專利名稱：在雙水相系統(tǒng)中分離重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離具有膽堿結(jié)合多肽序列的多肽或融合蛋白的方法，此膽堿結(jié)合多 肽序列表現(xiàn)出的對水溶性聚合物的親和性之外，還決定了多肽或融合蛋白在雙水相系統(tǒng)中 的不對稱分布，其中一相富含所述聚合物。該方法可從細胞提取物的復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中 以簡單方法快速分離融合蛋白，所述簡單方法可以用來純化目的多肽或蛋白。純化方法包 括一個或多個洗滌步驟，通過在系統(tǒng)中添加親和多肽的天然配體，完成融合蛋白的分布反 轉(zhuǎn)。應(yīng)用本發(fā)明的發(fā)明領(lǐng)域因此包括生物技術(shù)目的的，以及工業(yè)、農(nóng)藝學(xué)、生物醫(yī)學(xué)中治療 或診斷目的的，或生命科學(xué)領(lǐng)域中作為研究工具和分析目的的多肽和蛋白的生產(chǎn)、分離以 及最終純化。
現(xiàn)有技術(shù)將酶固定化在固態(tài)支持物中是作為色譜技術(shù)純化酶以及建造酶反應(yīng)器用于進行所有類型的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的常規(guī)方法(Mosbach, K.，ed. Immobilized Enzymes and Cells Part B. Methods in Enzymology. Vol. 135. 1987)。為此已經(jīng)開發(fā)了種類繁多的共價或非共 價的固定化系統(tǒng)。在特定情況下，使用具有能夠與固態(tài)支持物強大而特異性相互作用的親 和多月太或“標(biāo)簽”的目的融合蛋白(Uhlen，M.，et al. ,Fusionproteins in biotechnology. Curr Opin Biotechnol,1992. 3(4) :p. 363-9 ；ffaugh,D. S. ,Making the most of affinity tags. TrendsBiotechnol，2005. 23 (6) :p. 316-20)。然而，用將酶固定化在固態(tài)基質(zhì)中經(jīng) 常導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)和功能水平上的改變。因此，例如，支持物的理化特點能夠影 響底物擴散到酶相，或產(chǎn)物到流動相，造成酶的動力學(xué)常數(shù)的變化，在很多時候這意味著 生產(chǎn)效率降低，而在任何情況下對設(shè)定需要做昂貴的研究。另一方面，工業(yè)應(yīng)用級別的 色譜方法涉及一系列技術(shù)難點，基本上由材料的可壓縮性和需要在柱子中應(yīng)用高壓所造 成的。因此，最近正在開發(fā)新的解決方法作為固態(tài)材料的替代品。于是，雙水相系統(tǒng)通 過兩種結(jié)構(gòu)上不同的聚合物的特定溶液混合或一種聚合物(通常為聚乙二醇或稱PEG) 禾口高濃度的鹽混合而自發(fā)產(chǎn)生(Johansson, H. W. a. G.，ed. Aqueous Two-PhaseSystems. Methods in Enzymology. Vol. 228. aquas, New approachesto aqueous polymer systems Theory, thermodynamics andapplications to bimolecular separations. Pure and AppIiedChemistry,1995. 67(6) :p. 955-962 ；Andrews,B. A. ,A. S. Schmidt,and J. A. aqueos Biotechnol Bioeng，2005. 90 (3) :p. 380-90)。雙相出現(xiàn)后不久，即達到平衡。在兩種 聚合物的混合物中，每相富集兩種聚合物中的一種，而在聚合物-鹽系統(tǒng)中，一相富含 聚合物，另一相富含鹽。已經(jīng)對這些混合物的理化特性進行了廣泛研究(Cabezas，H.， Jr. , Theory of phase formation in Aqueous Two-Phase Systems. J Chromatogr B Biomed Appl，1996. 680(1-2) :p. 3_30)，并且已經(jīng)建立用來顯示引起相分離的每一種化 合物的濃度范圍的雙結(jié)點圖。名為“結(jié)線”的線指示每個聚合物在每個相中的最終濃 度，一旦分離，也就是每個相的相對體積(Johansson，H. W. a. G.，ed. AqueousTwo-Phase Systems. Methods in Enzymology. Vol. 228. 1994) 雙水相系統(tǒng)在生物材料分離上有_ 弓雖；^的 IS ffi 生(Hustedt, H. ， K. H. Kroner, and Μ. R. Kula, Applications of phase partitioning inbiotechnology. ， in Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems theory, methods uses and applications in biotechology，H. Walter, D. E. Brooks, and D. Fisher，Editors. 1985，AcademicPress Orlando, FL, . p. 529-587 ；Persson，J.，et al. ， Purification of recombinant and human apolipoprotein A-I usingsurfactant micelles in Aqueous Two-Phase Systems :recycling ofthermoseparating polymer and surfactant withtemperature-induced phase separation.Biotechnol Bioeng， 1999.65(4) :p. 371-81)。它們具有例如高生物相容性，低表面張力(使生物分子降解最小 化)，裝料和產(chǎn)出的容量大，很容易擴大規(guī)模等幾個優(yōu)點(Albertsson，P. A. ,Partition of cell particles andmacromolecules. 1986, New York :ffiley ；Walter, H. , G. Johansson, and D.E. Brooks, Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems :recent results. Anal Biochem，1991. 197(1) :p. 1—18)。在酶催化過程中，酶相和其他相的物質(zhì)傳輸(底 物和產(chǎn)物)遠遠超過當(dāng)酶被吸收在固相表面。此外，這是一個經(jīng)濟的系統(tǒng)，因為可以控制 很多因素來提高目標(biāo)分子的分配。蛋白質(zhì)在雙相之間的分配取決于幾個因素，例如電荷、 目標(biāo)蛋白質(zhì)的大小以及疏水性，而疏水性通常很難預(yù)測。事實上，市場上這些系統(tǒng)的主要 功能受限于對蛋白質(zhì)分配的預(yù)測能力低下。然而，應(yīng)用融合至目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和多肽或 “標(biāo)簽”能夠以 更加可控的方式誘導(dǎo)蛋白進入一個或另一個相中，這命名為雙水相系統(tǒng)中 通過親和力的分離。曾有報道形容應(yīng)用已知的六聚組氨酸“標(biāo)簽”得到很有前景的結(jié)果 (Chung，B. H.，D. Bailey, and F. H. Arnold, Metal affinity partitioning.，in Aqueous Two-Phase Systems, H.W. a.G.Johansson，Editor. 1994.p. 167-277 ；Birkenmeier， G. ， et al. ， Immobilized metal ion affinity partitioning， a methodcombining metal-protein interaction and partitioning ofproteins in Aqueous Two-Phase Systems. J Chromatogr，1991. 539 (2) :p. 267-77)。在此系統(tǒng)中，能將大部分六聚組氨 酸尾部的蛋白融合富集于含事先用金屬離子以共價方式衍生的PEG相中。同樣，在通過 親和力的這種分配方法中也研究了酪氨酸序列(Fexby, S.，etal.，Partitioning and characterization of tyrosine-taggedgreen fluorescent proteins in aqueous two-phase systems. Biotechnol Prog, 2004. 20(3) :p. 793-8)或者色氨酸(Collen，Α·， et al. , Genetic engineering of the Trichoderma reeseiendoglucanase I (Cel7B)for enhanced partitioning in AqueousTwo-Phase Systems containing thermoseparating ethyleneoxide—propylene oxide copolymers. J Biotechnol,2001.87 (2) :p. 179-91)。
膽堿結(jié)合模塊(CBMZcholine-binding modules”)構(gòu)成的多肽家族是名為 膽堿結(jié)合蛋白(CBP，“choline-binding proteins)的成員之一，它在各種微生物中廣 泛存在(Swiatlo，Ε. and e· al·，Choline-binding proteins.，in The Pneumococcus， Ε.I.Tuomanen, T. J. Mitchell，and D.A. Morrison，Editors. 2004，AmericanSociety for Microbiology Washington, DC. p. 49-60)。CBM由非常保守的大約20個氨基酸的重復(fù)序列 組成(CBR 或稱膽堿結(jié)合重復(fù)；code Pfam PF01473 :http://www. Sanger, ac. uk//cRi~bin/ Pfam/Retacc ？ PF01473)，并形成環(huán)-折疊-β 類型的結(jié)構(gòu)(Fernandez-Tornero，C.，et al. ， A novelsolenoid fold in the cell wall anchoring domain of thepneumococcal virulence factor Lyt A. Nat Struct Biol,2001. 8(12) :p. 1020-4 ；Hermoso, J. A.,et al. ， Insights intopneumococcal pathogenesis from the crystal structure of themodular teichoic acid phosphoryIcholine esterase Pee. NatStruct Mol Biol,2005. 12(6) :p. 533-8 ；Hermoso, J. A.，et al.，Structural basis for selective recognition of pneumococcal cellwall by modular endolysin from phage Cp-I. Structure, 2003. 11 (10) :p. 1239-49)。兩個連續(xù)的CBR構(gòu)成膽堿的結(jié)合位點。CBM對 膽堿和膽堿結(jié)構(gòu)類似物的親和力(Sanz, J.M·，R. Lopez, and J. L. Garcia，Structural requirements of choline derivatives for' conversion' of pneumococcal amidase. A new single-stepprocedure for purification of this autoIysin· FEBS Lett， 1988. 232(2) :p. 308-12)使得能夠建立具有這些CBM中的一些的融合蛋白純化的有效系 統(tǒng)(Sanchez-Puelles, J. M.，et al.，Immobilizationand single-step purification of fusion proteins usingDEAE-cellulose. Eur J Biochem，1992· 203(1-2) :p·153-9)。基 本上，所述方法包括將含有融合蛋白的細胞提取物應(yīng)用于叔胺或季胺如二乙基氨基乙醇 (DEAE)的衍生支持物上。通過添加競爭性配體，如膽堿，將固定化的保持其功能性的蛋白很 容易地洗脫下來。此方法基于早先的兩個專利(ES 2 032 717和ES200700281)，其中應(yīng)用 酰胺酶LytA的C末端，也稱為LYTAG。此方法的優(yōu)點中，值得注意的是這個系統(tǒng)是高度特 異性的，并且其使用來源廣泛的商業(yè)可得的各種支持物(樹脂，紙，多孔板等等)，很少會不 兼容，并且擁有所有必要的元素用于有效升級到工業(yè)水平的生物反應(yīng)器，譬如使用經(jīng)濟的 化合物(支持物，膽堿等等)，還有無毒以及無相關(guān)的環(huán)境危害。本發(fā)明的目的包括在雙水 相系統(tǒng)中分配具有LYTAG結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的實驗方法，這種分配能夠通過添加膽堿來調(diào) 控。這將使純化融合蛋白成為可能，并擴大其應(yīng)用，在此情況下LYTAG模塊在其當(dāng)前配置作 為親和“標(biāo)簽”應(yīng)用于固 相親和層析方法中。此外本方法能夠擴展到任何類似LYTAG的結(jié) 構(gòu)家族的膽堿結(jié)合模塊。發(fā)明_既述本發(fā)明的目的是在溶液中分配和純化含有膽堿結(jié)合多肽模塊的融合蛋白的方 法，基于應(yīng)用雙水相系統(tǒng)，其中主要化合物自動分配到雙相中，其中一相富含對膽堿結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(CBD)有親和力的可溶性聚合物，另一相富含其他聚合物或其他的鹽。本方法如 下圖1中顯示，它基本上包括孵育的水性提取物，其得自過量表達具有至少融合一個膽堿 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)融合蛋白的細胞培養(yǎng)物，以及適當(dāng)濃度和比例的雙相系統(tǒng)的組分，以利 于在兩個不同的相中分離混合物。由于CBD對其中一相中的溶解的聚合物具有親和力， 相分離后，融合蛋白優(yōu)先地定位于富含此聚合物的相中，以這種方式有可能移除對立相 (oppositephase)，在其中優(yōu)先地分布著提取物的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。然后向富集具有CBD 親和聚合物的相添加與棄去相(rejected phase)組分一致的溶液體積，攪拌混和后重新分 離成雙相。這樣的洗滌過程重復(fù)所需次數(shù)，直到移除的相中達到最低數(shù)量的污染性蛋白質(zhì)。 此時，最后一次替換棄去相的相應(yīng)溶液，但這次含有的膽堿終濃度足以反轉(zhuǎn)膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu) 域與特定聚合物的結(jié)合，膽堿與聚合物競爭與蛋白質(zhì)的結(jié)合并替換蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)從聚 合相轉(zhuǎn)移到對立相，因此最后一次混合以及相分離后，含有鹽或另一種聚合物的相含有高 純度的融合CBD的蛋白。本發(fā)明方法的對象優(yōu)選地包括使用PEG(3_15% )和磷酸鉀(5_15% )，例如分別為 15%和12.5%。另一優(yōu)先的配置是用其他磷酸、硫酸或檸檬酸鹽替代磷酸鉀，它們也具有高水溶性并能夠分離雙相。已經(jīng)證明有效的PEG的分子量范圍包括PEG-6000到PEG-20000， 而優(yōu)先的配置為使用PEG-8000 (后面將簡寫為PEG)。另外優(yōu)選的配置包括使用PEG (3-15% )和葡聚糖(5_10%，例如6% )形成雙相， 其能夠在20mM Tris-HCl，pH8.0的緩沖液中進行相分離。另一優(yōu)選的配置是用葡聚糖的衍 生物或者結(jié)構(gòu)類似淀粉的多糖及其衍生物替代葡聚糖。根據(jù)所選系統(tǒng)，離心收集來自微生物培養(yǎng)物的細胞，如果用PEG/磷酸鹽系統(tǒng)純 化，將其優(yōu)選地重懸于20mM，pH8. 0的磷酸鉀緩沖液，如果用PEG/葡聚糖系統(tǒng)，優(yōu)選地重懸 于20mM，pH8. 0的Tris-HCl緩沖液。用超聲波裂解細胞后，離心所得粗提物以去除細胞殘 渣，向獲得的上清液中添加所需量的PEG和磷酸氫二鉀或者PEG和葡聚糖，直到濃度和比例 達到系統(tǒng)要求。短時輕輕搖動溶液使其分離成雙相，或者通過離心混合物來加速此過程。做 下一步之前，可以通過聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析，或用識別膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 抗體的免疫方法，驗證上面的一相，也就是兩種系統(tǒng)中富含PEG的相，是否存在含有CBD的 融合蛋白。接下來，根據(jù)所使用的系統(tǒng)，使用吸管或頃析漏斗(decantation funnel)去除 富含磷酸鹽或葡聚糖的下相，然后向混合物添加與去除的相相同的體積，其濃度依賴于所 使用系統(tǒng)的雙相分離圖譜(Johansson, H. W. a. G.，ed. Aqueous Two-PhaseSystems. Methods in Enzymology. Vol. 228. 1994)以及所使用試劑的最初濃度，以維持相分離和它們的相對 體積。重復(fù)數(shù)次上述洗滌過程后，可以選擇使用富含目標(biāo)蛋白質(zhì)的上相或者包括最后一步 用相同組分但包含膽堿的溶液替換下相。一旦混合溶液并形成新的雙相特色的系統(tǒng)，融合 CBD的蛋白優(yōu)先地以高純度富集在下相。本文所述發(fā)明代表了使用色譜固相支持物純化重 組表達的蛋白的替代。發(fā)明詳述本發(fā)明的目標(biāo)方法的開發(fā)起始于下述事件的認知聚合物聚乙二醇(PEG)， 常規(guī)應(yīng)用于雙水相系統(tǒng)，它與膽堿結(jié)合蛋白如乙酰膽堿酯酶相互作用，并以特定方式 插入膽堿的識別位點，從而在高濃度下成為此酶的抑制劑(Koellner，G.，et al., A neutral molecule in acation—binding site :specific binding of a PEG-SH toacetylcholinesterase from Torpedo californica. J Mol Biol,2002. 320 (4) p. 721-5)。膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為來自肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)蛋白LytA的羧基端 (C-LytA)，噬菌體Cp-I的溶菌酶CPLl，或者通常來源各種微生物的CBM家族的任何膽堿結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(專利 ES2032717 ；Swiatlo, E. and e. al. , Choline-bindingproteins. , in The Pneumococcus,Ε. I. Tuomanen, Τ. J. Mitchell, and D. A. Morrison,Editors. 2004,American Society forMicrobiology Washington, DC. p. 49-60)，含有與膽堿有天然親和力的并在結(jié) 構(gòu)和功能上有重復(fù)性的序列。本發(fā)明根據(jù)PEG和膽堿之間的相似性而具有和膽堿的結(jié)合結(jié) 構(gòu)域相互作用的能力。這可以通過對此聚合物中存在的LYTAG結(jié)構(gòu)域(源自C-LytA)的 圓二色性分析驗證PEG和膽堿的等效性。在不含膽堿以及pH7的水性介質(zhì)中，蛋白LYTAG是部分變形的(Maestro, B. and J. Μ. Sanz, Accumulation ofpartly folded states in the equilibrium unfolding of thepneumococcal choline—binding module C-LytA. Biochem J, 2005. 387 (Pt 2) :p. 479-88)。結(jié)果是它的圓二色光譜重復(fù)性差，并且依賴于 樣品的保存時間和對樣品的凍融循環(huán)次數(shù)。然而，添加膽堿穩(wěn)定了蛋白，還增加了它的橢 圓性(圖 2A)。根據(jù)與膽堿結(jié)合的 LYTAG 結(jié)構(gòu)(Fernandez-Tornero，C.，et al.，A novelsolenoid fold in thecell wall anchoring domain of the pneumococcal virulence factorLytA. Nat Struct Biol, 2001. 8 (12) :p. 1020-4)，此氨基醇似乎對保護膽堿結(jié)合位 點的疏水區(qū)域是重要的，并且通過最后的叉狀結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)二聚化，事實上很大程度的穩(wěn)定了 該蛋白質(zhì)(Fernandez-Tornero, C.，et al.，A novel solenoid fold in the cell wall anchoringdomain of the pneumococcal virulence factor LytA. Nat StructBiol， 2001.8 (12) :p. 1020-4 ；Usobiaga，P.，et al.，Structuralorganization of the major autolysin from Streptococcuspneumoniae. J Biol Chem，1996· 271 (12) :p· 6832-8)。添力口 10%的PEG能夠產(chǎn)生類似高濃度膽堿的穩(wěn)定化效果的圓二色光譜(圖2A)，表明此配體對 結(jié)合位點有類似的相互作用。通常，蛋白質(zhì)的溶解度在對應(yīng)于其等電點的PH值附近時為最 低，這是由于缺乏凈電荷有助于疏水相互作用介導(dǎo)的分子間凝聚。從這個意義上講，配體結(jié) 合到蛋白質(zhì)能夠遮擋蛋白質(zhì)表面上存在地的疏水區(qū)域，從而增加蛋白質(zhì)在接近其等電點的 PH值的溶解度。正如圖2B所示，在pH值為6. 5到8. O之間的范圍內(nèi)，制備的LYTAG蛋白中 在223納米處的圓二色信號沒有變化，而當(dāng)pH值低于6. O時信號下降，在pH4. 5和5. 5之間 達到最低。在pH5. O的光譜顯示在所有波長(wave longi tude)的信號普遍下降(圖2A)， 與此同時樣品光吸收也下降(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明在這個PH范圍LYTAG的溶解度最低， 產(chǎn)生了蛋白的凝聚，減少了可溶性分子群體，容易產(chǎn)生圓二色信號。這些結(jié)果同蛋白質(zhì)的 理論等電點相符合，所述理論等電點根據(jù)信息學(xué)應(yīng)用程序(http://WWW. embl-Heidelberg. de/cgi/pi-wrapper. pi)計算大約5. 3。添加飽和濃度的膽堿(140mM)誘導(dǎo)LYTAG蛋白在包 括2. 4到8. O之間的pH值范圍內(nèi)鍵橢圓(el印ticity)和穩(wěn)定性普遍增加(圖2A和2B)， 支持了假說，即配體的結(jié)合遮擋了疏水位點，使其不能暴露出來，從而避免了凝聚。另外支 持這一假說是，添加低極性添加物如2%的CHAPS或140mM2，2-二甲基丙醇(DMP)同樣能夠 在PH5.0恢復(fù)圓二色光譜(數(shù)據(jù)未顯示)。在存在10%的PEG時完成這些相同的試驗，所 得的結(jié)果和使用膽堿的情況類似(圖2A和2B)，進一步證實這個假說，即該多聚物與LYTAG 蛋白相互作用，另外行使與它天然配體同等的效力，表明兩種分子可能結(jié)合在相同的蛋白 質(zhì)區(qū)域。這也通過如下事實所證明當(dāng)存有PEG時，LYTAG蛋白喪失保留在DEAE-纖維素柱 子中的能力(數(shù)據(jù)未顯示)，說明由于PEG插入膽堿結(jié)合位點，阻止它或類似物例如DEAE的 結(jié)合。最后，還檢查了 PEG能否仿效膽堿影響LYTAG結(jié)構(gòu)，分析蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，通過跟 蹤223納米處的圓二色信號與溫度函數(shù)關(guān)系(圖3)。缺少配體時，LYTAG源于中間狀態(tài)的 累積而顯示/展開雙相的轉(zhuǎn)變(Maestro,B. and J. Μ. Sanz,Accumulation of partlyfolded states in the equilibrium unfolding of the pneumococcalcholine-binding module C-LytA. Biochem J, 2005. 387 (Pt 2) :p. 479-88)。而存在 150mM 膽堿情況下，避免了中間 狀態(tài)的積累，從而產(chǎn)生了獨特的S型曲線以及熱穩(wěn)定狀態(tài)，這和之前的描述一致(Maestro， B. and J. Μ. Sanz,Accumulation of partly folded statesin the equilibrium unfolding of the pneumococcalcholine-binding module C-LytA. Biochem J,2005. 387 (Pt 2) p. 479-88)。存在PEG的情況下進行類似的試驗，檢查添加此化合物導(dǎo)致了中間效應(yīng)，即中 間狀態(tài)消失了但是在變性溫度下卻沒有變化(圖3)。因此，PEG模擬了膽堿的作用。盡管 研究表明，PEG不能像膽堿那樣誘導(dǎo)相同的構(gòu)象改變，但是它們建立了 CBD對PEG的親和力 是本發(fā)明的基礎(chǔ)之一。 雙水相系統(tǒng)中親和純化LYTAG融合蛋白的通用實驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明根據(jù)表明LYTAG和PEG有相互作用的以前的結(jié)果，并提供實現(xiàn)的實例，其中通過雙水相在蛋白分離系統(tǒng)中應(yīng)用此聚合物，由此開發(fā)了分離含膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的 實驗方法。優(yōu)選的實驗方法基于選擇PEG/磷酸鹽和PEG/葡聚糖的組合用于開發(fā)分離方法。 PEG/磷酸鹽系統(tǒng)能夠在pH 8.0，使不同濃度范圍的PEG(3-15% )和磷酸鉀(5-15%)自動 分離成雙相。其中一相富集了 PEG(上相)而另一相富集磷酸鹽(下相)。含15%PEG和 12. 5%磷酸鹽(pH8. 0)的系統(tǒng)(也稱ExtP緩沖液)表現(xiàn)最好，因為其中雙相體積差別最 小。就PEG/葡聚糖系統(tǒng)而言，此方法包括使用濃度范圍為3-10%的PEG和5-10%的葡聚 糖。和之前的系統(tǒng)一樣，這些濃度范圍使得雙相可以分離，上相富集PEG，下相富集葡聚糖。 優(yōu)選地濃度為在PH 8. 0,20mM Tris-HCl緩沖液中，PEG 6%，葡聚糖6% (也稱為ExtD緩 沖液)，同樣也是因為其中雙相之間體積差別最小。通用的實驗方法總結(jié)于圖1，開始于獲 得過量表達含有至少一個膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選的是LYTAG的融合蛋白的細胞提取物。存 在所需化合物的情況下獲得提取物用于通過離心或重力產(chǎn)生雙相，并能夠在最后用頃析漏 斗取代離心。前述LYTAG對PEG的親和力決定了 LYTAG融合物的定量定位于含有這種聚合 物的上相(詳細例子見下)。一旦進行極端的檢查，經(jīng)過一系列洗滌，其中包括去除下相并 且添加相同體積新鮮溶液，始終保持棄去相的組分一致，因此仍然存在相之間分離。以發(fā)表 在文獻(Johansson, H. W. a. G. , ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology. Vol.228. 1994)中的雙節(jié)點線圖的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對于前述優(yōu)選的配置，新鮮相的組分包括
PEG，16%磷酸鉀，pH8. 0(或稱 WashP 緩沖液)，或者 pH8. 0，20mM Tris-HCl 中的 0.5% PEG, 16%葡聚糖(也稱WashD緩沖液)。經(jīng)過重新混合和相分離后，用WashP或WashD緩沖 液取代下相，重復(fù)此過程直到最后的洗滌(通常2-3輪)。此時，PEG相的蛋白質(zhì)純度已經(jīng) 能夠達到相當(dāng)高。但是向WashP或WashD緩沖液中添加150mM膽堿能有效在配體結(jié)合位點 取代PEG，特異性驅(qū)動融合蛋白到下相，這可以用于將其純化至電泳純。同已有的其他蛋白純化系統(tǒng)相比，本發(fā)明具有幾個優(yōu)點，其中之一是簡單、快速并 且經(jīng)濟的方法，能夠在軟環(huán)境下進行純化。首先，該系統(tǒng)通用性靈活，可應(yīng)用于廣泛的反 應(yīng)物和濃度，允許根據(jù)每個特殊情況的特定需要作調(diào)整。此外，最小化了柱層析中的典型
問題，譬如需要裝載，由過載引起的壓力問題......，并且此方法在任何情況下比使用固
相支持物的方法快速的多而且簡單(圖4)。另一方面，因為沒有有毒組分(如在六聚組 氨酸“標(biāo)簽”的特定情況下的重金屬)，使得雙相系統(tǒng)對環(huán)境友好。從更加技術(shù)性的角度 看，更有效地產(chǎn)生蛋白質(zhì)對親和化合物的吸附性，本系統(tǒng)是溶液中的聚合物而不像基于樹 脂表面的親和支持物。此外PEG與CBD LYTAG的相互作用在寬的pH范圍內(nèi)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的 普遍穩(wěn)定化，這使在PH值遠離中性時應(yīng)用這些純化系統(tǒng)成為可能，避免在酸性pH值下蛋 白質(zhì)和色譜支持物之間的靜電排斥的發(fā)生。因此借助于CBD具有的對PEG和膽堿的雙親 和力，這種親和力似乎是融合蛋白生物物理特性的主要標(biāo)準(zhǔn)，它可以闡明在系統(tǒng)是否存在 膽堿情況下目的融合物的定位。盡管通常來說，PEG/磷酸鹽和PEG/葡聚糖系統(tǒng)似乎優(yōu)選 地適用于通過CBD對LYTAG的親和力分配融合物，至于究竟選擇哪種方案還是要視每個例 子的具體特性(總電荷性、分子大小和疏水性)。這個意義上講，本發(fā)明非常靈活，因為可 以調(diào)整不同的參數(shù)來使系統(tǒng)適應(yīng)于每一個具體融合蛋白和提高產(chǎn)率，如離子力，溫度，PH， 使用洗滌劑......(Johansson, H. W. a. G.，ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods inEnzymology. Vol. 228. 1994)。此外，本發(fā)明設(shè)想還可以用有潛力的替代雙相系統(tǒng)，如上所述
例如PEG/檸檬酸鹽，PEG/硫酸鹽，PEG/淀粉，.......對低溶解度蛋白質(zhì)，可以以體積高進
行提取，從而稀釋樣品并最小化蛋白質(zhì)凝聚和沉淀。最后，本方法能夠整合到生物轉(zhuǎn)化的酶促過程中，其中將酶定位于其中一相(用是否添加膽堿來調(diào)控)，而產(chǎn)物在相對相中積累， 促進純化并最小化產(chǎn)物對酶抑制的風(fēng)險。


圖1.通過親和分配純化LYTAG的融合蛋白。圖2 在20°C以遠紫外光⑶分析pH對LYTAG結(jié)構(gòu)的影響。(A)在pH7. 0 (實心符 號)和pH 5 (空心符號)無添加物(圓形)，存在10% PEG (三角形)或存在膽堿140mM記 錄波長光譜。(B)在無添加物(實心圓)，存在膽堿140mM(方形)和存在10% PEG(空心 圓)情況下，PH滴度以及在223納米處的CD信號。圖3.在無添加物(ο)，存在10% PEG( ·)以及存在膽堿150mM(x)情況下，LYTAG 的熱穩(wěn)定性以及圓二色圖譜。圖4.雙水相和親和層析的純化系統(tǒng)比較圖。圖5.在雙相系統(tǒng)PEG/葡聚糖(左管)和PEG/磷酸鹽(右管)中分配GFP-LYTAG 蛋白，分別用WashD+膽堿和WashP+膽堿緩沖液洗脫，(A)為洗脫前⑶為洗脫后。C)對來 自PEG/磷酸鹽純化的級分進行SDS-PAGE分析。道1，REG-I的粗提物[pALEX2-Ca_GFP]； 道2，分子量標(biāo)簽；道3，純蛋白對照，來自親和層析；道4，洗脫前的上相，富含PEG ；道5，洗 脫前的下相，富含磷酸鹽；道6，洗脫后的上相，道7，洗脫后的下相。圖6.對來自PEG/葡聚糖純化的LYTAG蛋白A的級分進行SDS-PAGE分析。(A) 道1，分子量標(biāo)簽；道2，REG-I粗提物[pX]；道3，洗滌前上相，富含PEG;道4，洗滌前下相， 富含葡聚糖；道5，第一次洗滌后的上相；道6，第一次洗滌后的下相；道7，第二次洗滌后的 上相；道8，第二次洗滌后的下相。(B)，道1，分子量標(biāo)簽，道2，第一次洗脫后的上相；道3， 第一次洗脫后的下相；道4，第二次洗脫后的上相；道5，第二次洗脫后的下相。(C)，對來自 PEG/磷酸鹽純化的級分進行SDS-PAGE分析。道1，分子量標(biāo)簽；道2，REG-I的粗提物[pX]； 道3，洗脫前的上相，富含PEG ；道4，洗脫前的下相，富含磷酸鹽；道5，洗脫后的上相；道6洗 脫后的下相。 圖7.對來自PEG/葡聚糖純化的LYTAG-Lip36的級分進行SDS-PAGE分析。㈧道 1，分子量標(biāo)簽；道2，REG-I的粗提物[pALEXb-Lip36]；道3，洗滌前的上相，富含PEG ；道4， 洗滌前的下相，富含葡聚糖；道5，第一次洗滌后的上相；道6，第一次洗滌后的下相；道7， 第二次洗滌后的上相，道8，第二次洗滌后的下相。(B)，道1，分子量標(biāo)簽；道2，第一次洗脫 后的上相；道3，第一次洗脫后的下相；道4，第二次洗脫后的上相；道5，第二次洗脫后的下 相。圖8.對來自PEG/葡聚糖純化的LYTAG- β -半乳糖苷酶的級分進行SDS-PAGE分 析。道1，分子量標(biāo)簽；道2，REG-1的粗提物[pALEX2C-LaCZ]；道3，洗滌前的上相，富含PEG ； 道4，洗滌前的下相，富含葡聚糖；道5，第一次洗脫后的上相；道6，第一次洗脫后的下相。本發(fā)明實施例實施例1 純化LYTAG-GFP融合物
本實施例顯示如何純化熒光蛋白與CBD結(jié)構(gòu)域，即LYTAG的融合物。對于本發(fā) 明的實現(xiàn)例子，表達該綠色熒光GFP-LYTAG蛋白的融合物是如下進行的通過培養(yǎng)用從 pALEX2-Ca載體(Biomedal)獲得的pALEX2_Ca_GFP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的400毫升大腸桿菌 (E. coli) REG-I 株培養(yǎng)物(Biomedal，Espafia, www. biomedal. com)，于 37°C孵育所述培養(yǎng) 物直到根據(jù)Biomedal的LYTAG “試劑盒”的建議，添加水楊酸至培養(yǎng)基來誘導(dǎo)GFP-LYTAG 蛋白的表達。離心收集細胞并重懸于20毫升pH 8.0，20mM磷酸鉀緩沖液中，在此情況下用 PEG/磷酸鹽系統(tǒng)進行純化；或重懸于pH 8. 0，20mM Tris-HCl中，在此情況下用PEG/葡聚 糖進行純化。超聲波裂解細胞并離心以去除細胞殘余物，向每個等份試樣添加以重量記所 需量的PEG、磷酸鉀或葡聚糖用來重建上面提到的ExtP和ExtD緩沖液。在燒杯里溫和攪拌 溶液(以減少DNA片段以免污染最后的蛋白制備物)，直到兩種化合物完全重懸，然后室溫 12000rpm離心5分鐘(對更敏感的蛋白可在4°C離心)。已證實的LYTAG “標(biāo)簽”對PEG的 特異性親和力決定了兩測試案例中所產(chǎn)生的融合蛋白聚集在富含PEG的相中(上相)(圖 5A)。綠色的上相含有GFP-LYTAG蛋白證實是正確折疊并有功能的。富含磷酸鹽和葡聚糖 的下相保留了大部分細胞蛋白，表明上相中GFP-LYTAG蛋白的純度已經(jīng)非常高了(圖5C)。 在任何情況下，添加膽堿至洗滌緩沖液都會使GFP-LYTAG蛋白洗脫到下相(圖5B和5C)。 值得注意的是，首先，這些圖展示的電泳膠上蛋白移動的不一致是由于高鹽濃度和所使用 的聚合物引起的。盡管洗脫的蛋白質(zhì)不是第一次提取的全部蛋白質(zhì)(圖5C，道6)，用過添 加含有膽堿的新鮮下相來進行隨后的提取，使得回收了系統(tǒng)中存在的大部分GFP-LYTAG融 合蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。具體對本蛋白，能夠驗證PEG/磷酸鹽系統(tǒng)的產(chǎn)率(大約5毫克/ 升培養(yǎng)物)和純度略微高于PEG/葡聚糖系統(tǒng)。實施例2 純化LYTAG-蛋白A融合物本實施例顯示如何通過本發(fā)明純化C-LytA膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域與蛋白A的片段的融 合物，蛋白A來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)并能結(jié)合免疫球蛋白。為實現(xiàn) 這個實施例，遵循與前面實施例對LYTAG-GFP融合物的相同的方法，但是用來自于pALEXb 載體(Biomedal)的pALEXb-ProtA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的REG-I株培養(yǎng)物，應(yīng)用PEG/葡聚糖(圖6A 和6B)，PEG/磷酸鹽(6C)2個系統(tǒng)中的任意獲得良好的純化結(jié)果。同前述例子相同，應(yīng)用葡 聚糖而不是磷酸鹽需要增加洗滌步驟的次數(shù)(本例為2次)。同樣，洗滌后，蛋白LYTAG-蛋 白A以相當(dāng)?shù)募兌缺Ａ粼赑EG相中。類似的，添加含有膽堿的新鮮下相使融合多肽定位于 葡聚糖相中，經(jīng)過數(shù)次洗脫步驟后基本上回收了所有的蛋白質(zhì)。實施例3 純化LYTAG_Lip36融合物和上述幾實施例一致，除了使用來自pALEXb載體(Biomedal)的pALEXb_Lip36質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化的REG-I株培養(yǎng)物。本實施例只在PEG/葡聚糖系統(tǒng)中有效純化。圖7顯示，同樣， 當(dāng)使用該聚合物時，就需要洗滌幾次。產(chǎn)率波動范圍為5-10毫克/升培養(yǎng)物。實施例4 純化LYTAG- β -半乳糖苷酶融合物本實施例采用類似的方法，除了使用來自pALEX2c載體(Biomedal)的 pALEX2c-LacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的REG-I株培養(yǎng)物表達的LYTAG- β -半乳糖苷酶融合物，它證實了 此雙相分配系統(tǒng)能用于純化類似半乳糖苷酶的高分子量蛋白質(zhì)和寡聚物。在此情況 下，有可能，即融合的另一部分的生物物理性質(zhì)對LYTAG而言強過膽堿結(jié)合模塊，因而蛋白 傾向于位于其中一相。在這個意義上，可以檢查可能由于融合蛋白分子量較大遺留在相間隙。盡管如此，正如圖8所示，PEG/葡聚糖系統(tǒng)能夠純化雜合蛋白質(zhì)到可接受的純度。這 樣純化的蛋白質(zhì)保留了對合成底物0-123456鄰硝基苯基半乳糖苷(ONPG)的活性(數(shù)據(jù)未 顯示)，表明其如實施例1描述的GFP-LYTAG融合物一樣，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定折疊充分。實施例5 純化分泌到培養(yǎng)基中的LYTAG融合蛋白本實施例中，本發(fā)明用于純化無論在細菌，酵母菌和其他微生物分泌到培養(yǎng)基中 的重組蛋白。畢赤酵母(Pichia pastoris)具有有效的分泌機制，利用此優(yōu)勢通過例如使用 PPIC9載體(Pichia ExpressionKit, Invitrogen)生產(chǎn)融合至引導(dǎo)肽的目標(biāo)蛋白，而此引 導(dǎo)肽能夠指導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運到細胞外培養(yǎng)基。如果此蛋白再和膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域LYTAG融合，如 用 pPIC9_CLYT 載體(Caubin, J.，et al.，Choline-bindingdomain as a novel affinity tag for purification of fusionproteins produced in Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng,2001. 74(2) :p. 164-71)，就能夠用所述的雙水相系統(tǒng)之一從細胞外培養(yǎng)基進行純 化。為此，用來自PPIC9-CLYT質(zhì)粒的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15株，并表達LYTAG和目的蛋 白的可分泌融合物，酵母株在30°C，BMGY緩沖培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，直到其D0_達到2_6，此 時通過改變碳源將甘油(BMGY培養(yǎng)基)換成0.5%甲醇(BMMY培養(yǎng)基)誘導(dǎo)LYTAG的 融合物的表達。誘導(dǎo)15-24小時后，離心培養(yǎng)物病收獲上清液。其中含有分泌的LYTAG融 合蛋白可直接用到前面實施例中提到的純化系統(tǒng)之一，進行目的蛋白的純化。
同樣，純化培養(yǎng)基中的融合膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白也可以來自于大腸桿菌的細菌 培養(yǎng)物，所述大腸桿菌表達與先導(dǎo)肽融合的融合物L(fēng)YTAG-蛋白或蛋白-LYTAG的融合物，所 述先導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運融合物至周質(zhì)空間或細胞外培養(yǎng)基。實施例6 通過應(yīng)用LYTAG-蛋白A在雙相中純化抗體蛋白A對免疫球蛋白有親和力，此特性可用于通過實施例2所述的雙相系統(tǒng)來純 化抗體。本實施例中，將雙相組分溶解于1毫升含有經(jīng)純化并在PH 8. O的20mM磷酸鹽緩 沖液(在此情況下應(yīng)用PEG/葡聚糖系統(tǒng))中透析的LYTAG-蛋白A (5-10毫克/毫升)的 混合物，以及19毫升表達目的抗體的雜交瘤培養(yǎng)物的上清液。上清液必須在pH8. O的20mM 磷酸鹽緩沖液(在此情況下應(yīng)用PEG/磷酸鹽系統(tǒng))或pH8. O的20mM Tris-HCl緩沖液(在 此情況下應(yīng)用PEG/葡聚糖系統(tǒng))中透析。一旦兩種組分溶解，就按前面的實施例所述條件 進行分離，洗滌和洗脫，最后在下相得到高度純化的蛋白A-抗體復(fù)合物。另外，也可以通過 最后一步調(diào)整有利于融合物L(fēng)YTAG-蛋白A分離的pH條件和離子濃度回收純化的抗體，融 合物L(fēng)YTAG-蛋白A留在富含PEG的相中，并且能夠重復(fù)使用。
權(quán)利要求
用于分配或分離含有對膽堿具有親和力的多肽序列的融合蛋白的方法，其特征在于a)細胞培養(yǎng)物或細胞提取物，其表達含有對膽堿具有親和力的序列的融合多肽，該序列包含至少一個膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)基序(CBR或“膽堿結(jié)合重復(fù)”；代碼Pfam PF01473)，并且其優(yōu)選地來自一個肺炎鏈球菌的酰胺酶LytA的C末端結(jié)構(gòu)域；b)含有水中的超過5％的聚乙二醇(PEG)以及鹽或可溶性聚合物的提取物或培養(yǎng)物的混合物，導(dǎo)致該混合物自發(fā)分離成雙水相；c)含有對膽堿具有親和力的序列的融合多肽優(yōu)先地富集于具有較高聚乙二醇濃度的相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過添加膽堿使融合蛋白富集到與高PEG濃度 相不同的相中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其特征在于二元系統(tǒng)中總PEG濃度為3-15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于二元系統(tǒng)的第二組分包含磷酸鹽、檸檬酸鹽、 硫酸鹽或這三種鹽的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于二元系統(tǒng)的第二組分含有磷酸鉀，其濃度為 5-15%，并且混合物的pH值為6. 0-9. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于二元系統(tǒng)的第二組分含有葡聚糖或衍生物， 其濃度為5-10%，并且混合物的pH值為6. 0-9. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于二元系統(tǒng)的第二組分含有淀粉或衍生物，其 濃度為5-10%，并且混合物的pH值為6. 0-9. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其特征在于二元系統(tǒng)從下列開始形成表達根據(jù)權(quán)利要 求1的含有對膽堿具有親和力的多肽序列的融合蛋白的細胞提取物或培養(yǎng)基，向其中添加 以上權(quán)利要求所述組分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于細胞提取物或培養(yǎng)基來自雜交瘤、霉菌、酵母和 細菌的培養(yǎng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于含有對膽堿具有親和力的肽的融合蛋白優(yōu)先 地聚集于所得雙相系統(tǒng)的富含PEG的相中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于來自細胞提取物或培養(yǎng)基的、未聚集于富含 PEG的相中的蛋白質(zhì)能夠通過棄去富含PEG的相的對立相而被去除。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于隨后添加在組成和體積方面與棄去物等價的 溶液，隨后混合并分離成雙相，以及根據(jù)前一項權(quán)利要求重新去除污染性蛋白質(zhì)，可以重復(fù) 此過程直到足量消除。
13.根據(jù)權(quán)利要求10、11和12的方法，其特征在將含有目的蛋白質(zhì)的富含PEG的相直 接用于獲得純化形式的、含有膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的目的多肽或蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10、11和12的方法，其特征在于將含有目的蛋白的富含PEG的相用 于任何類型的酶反應(yīng)器，所述酶反應(yīng)器具有在水相中催化目的反應(yīng)的功能，從而能夠在不 同于具有較高PEG濃度的相的相中回收產(chǎn)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于洗滌后，添加濃度高于50mM的膽堿的新鮮 溶液，從而導(dǎo)致將顯著部分的含有對膽堿具有親和力的肽的融合蛋白置換至不富含PEG的相。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于將含有目的蛋白的富含PEG的相用于任何類 型的酶反應(yīng)器，所述酶反應(yīng)器具有在水相中催化目的反應(yīng)的功能，從而能夠通過添加高于 50mM的膽堿來回收存留在不富含PEG的相中的生物催化劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于將含有目的蛋白的不富含PEG的相直接用于 獲得純化形式的該蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于將含有目的蛋白的不富含PEG的相取出以為 了其使用，并在系統(tǒng)中替換成一定量的優(yōu)選地在組成和體積方面與取出物類似的溶液，其 后混合并分離成雙相，可以重復(fù)該過程直到從富含PEG的相中足量洗脫出目的蛋白。
19.用于進行根據(jù)權(quán)利要求1-18中一些的蛋白質(zhì)純化方法的產(chǎn)品，其包括以下組分中 的至少一些a._鹽濃度高于5%的溶液b.-PEG濃度高于5%的溶液c.-濃度高于50mM的膽堿濃縮溶液。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18的方法的用途，其用于分離和純化蛋白質(zhì)、多肽或任何蛋白質(zhì) 性質(zhì)的衍生物。
21.權(quán)利要求1-16的方法以及權(quán)利要求的產(chǎn)品的用途，其用于分離由與任何膽堿結(jié)合 結(jié)構(gòu)域相融合的酶介導(dǎo)的生化反應(yīng)的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及為了基于應(yīng)用具有膽堿親和力的多肽，在水溶液中分配、分離和純化重組蛋白的方法。本發(fā)明基于一現(xiàn)象，通過該現(xiàn)象能夠混合含有預(yù)定組分的兩種水性溶液，最終分成不同密度的雙相。融合的蛋白，結(jié)合至上述具有膽堿親和力的多肽的蛋白質(zhì)優(yōu)先地定位于其中一相，而來自細胞提取物的大部分蛋白傾向于移動至另一相。經(jīng)過一系列洗滌操作以去除余下的雜質(zhì)后，通過添加對結(jié)合至目的蛋白質(zhì)的多肽具有親和力的可溶性分子，反轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)的定位。本發(fā)明包括改變目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，從而使得以高效和高純度純化所述蛋白或多肽。本發(fā)明是用于分離優(yōu)選地用膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽的重組蛋白的一種有成本效益的辦法。
文檔編號C07K1/14GK101835790SQ200880112626
公開日2010年9月15日 申請日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者A·塞沃利亞拉米雷斯, B·馬埃斯特羅加西亞-多納斯, I·貝拉斯科翁彼皮雷斯, J·M·桑斯莫拉雷斯, M·阿雷瓦洛羅德里格斯 申請人:生物制藥有限公司