體是可溶性或膜結(jié)合的多肽或蛋白類激素， 包括胰島素和多種生長因子。胞內(nèi)段是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位點(diǎn)。 當(dāng)配體與RTK結(jié)合后，能誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化，導(dǎo)致受體發(fā)生穩(wěn)定的二聚化，二聚化的受體發(fā) 生磷酸化，在受體激酶區(qū)內(nèi)形成含有磷酸化酪氨酸位點(diǎn)的基序，并伴有PTK的激活。酪氨酸 特異的磷酸化使激酶區(qū)穩(wěn)定在激活的構(gòu)象，并為下游含有src癌基因家族SH2區(qū)和結(jié)合磷 酸化酪氨酸的功能區(qū)（phosphotyrosinebindingdomain,PTB)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子提供識別、 ?？亢徒Y(jié)合的部位。PTK通過啟動細(xì)胞內(nèi)的信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、運(yùn)動、變形和代 謝等，導(dǎo)致多種效應(yīng)。
[0003]Eph是屬于目前已知最大的蛋白酪氨酸激酶受體家族（RTKs)亞族，包括Eph受體 及其Ephrin配體。EphB4與EphrinB2在信號傳遞時表現(xiàn)出獨(dú)特的方式，可互被對方激活， 產(chǎn)生"正向信號"和"反向信號"，以EphrinB2激活EphB4等信號通路為正向信號；而EphB4 激活EphrinB2為反向信號。EphB4/EphrinB2及其獨(dú)特的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎參與血管生長 的每個方面。EphrinB2可能在VEGF信號通路中扮演一個總調(diào)控者的角色，并在血管生長中 發(fā)揮核心作用。Eph/Ephrin家族是受體酪氨酸激酶家族中的最大亞族，根據(jù)配體結(jié)構(gòu)不同 分為兩種亞型：固定于胞膜上的稱為EphrinA亞型，共5種；而3種B亞型的Ephrin配體則 屬于跨膜蛋白（Cell，1997, 90(3) :403-404)。根據(jù)同源序列將Eph受體也分為兩組：EphA 和EphB受體。Eph受體由跨膜域、細(xì)胞外配體識別域和半胱氨酸域組成，半胱氨酸域中含 有一個位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)的PDZ結(jié)合域；Eph跨膜蛋白位于細(xì)胞外負(fù)責(zé)識別細(xì)胞環(huán)境中信號的 結(jié)構(gòu)域可以與Ephrin發(fā)生作用，形成多聚體的形式，因而導(dǎo)致Ephrin配體和Eph受體的活 化，從而影響細(xì)胞相互作用及細(xì)胞迀移等功能（CurOpiniCellBio, 2010, 22:611-616)。 [0004] 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，腫瘤才 能迅速生長，并進(jìn)一步向周圍浸潤和進(jìn)入血液循環(huán)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而Eph/Ephrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是 胚胎生長、血管生長和發(fā)生過程的重要細(xì)胞形態(tài)學(xué)調(diào)控因素，Eph/Ephrin家族中的數(shù)個配 體和受體已經(jīng)證實(shí)參與了腫瘤生長過程（CancerCell, 2010, 17:533-534)。
[0005] 創(chuàng)新藥物研宄與開發(fā)是國家科技計(jì)劃中的重大研宄領(lǐng)域，抗腫瘤藥物靶向篩選是 新藥篩選的一個重要方向和領(lǐng)域。目前，尋找靶標(biāo)開發(fā)抗腫瘤藥物己成為治療惡性腫瘤生 長和轉(zhuǎn)移的重要手段之一。在腫瘤細(xì)胞抑制劑的研發(fā)中，尚沒有對EphrinB2有一定的抑制 作用藥物。以EphrinB2為祀點(diǎn)，尋找祀向于腫瘤中EphrinB2的藥物會成為研發(fā)抗腫瘤藥 物的重要途徑之一。目前對EphrinB2基因的研宄較多，但對全長序列EphrinB2載體的構(gòu) 建及生物學(xué)應(yīng)用研宄及其應(yīng)用未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種EphrinB2高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用，在構(gòu) 建EphrinB2全長基因的表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得穩(wěn)定、高表達(dá)EphrinB2 分子的重組HEK293細(xì)胞株，能夠用于以EphrinB2為靶點(diǎn)的藥物的篩選。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] 一種EphrinB2高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞，該重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體是包含EphrinB2全長基因的表達(dá)載體。
[0009] 所述的EphrinB2全長基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示。
[0010] 所述的包含EphrinB2全長基因的表達(dá)載體是pEZ-M61-EphrinB2,其中 pEZ-M61-EphrinB2是將EphrinB2全長基因克隆到載體pEZ-M61中。
[0011] 所述的pEZ-M61-EphrinB2的引物序列為：
[0012] 上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
[0013] 下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC_3。
[0014] EphrinB2高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞在以EphrinB2為靶點(diǎn)的藥物篩選中的應(yīng)用。
[0015] 所述的以EphrinB2為祀點(diǎn)的藥物為能夠與受體EphB4-Fc結(jié)合的藥物。
[0016] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0017] 1、本發(fā)明提供了一種EphrinB2高表達(dá)的重組細(xì)胞，在構(gòu)建EphrinB2全長基因 的表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得穩(wěn)定、高表達(dá)EphrinB2分子的重組HEK293 細(xì)胞。與現(xiàn)有只含EphrinB2胞外區(qū)或部分基因序列構(gòu)建的重組細(xì)胞相比，本發(fā)明構(gòu)建的 包含EphrinB2基因全長的重組HEK293細(xì)胞膜能夠穩(wěn)定的表達(dá)EphrinB2分子，最高表達(dá) EphrinB2受體量較轉(zhuǎn)染前提高29. 3倍，而且具有完整的分子活性。
[0018] 2、作為宿主細(xì)胞的HEK293細(xì)胞為原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒（Ad5)DNA的永 生化細(xì)胞，該細(xì)胞本身含有的各種受體表達(dá)量相對較低；而本發(fā)明提供的重組J1EK293細(xì)胞 的EphrinB2配體的相對表達(dá)量比HEK293明顯增高，相對于其他細(xì)胞表面分子占據(jù)表達(dá)優(yōu) 勢地位，在結(jié)合其受體方面處于有利地位；這樣就大大提高了篩選以EphrinB2為靶點(diǎn)藥物 的靈敏性及特異性；同時能夠?yàn)檫M(jìn)一步研宄EphrinB2生物學(xué)特性以及發(fā)現(xiàn)功能蛋白的有 效性提供較好的細(xì)胞模型。
[0019] 3、在腫瘤細(xì)胞抑制劑的研發(fā)中，尚沒有靶向于EphrinB2的藥物。因此運(yùn)用構(gòu)建的 重組HEK293細(xì)胞對上市的索拉菲尼和達(dá)沙替尼藥物進(jìn)行了細(xì)胞抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在一定濃 度下達(dá)沙替尼對重組HEK293細(xì)胞有良好的抑制作用，表明本發(fā)明提供的重組HEK293細(xì)胞 可以應(yīng)用以EphrinB2為靶點(diǎn)的藥物篩選。
【附圖說明】
[0020] 圖1是pEZ-M61-EphrinB2載體的質(zhì)粒圖譜；
[0021] 圖2是DMEM培養(yǎng)基加G418篩選陽性細(xì)胞的培養(yǎng)圖；其中a是對照組HEK293細(xì) 胞，b是重組HEK293細(xì)胞，c是重組HEK293細(xì)胞的熒光圖；
[0022] 圖3是重組HEK293細(xì)胞的EphrinB2表達(dá)水平的RT-PCR檢測圖；其中1為重組 HEK293細(xì)胞，2為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，3為未轉(zhuǎn)染的對照組HEK293細(xì)胞；
[0023] 圖4是重組HEK293細(xì)胞經(jīng)提取RNA、反轉(zhuǎn)錄和PCR后瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳 道1為Marker，泳道2為轉(zhuǎn)染pEZ-M61-EphrinB2的重組HEK293細(xì)胞，泳道3為未轉(zhuǎn)染的 HEK293細(xì)胞，泳道4為轉(zhuǎn)染空載體的HEK293細(xì)胞；
[0024] 圖5是在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白定性鑒定EphrinB2在重組HEK293 細(xì)胞中的表達(dá)圖；其中a為對照組HEK293細(xì)胞，b為重組HEK293細(xì)胞；
[0025] 圖6是重組HEK293細(xì)胞與EphrinB2的受體EphB4的結(jié)合圖；
[0026] 圖7是WesternBlot檢測重組HEK293細(xì)胞的EphrinB2表達(dá)量圖；其中1為重組 HEK293細(xì)胞，2為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，3為未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞；
[0027] 圖8是MTT實(shí)驗(yàn)檢測達(dá)沙替尼對重組HEK293細(xì)胞的抑制作用并繪制的量效曲線 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0029] 本發(fā)明首先構(gòu)建了EphrinB2全長基因的真核表達(dá)載體pEZ-M61-EphrinB2,其基 因測序結(jié)果與基因庫人EphrinB2-致，pEZ-M61-EphrinB2載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞， 經(jīng)過篩選獲得了穩(wěn)定、高表達(dá)EphrinB2分子的重組HEK293細(xì)胞，即重組HEK293-EphrinB2 細(xì)胞。下面對本方面做詳細(xì)說明是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0030]a?本發(fā)明是以pEZ-M61_EphrinB2為基礎(chǔ)載體（GeneCopoeia公司），引物序列如 下：
[0031] 上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
[0032]