專(zhuān)利名稱：多肽、基質(zhì)、水凝膠以及使用它們進(jìn)行組織再生和修復(fù)的方法
多肽、基質(zhì)、水凝膠以及使用它們進(jìn)行組織再生和修復(fù)的方
法技術(shù)領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及包含新型層粘連蛋白多肽的組合物，更具體涉及 但不唯獨(dú)涉及包含該組合物的基質(zhì)和水凝膠以及使用該組合物的方法。水合凝膠(水凝膠)在生理溫度和pH下是粘稠、半固體物質(zhì)，其可用于組織工程、 再生醫(yī)學(xué)和用作生物材料。例如，水凝膠是從多糖(Coviello等人，2007)如透明質(zhì)酸(例 如使用透明質(zhì)酸與磷酸鈣、殼聚糖、明膠或藻酸鹽的混雜組合)或殼聚糖(例如殼聚糖與層 粘連蛋白肽；Suzuki等人，2003 ；Itoh等人，2005 ；Matzuda等人，2005 ；Ho等人，2005)以及 從合成材料如聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)制備。透明質(zhì)酸基水凝膠為細(xì)胞和組織(如為 神經(jīng)再生)提供生長(zhǎng)支持環(huán)境(Suzuki等人，2003 ;Itoh等人，2005)，同時(shí)指導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)劑和抗 氧化劑的遷移和再生。層粘連蛋白是基膜糖蛋白，其充當(dāng)黏附分子介導(dǎo)細(xì)胞骨架結(jié)合的整聯(lián)蛋白、鈣黏 著蛋白、細(xì)胞黏附分子(CAMs)和胞外基質(zhì)(ECM)組分并與它們相互作用，并支持細(xì)胞遷移、 附著、增殖、分化和存活。用層粘連蛋白修飾的透明質(zhì)酸劑水凝膠被證明能促進(jìn)神經(jīng)突延伸 (Hou等人，2005)。某些層粘連蛋白序列重復(fù)被發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面受體具有生物活性。這些 序列重復(fù)包括IKVAV (SEQ ID NO 1) ^P YIGSR(SEQ IDNO :2)，它們充當(dāng)遷移、再生和生長(zhǎng)的 “導(dǎo)軌”(Tashiro 等人，1989 ；Powell 和 Kleinmann，1997 ；Niece 等人，2003 ；HalImann 等人， 2005)。針對(duì)氧化脅迫的主要防御機(jī)制是超氧化物歧化酶(SOD)，其催化超氧化物陰離子 自由基((V)歧化成過(guò)氧化氫(H2O2)和氧(O2)。包含來(lái)自牛紅細(xì)胞、與透明質(zhì)酸鈉綴合的 SOD的水凝膠被發(fā)現(xiàn)在小鼠中沒(méi)有免疫原性，且顯示出比單獨(dú)的透明質(zhì)酸和SOD高得多的 抗炎活性(Sekurai等人，1997)。另外，還發(fā)現(xiàn)SOD不僅能抑制活性氧中間體(ROS)的誘導(dǎo)， 而且能抑制由機(jī)械脅迫引起的HA解聚作用(Yamazaki等人，2003)。另外的背景技術(shù)包括Hartman JR.，1986 (Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :7142_7146)。發(fā)明概述本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的多 肽。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含多糖和本發(fā)明多肽的組成物。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含透明質(zhì)酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑 的組成物。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含透明質(zhì)酸、超氧化物歧化酶(SOD)和本 發(fā)明多肽的組成物。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含本發(fā)明組成物的基質(zhì)。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含本發(fā)明組成物的水凝膠。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供產(chǎn)生水凝膠的方法，該方法包括將本發(fā)明組 成物懸浮于水中以獲得包含至少80%水的懸浮液，從而產(chǎn)生水凝膠。
本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供誘導(dǎo)組織的離體形成的方法，該方法包括 (a)提供本發(fā)明的基質(zhì)或水凝膠；(ii)用處于適合細(xì)胞的增殖、分化和/或遷移的培養(yǎng)基中 的細(xì)胞接種該基質(zhì)或水凝膠，從而誘導(dǎo)組織的形成。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供誘導(dǎo)組織的體內(nèi)形成的方法，該方法包括將 本發(fā)明的基質(zhì)或水凝膠植入受試者體內(nèi)，從而誘導(dǎo)組織的形成。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供治療具有以組織患病、損傷或損失為特征的 病狀的受試者的方法，該方法包括將本發(fā)明的基質(zhì)或水凝膠植入在受試者的患病、損傷或 損失的組織處或附近，從而誘導(dǎo)組織的形成和治療受試者。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多糖是透明質(zhì)酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，組成物還包含抗氧化劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，抗氧化劑是超氧化物歧化酶(SOD)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，層粘連蛋白多肽為SEQ ID N0:3所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，層粘連蛋白多肽由SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列 組成。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，超氧化物歧化酶包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序 列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，組成物是經(jīng)交聯(lián)的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多糖、抗氧化劑和/或多肽是經(jīng)交聯(lián)的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，透明質(zhì)酸、超氧化物歧化酶(SOD)和多肽是經(jīng)交聯(lián) 的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括將組成物進(jìn)行交聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，交聯(lián)是用選自EDC-N_(3-二甲基(dimenthy)-氨基 丙基(amin0pr0phyl))-N-乙基碳二亞胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平的交聯(lián)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，懸浮液包含至少95%水。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，透明質(zhì)酸以在水凝膠中約0. 5-1. 5%的濃度范圍提{共。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多肽以在水凝膠中約20-100yg/ml的濃度范圍提{共。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，超氧化物歧化酶以在水凝膠中約5_40μ g/ml的濃 度范圍提供。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，基質(zhì)或水凝膠還包含細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，組織是神經(jīng)組織。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞是干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，干細(xì)胞當(dāng)接種在基質(zhì)或水凝膠中時(shí)分化成神經(jīng)元細(xì) 胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，水凝膠為凍干形式。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬技 術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。下文描述的是示例性的方法和/或材料，不過(guò) 與本文所述的這些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施或試驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案。如有沖突，將以本發(fā)明說(shuō)明書(shū)(包括定義在內(nèi))為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例 僅僅旨在說(shuō)明本發(fā)明，并不表示必定限制本發(fā)明。


本文僅以舉例的方式參照以下附圖描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)將具體詳細(xì) 地說(shuō)明附圖，不過(guò)要強(qiáng)調(diào)的是附圖所示的細(xì)節(jié)僅以舉例方式給出，目的是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施 方案進(jìn)行說(shuō)明性討論。這樣，將說(shuō)明書(shū)與附圖相結(jié)合，能使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚明白如何可 以實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案。本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件含有至少一張彩色制作的圖畫(huà)。在提出請(qǐng)求并支付必要費(fèi)用 后，專(zhuān)利局可提供帶彩色圖畫(huà)的本專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)的拷貝。附圖中圖1是現(xiàn)有技術(shù)的示意圖，描繪了超氧化物歧化酶(SOD)同源物的氧化還原活性 位點(diǎn)，該位點(diǎn)包括包圍著催化活性金屬陽(yáng)離子(在這里是銅Cu)的三個(gè)組氨酸殘基(His 26、74和163)和一個(gè)天冬氨酸殘基(Asp 159)。另選的金屬陽(yáng)離子有鋅(Zn)、錳(Mn)和鐵 (Fe)。圖2A-F是各種培養(yǎng)條件下用博迪恩氏膠體銀染色法(圖2A-C)或結(jié)晶紫染色法 (圖2D-F)進(jìn)行染色的原代細(xì)胞的顯微照片。衍自大鼠胚胎(妊娠16-18天)的大腦半球 的原代胎鼠腦細(xì)胞在塑料平皿上在Eagle培養(yǎng)基(補(bǔ)加2mM谷氨酰胺和5mg/ml葡萄糖的 Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基)存在下培養(yǎng)3天，然后用水凝膠[1. 2%透明質(zhì)酸水凝膠(圖2B)或透 明質(zhì)酸超氧化物歧化酶_層粘連蛋白肽(SEQ ID NO 3)水凝膠(圖2C-F)]或用Eagle培 養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，再培養(yǎng)12天后進(jìn)行染色和拍照。圖2A-在Eagle培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)的用 博迪恩氏膠體銀染色法進(jìn)行染色的原代細(xì)胞。注意細(xì)胞為單層，不存在分化細(xì)胞的聚集體 (放大倍數(shù)，xlOO)；圖2B-用1.2%透明質(zhì)酸水凝膠覆蓋和用博迪恩氏膠體銀染色法進(jìn)行 染色的原代細(xì)胞。注意細(xì)胞聚集體(放大倍數(shù)，xlOO)；圖2C-用透明質(zhì)酸-超氧化物歧化 酶-層粘連蛋白肽(SEQ ID NO :3)水凝膠覆蓋和用博迪恩氏膠體銀染色法進(jìn)行染色的原代 細(xì)胞。注意分化的神經(jīng)元細(xì)胞，為典型的神經(jīng)元生長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)合成聚集體和聚結(jié)體，具有密 集的軸突出芽(放大倍數(shù)，x200)。圖2D-F-用透明質(zhì)酸-超氧化物歧化酶-層粘連蛋白肽 (SEQ ID NO 3)水凝膠覆蓋下生長(zhǎng)和用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行染色的原代細(xì)胞。注意具有密集 的軸突出芽的分化神經(jīng)元細(xì)胞。圖2D和E的放大倍數(shù)為x200，圖2F的放大倍數(shù)為x400。圖3是描繪本發(fā)明的新型層粘連蛋白肽的序列(SEQ ID NO 3)的示意圖，該序列 由兩個(gè)分別包含SEQ ID NO :1和2所示的氨基酸序列(以紅色顯示)的五肽(加框表示的 序列)和以下3個(gè)另外的二聚體組成在N末端位置的二聚體(KS)、在兩個(gè)五肽之間的第 二二聚體(RS)和在尾部羧基末端的第三二聚體(CV)。本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及包含新型層粘連蛋白多肽的組合物，更具體涉及 但不唯獨(dú)涉及包含該組合物的基質(zhì)和水凝膠以及使用該組合物進(jìn)行組織形成、再生和/或 修復(fù)的方法。在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上并不一定 局限于以下描述中提出的或?qū)嵤├镜募?xì)節(jié)內(nèi)容。本發(fā)明還能有其他的實(shí)施方案，或者能以多種方式實(shí)施或執(zhí)行。本發(fā)明人在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)設(shè)計(jì)了能夠支持細(xì)胞(如神經(jīng)元細(xì)胞)的增殖、 分化和/或遷移的新型層粘連蛋白多肽(SEQ ID NO :3)。該新型層粘連蛋白多肽包括兩個(gè) 層粘連蛋白五肽IKVAV(SEQ IDNO 1)和YIGSR(SEQ ID NO 2)以及以下三個(gè)被設(shè)計(jì)作為潛 在的交聯(lián)位點(diǎn)的二聚體在N末端位置的二聚體(KS)、在兩個(gè)五肽之間的第二二聚體(RS) 和在羧基末端的第三二聚體(CV)。因此，如下文的實(shí)施例部分所示，本發(fā)明人產(chǎn)生了包含新型層粘連蛋白多肽和抗 氧化劑(超氧化物歧化酶)的多糖(透明質(zhì)酸)_基水凝膠。該水凝膠當(dāng)與干細(xì)胞混合時(shí) 能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞分化(實(shí)施例2和圖2C-F)。相反，沒(méi)有新型層粘連蛋白多肽的透明質(zhì) 酸基水凝膠不能支持神經(jīng)元細(xì)胞分化(實(shí)施例2，圖2B)。另外，用京尼平對(duì)水凝膠組分進(jìn) 行交聯(lián)并沒(méi)有降低水凝膠支持細(xì)胞增殖和分化的能力(實(shí)施例2)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的分離多肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”或“肽”在本文中可互換使用，涵括天然肽(降解產(chǎn)物、合成法合成的 肽或重組肽)和模擬肽(通常為合成法合成的肽)以及作為肽類(lèi)似物的擬肽和半擬肽，所 述肽類(lèi)似物可具有例如能使肽在體內(nèi)時(shí)更穩(wěn)定或更能夠滲透到細(xì)胞中的修飾。這種修飾包 括但不限于N末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 =C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH或CF = CH)、主鏈修飾和殘基修飾。制備模擬 肽化合物的方法是本領(lǐng)域公知的，在例如Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd., Chapter 17. 2，F(xiàn). Choplin Pergamon Press (1992)中有詳細(xì)說(shuō)明，該文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本 文，猶如在本文中全文給出。這個(gè)方面的更多細(xì)節(jié)在下文提供。肽當(dāng)中的肽鍵(-C0-NH-)可例如被以下的鍵取代N-甲基化鍵(_N(CH3)_C0_)、酯 鍵(-C (R) H-C-O-O-C (R) -N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、α -氮雜鍵(-ΝΗ-Ν (R) -C0-)，其中 R為任何烷基，例如甲基、carba鍵(-CH2-NH-)、羥亞乙基鍵(-CH(OH) -CH2-)、硫代酰胺鍵 (-CS-NH-)、烯烴雙鍵(-CH = CH-)、反酰胺鍵(-NH-C0-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-)，其中 R為天然呈現(xiàn)在碳原子上的“正?！眰?cè)鏈。這些修飾可出現(xiàn)在肽鏈上的任何鍵，甚至同時(shí)出現(xiàn)在幾個(gè)(2-3個(gè))鍵。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可用合成的非天然酸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、 Phe的環(huán)甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或ο-甲基-Tyr取代。除以上之外，本發(fā)明的肽還可包括一個(gè)或多個(gè)修飾氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸 單體(例如脂肪酸、復(fù)合碳水化合物等)。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”理解為包括20個(gè)天然氨基酸；常在體內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾的氨基酸， 例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他非常見(jiàn)氨基酸，包括但不限于2-氨基 己二酸、羥賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸。此外，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括D-和 L-氨基酸。下表1和2列出了可用于本發(fā)明的天然氨基酸(表1)或修飾氨基酸(例如合成 氨基酸，表2)。表 權(quán)利要求
一種多肽，其包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.一種組成物，其包含多糖和權(quán)利要求1的多肽。
3.權(quán)利要求2的組成物，其中所述多糖是透明質(zhì)酸。
4.權(quán)利要求2的組成物，其還包含抗氧化劑。
5.一種組成物，其包含透明質(zhì)酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑。
6.權(quán)利要求4或5的組成物，其中所述抗氧化劑是超氧化物歧化酶(SOD)。
7.權(quán)利要求5的組成物，其中所述層粘連蛋白多肽為SEQIDNO :3所示。
8.一種組成物，其包含透明質(zhì)酸、超氧化物歧化酶(SOD)和權(quán)利要求1的多肽。
9.權(quán)利要求6或8的組成物，其中所述超氧化物歧化酶包含SEQIDNO :4所示的氨基 酸序列。
10.權(quán)利要求2-7和9中任一項(xiàng)的組成物，其中所述多糖、所述抗氧化劑和/或所述多 肽是交聯(lián)的。
11.權(quán)利要求8的組成物，其中所述透明質(zhì)酸、所述超氧化物歧化酶(SOD)和所述多肽 是交聯(lián)的。
12.—種基質(zhì)，其包含權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)的組成物。
13.—種水凝膠，其包含權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)的組成物。
14.一種產(chǎn)生水凝膠的方法，所述方法包括將權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的組成物懸浮于 水中以獲得包含至少80%水的懸浮液，從而產(chǎn)生水凝膠。
15.權(quán)利要求14的方法，其還包括使所述組成物交聯(lián)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述交聯(lián)是用選自EDC-N-(3- 二甲氨基丙基)-N-乙基碳 二亞胺、DVS- 二乙烯基砜和京尼平的交聯(lián)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述懸浮液包含至少95%水。
18.權(quán)利要求13的水凝膠或權(quán)利要求14的方法，其中所述透明質(zhì)酸以在所述水凝膠中 約0. 5-1. 5%的濃度范圍提供。
19.權(quán)利要求13的水凝膠或權(quán)利要求14的方法，其中所述多肽以在所述水凝膠中約 20-100 μ g/ml的濃度范圍提供。
20.權(quán)利要求13的水凝膠或權(quán)利要求14的方法，其中所述超氧化物歧化酶以在所述水 凝膠中約5-40 μ g/ml的濃度范圍提供。
21.權(quán)利要求12的基質(zhì)或權(quán)利要求13的水凝膠，其還包含細(xì)胞。
22.—種誘導(dǎo)組織的離體形成的方法，其包括(a)提供權(quán)利要求12的基質(zhì)或者權(quán)利要求13、18、19和20中任一項(xiàng)的水凝膠，和；( )用在適于所述細(xì)胞的增殖、分化和/或遷移的培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種所述基質(zhì)或所 述水凝膠，從而誘導(dǎo)組織的形成。
23.一種誘導(dǎo)組織的體內(nèi)形成的方法，所述方法包括將權(quán)利要求12的基質(zhì)或者權(quán)利要 求13、18、19和20中任一項(xiàng)的水凝膠植入受試者體內(nèi)，從而誘導(dǎo)組織的形成。
24.一種治療具有以組織患病、損傷或損失為特征的病狀的受試者的方法，所述方法包 括將權(quán)利要求12的基質(zhì)或者權(quán)利要求13、18、19和20中任一項(xiàng)的水凝膠植入在受試者的 患病、損傷或損失的組織處或附近，從而誘導(dǎo)組織的形成和治療受試者。
25.權(quán)利要求22、23或24的方法，其中所述組織是神經(jīng)組織。
26.權(quán)利要求21的基質(zhì)或水凝膠，或者權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的基質(zhì)、水凝膠或方法，其中所述干細(xì)胞當(dāng)接種在所述基質(zhì)或所述水 凝膠中時(shí)分化成神經(jīng)元細(xì)胞。
28.權(quán)利要求13、18、19和20中任一項(xiàng)的水凝膠，其為凍干形式。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的新型層粘連蛋白多肽。還公開(kāi)了包含多糖(例如透明質(zhì)酸)和該新型層粘連蛋白多肽或者包含透明質(zhì)酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑(如超氧化物歧化酶)的組成物，以及包含所述組成物的、可用于離體或體內(nèi)組織形成和用于治療以組織患病、損傷或損失為特征的病狀的基質(zhì)和水凝膠。
文檔編號(hào)C07K14/78GK101965357SQ200880112384
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者S·羅克金德, Z·尼沃 申請(qǐng)人:特拉維夫大學(xué)拉莫特有限公司;特拉維夫醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)設(shè)施和保健服務(wù)基金會(huì)