基于雜交瘤技術和高通量測序的抗體發(fā)現(xiàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生結合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，以及由其產(chǎn)生的重組抗體。本發(fā)明的產(chǎn)生抗體的方法將優(yōu)化的高通量抗體測序方法和雜交瘤抗體篩選技術相結合，與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技術相比，擴大了候選抗體基因的選擇范圍，提高了抗體結構優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體的可能性。
【專利說明】
基于雜交瘤技術和高通量測序的抗體發(fā)現(xiàn)方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，具體地，涉及一種基于雜交瘤技術和高通量測序 產(chǎn)生結合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，以及由該方法所獲得的重組抗體。
【背景技術】
[0002] 雜交瘤技術是最常用的抗體挖掘技術，但是其步驟繁瑣，并且得到單克隆細胞所 需要的亞克隆過程耗時長、成本高。
[0003] 近年來，高通量測序技術越來越多地應用于免疫抗體可變區(qū)基因譜的表征分析， 以及抗原特異性抗體的發(fā)現(xiàn)。該方法通過對免疫前、后免疫球蛋白基因的高通量測序，獲得 免疫動物的抗體可變區(qū)基因譜。在免疫后顯著富集的抗體基因被認為可能與特異性抗原相 關，選取抗體可變區(qū)基因譜中的高豐度的重鏈和輕鏈基因在體外配對重組表達抗體。相比 較抗體基因隨機配對表達，采用高豐度基因配對可以提高產(chǎn)生功能抗體的效率，減少配對 的盲目性。此外，還可產(chǎn)生大量的候選序列用于抗體配對表達和功能驗證，擴展功能抗體篩 選池的規(guī)模。相對于傳統(tǒng)的雜交瘤以及噬菌體展示技術，該技術規(guī)避這兩種技術的局限性， 包括僅適用于鼠和兔等有限的物種，原核表達系統(tǒng)中的密碼子選擇，后續(xù)需要進行人源化 等技術難點。同時，抗體組測序方法可以加速獲取雜交瘤抗體基因的進程。無需得到最終的 單克隆，在寡克隆階段即可收集并測序;非單克隆序列由二代測序結果進行校正。相比于傳 統(tǒng)的一代測序檢測單/寡克隆抗體信息，可以通過PCR添加細胞index序列后，混合用二代測 序進行雜交瘤抗體基因測序，提高通量，降低成本。
[0004] 然而，此技術的缺陷在于：1)無法獲取天然抗體配對信息；2)單純依靠基因豐度配 對導致基因配對方法單一，配對成功率低，后續(xù)基因合成和配對篩選工作量大。
[0005] 近年來，通過蛋白質組技術分析抗體可變區(qū)多肽的豐度，結合高通量測序獲取抗 體基因的序列的方法，已經(jīng)應用于抗體生產(chǎn)。采用特異性標記分離抗體生產(chǎn)細胞，通過高通 量單細胞抗體測序技術可以獲得天然重鏈和輕鏈配對信息。但是單細胞抗體測序和蛋白質 組分析對于生物信息分析方法與實驗條件都有很高的要求，這無疑增加了抗體發(fā)掘的難 度。此外，抗體可變區(qū)基因譜的獲取也存在一些技術難度?？贵w序列特異性引物的覆蓋度和 引物擴增效率不一，導致抗體可變區(qū)基因譜缺失抗體基因信息或者信息存在偏向性，獲得 的高豐度序列不具備抗原特異性;RACE方法建庫可以克服偏向性，但是擴增片段較長難以 測通，有可能缺失部分抗體序列信息。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對現(xiàn)有雜交瘤技術耗時長，抗體細胞系篩選范圍小，難以獲取高親和力單克隆 抗體的缺陷，以及抗體測序技術存在的建庫偏向性以及配對盲目性等缺陷，本發(fā)明將優(yōu)化 的高通量抗體測序方法和雜交瘤抗體篩選技術相結合，與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技術相 比，擴大了候選抗體基因的選擇范圍，提高了抗體結構優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體 的可能性。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生結合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，其包括：
[0009] (1)用所述至少一種靶抗原免疫宿主受試者；
[0010] (2)使用經(jīng)免疫的宿主受試者的脾臟細胞，制備雜交瘤細胞系，并獲取特異性結合 所述至少一種祀抗原的雜交瘤抗體基因信息；
[0011] (3)使用免疫后的宿主受試者的淋巴細胞，進行免疫球蛋白基因可變區(qū)的高通量 測序，獲取針對所述至少一種靶抗原的抗體可變區(qū)基因譜；
[0012] (4)選取雜交瘤抗體重鏈基因作為第一候選配對基因，并與從抗體可變區(qū)基因譜 中選擇的輕鏈基因作為第二候選配對基因進行配對，以產(chǎn)生候選重組抗體。
[0013] 在具體實施方案中，步驟(2)中，所制備的雜交瘤細胞系能夠產(chǎn)生與所述靶抗原具 有高親和力的單克隆抗體，優(yōu)選為與靶抗原的結合常數(shù)不高于10- 9Μ的單克隆抗體。
[0014] 在優(yōu)選的實施方案中，所述雜交瘤抗體基因信息包含抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基 因 ?目息。
[0015] 在優(yōu)選的實施方案中，通過以下獲取雜交瘤抗體基因信息：
[0016] 以雜交瘤細胞總mRNA為模板，Oligo dT為引物，經(jīng)反轉錄合成CDNA第一鏈，再以 cDNA第一鏈為模板，以混合的特異性引物擴增抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，測序分 析得到雜交瘤基因序列，將雜交瘤基因序列進行IgBlast分析，排除來源于構成雜交瘤的融 合伴侶瘤自身的抗體基因和無義基因，得到候選重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。
[0017] 在優(yōu)選的實施方案中，步驟(3)中，所述抗體可變區(qū)基因譜包含抗體的重鏈和輕鏈 可變區(qū)基因信息；
[0018] 優(yōu)選地，所述基因信息是通過高通量DNA測序確定的；
[00?9]進一步優(yōu)選地，所述高通量DNA測序包括在測序反應的同時進行合成、連接或者雜 交；以及單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合；
[0020] 進一步優(yōu)選地，所述高通量測序通過以下實施：
[0021] 以細胞總mRNA為模板，使用SMARTer RACE技術合成第一鏈cDNA;設計上游引物，并 根據(jù)抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設計下游引物，以擴增抗體序列可變區(qū)。
[0022] 在優(yōu)選的實施方案中，步驟(4)中，從抗體可變區(qū)基因譜中選取包含高豐度CDR3或 者包含與所述高豐度CDR3高度相似的CDR3的輕鏈基因作為第二候選配對基因。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)，具有高相似度CDR3的輕鏈基因可以與同一條重鏈基因配對產(chǎn)生功能抗體。
[0023] 在優(yōu)選的實施方案中，在從抗體可變區(qū)基因譜中選定第二候選配對基因的CDR3 的情況下，通過以下方法獲得第二候選配對基因的抗體可變區(qū)：
[0024] 從包含所選定CDR3的抗體基因片段的測序結果中，依次選取最高豐度的CDR2和 CDR1片段信息，然后挑選最高豐度的包含選定CDR2和CDR1片段信息的可變區(qū)全長序列，作 為第二候選配對基因的抗體可變區(qū)序列。
[0025] 在優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括用所述至少一種靶抗原對所得抗體進行鑒 定的步驟，由此產(chǎn)生結合所述至少一種靶抗原的重組抗體。
[0026] 在具體實施方案中，所述鑒定步驟包括體外表達所得抗體的scFv或Fab片段或 IgG，將所得scFv、Fab片段或IgG與祀抗原進行結合力測試；
[0027] 優(yōu)選地，所述體外表達方法包含但是不限于:通過原核細胞、噬菌體展示方法或酵 母系統(tǒng)表達scFv或者Fab片段，或者通過哺乳細胞外源基因表達Fab或者IgG;
[0028] 優(yōu)選地，所述測試方法包括但不限于ELISA和/或SPR。
[0029]在本發(fā)明的上下文中，術語"高親和力"是指抗體親和力常數(shù)不高于10-9Μ。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，術語"高豐度"是指在抗體可變區(qū)基因譜中的豐度高于1%。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中，術語"高度相似"是指在氨基酸水平上與待比較的對象具有 高于80 %的序列同一性。
[0032] 第二方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)上述第一方面所述的方法制得的重組抗體。
[0033] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，發(fā)明人獲得了特異性靶向ΗΑ的功能性重組抗 體，所述重組抗體的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID Ν0:40，42和50所示的⑶R3，并且所述重組抗 體的輕鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:20,53,68和103所示的CDR3。
[0034] 在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，發(fā)明人獲得了特異性靶向PD-L1的功能性重 組抗體，所述重組抗體的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:84所示的⑶R3，并且所述重組抗體 的輕鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:23,89和105所示的CDR3。
[0035] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0036] 本發(fā)明結合雜交瘤技術與抗體測序技術，通過特定的選擇方式，將從雜交瘤中獲 取的抗體重鏈基因和抗體可變區(qū)基因譜中獲取的輕鏈基因配對表達，獲取功能性抗體。所 采用的優(yōu)化的抗體文庫制備流程，可以完整地獲取免疫受試者的抗體可變區(qū)基因譜，實驗 結果具有很高的重復性;所采用的優(yōu)化的生物信息學分析方法可以快速地獲取CDR3的豐度 信息和準確的抗體基因可變區(qū)全長信息。相比較雜交瘤技術和單純依靠抗體基因豐度選擇 配對候選序列的方法，本發(fā)明的抗體發(fā)現(xiàn)方法可以提高候選配對基因的選擇范圍，克服配 對盲目性的問題，提高成功配對獲得功能性抗體的效率。
【附圖說明】
[0037]圖1顯示本發(fā)明的產(chǎn)生重組抗體的方法的流程圖。
[0038]圖2顯示實施例2中擴增的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中， VH表示重鏈可變區(qū)，VL表示輕鏈可變區(qū)，Μ表示D2000marker(Takara)。
[0039]圖3顯示實施例2所制備重鏈和輕鏈可變區(qū)測序文庫的Bioanalyzer鑒定結果。 [0040]圖4顯示樣品GW02-5的骨髓和脾臟組織之間⑶RH3豐度的相關性。
[00411圖5顯示樣品GW02-5的骨髓和脾臟組織之間⑶RL3豐度的相關性。
[0042]圖6顯示樣品GW02-3的各個脾臟組織重復之間⑶RH3豐度的相關性。
[0043]圖7顯示樣品GW02-3的各個脾臟組織重復之間⑶RL3豐度的相關性。
[0044]圖8顯示樣品GW02-5的各個脾臟組織重復之間⑶RH3豐度的相關性。
[0045]圖9顯示樣品GW02-5的各個脾臟組織重復之間⑶RL3豐度的相關性。
[0046]圖10顯示GW01抗原多肽與配對抗體之間的親和力分析；圖內數(shù)值表示0D490nm波 長吸收值;圖內錐形基部實線表示雜交瘤抗體天然配對。
[0047]圖11顯示GW02抗原多肽與配對抗體之間的親和力分析；圖內數(shù)值表示0D490nm波 長吸收值;圖內錐形基部實線表示雜交瘤抗體天然配對。
[0048] 圖12為顯示GW01抗原和GW02抗原的抗體配對效率的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0049] 為便于理解本發(fā)明，以下通過列舉具體實施方案及具體實施例的方式進一步說明 本發(fā)明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所列舉的具體實施方案和實施例僅僅是幫 助理解本發(fā)明，不應被視為對本發(fā)明的具體限制。
[0050] 例如，在一個具體的實施方案中，本發(fā)明采用如下程序：
[0051] 1)采用標準免疫程序在第0天和第21天兩次免疫小鼠，取免疫前小鼠血清作為陰 性對照;初次免疫后第35天取血檢測血清滴度，對血清滴度達到融合要求的小鼠加強免疫， 初次免疫后第38天進行細胞融合制備雜交瘤。融合后10-14天左右，取雜交瘤上清進行克 隆檢測，分離亞克隆，篩選親和力最高的亞克隆。
[0052] 2)以雜交瘤細胞的mRNA為模板，Oligo dT為引物，反轉錄合成cDNA第一鏈，再以 cDNA第一鏈為模板，使用重鏈和輕鏈簡并引物PCR擴增VH和VL基因 （Ti 1 ler等人，2009)，所 用引物序列見以下表1。采用標準PCR程序擴增雜交瘤抗體序列可變區(qū)，PCR產(chǎn)物克隆測序， 將抗體基因進行IgBlast分析，剔除假基因以及提前中止的基因。
[0053]表 1
[0054]
[0055] 3)采用Trizol裂解脾臟和骨髓細胞并提取RNA，使用SMARTer RACE(Clontech)技 術合成第一鏈cDNA;設計上游引物并根據(jù)抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設計下游引物，擴增抗體 序列可變區(qū)。以cDNA鏈5'末端共有一段序列設計正向通用引物，并在正向通用引物5'末端 連接Illunina MiSeq正向測序接頭。根據(jù)小鼠恒定區(qū)保守序列反向引物，并在引物3端附加 Illumina MiSeq反向測序接頭。引物序列信息見表2。
[0056] 表2
[0057]
[0058]
[0059] 擴增重鏈和輕鏈序列可變區(qū)，采用Illumina Miseq 2X250測序，整理數(shù)據(jù)后進行 IgBlas分析，獲取互補決定區(qū)3(complementary determining region 3，CDR3)的氨基酸序 列，根據(jù)序列的豐度排名，挑選包含高豐度CDR3或者包含與所述高豐度CDR3高度相似的 CDR3的抗體輕鏈基因作為輕鏈候選配對基因（即，本文中所述"第二候選配對基因"）；選取 雜交瘤重鏈基因作為重鏈候選配對基因（即，本文中所述"第一候選配對基因"）；將所選擇 的重鏈候選配對基因與輕鏈候選配對基因在哺乳動物細胞中配對表達，測試配對抗體與特 異抗原的親合力。
[0060] 實施例1雜交瘤抗體序列的分離和鑒定 [0061 ]采用如下程序：
[0062] (1)擴大培養(yǎng)骨髓瘤細胞，使其在融合時處于對數(shù)生長期。融合當天，收集細胞，計 數(shù)，備用。
[0063] (2)取血清滴度達到標準的血凝集素 HA抗原多肽(下文以代號GW01表示)和免疫檢 查點ro-Ll抗原多肽(下文以代號GW-02表示)各2只免疫小鼠制備雜交瘤，分別命名為6101_ 1，GW01 -3和GW0 2-3，GW0 2-5。摘除小鼠眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血 清。拉頸處死小鼠，無菌取小鼠脾臟，分離脾細胞并裂解紅細胞，得到純凈的B淋巴細胞。細 胞融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞以適當?shù)谋壤旌?，在融合劑作用下使兩種細胞融合。融 合后的細胞用HAT培養(yǎng)基重懸后，分裝含有巨噬細胞的96孔細胞培養(yǎng)板。置37°(：，5^^0 2培 養(yǎng)箱內培養(yǎng)。融合后的細胞用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后用換HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，然后換 R1640完全培養(yǎng)基。
[0064] (3)融合后10-14天左右，取雜交瘤上清進行第一次克隆檢測，孔中換新鮮培養(yǎng)基。 繼續(xù)培養(yǎng)3天，取雜交瘤上清進行第二次克隆檢測，孔中換新鮮培養(yǎng)基。將陽性克隆擴大培 養(yǎng)至48孔板。同時將陽性克隆進行克隆化，即將陽性克隆進行稀釋，按每孔1個細胞接種一 塊96孔板，200ul/孔。繼續(xù)培養(yǎng)3天，取雜交瘤上清進行第三次克隆檢測，同時擴大培養(yǎng)陽性 克隆。凍存陽性克隆細胞株，同時收集上清進行亞型鑒定。
[0065] (4)將鑒定過的具有高親和力的23個GW01和18個GW02單克隆雜交瘤細胞系復蘇 后，經(jīng)擴大培養(yǎng)至1 X 107個細胞，用1'1^2〇1(1]1￥；[1：1'(^611公司）提取總1?嫩，按廠家說明書進 行。使用反轉錄試劑盒SuperScriptIII(Life Technologies)將2yg總RNA反轉錄成cDNA第1 鏈，按廠家說明書進行。使用通用型引物克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，通用型引物見上文 表1;以輕鏈可變區(qū)基因克隆為例，等量混合輕鏈引物，取2μ1混合引物，2μ1 cDNA為模板， pfu酶(GENEWIZ)制備反應體系，反應程序是預變性98°CC 30s后，進行98°CC 8秒，58°CC 15 秒，72°CC 30秒共30個循環(huán)的擴增程序，然后72°CC保溫2分鐘。采用BciVI去除無功能的輕 鏈基因，酶切體系如下:BciVI，ΙμL，PCR產(chǎn)物lyg，10倍緩沖液5μ1然后補水至50μ1，37°CC酶 切過夜，電泳回收并純化400bp左右的片段，并將其克隆至T載體，測序鑒定輕鏈序列。采用 相似步驟，采用重鏈引物PCR擴增重鏈可變區(qū)基因。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，回收純化 400bp-500bpPCR產(chǎn)物，并將其克隆至測序載體以進行測序，將測得的序列輸入MGT數(shù)據(jù)庫 進行分析，排除來源于構成雜交瘤的融合伴侶瘤自身的抗體基因和無義基因，得到重鏈和 輕鏈基因的可變區(qū)。
[0066] 實施例2抗體測序文庫的制備及抗體序列的分析
[0067] 分別采用實施例1制備雜交瘤余下的脾臟組織以及來自同一只免疫小鼠的骨髓細 胞，進行抗體測序文庫的制備。
[0068] 具體地，將所述脾臟組織在液氮中研磨，提取總RNA，具體提取程序按提取試劑的 廠家說明書進行;從同一只經(jīng)免疫的小鼠中采集脛骨和股骨除去肌肉和脂肪組織，用注射 器將Trizol注入骨內清洗出骨髓并收集在離心管當中，提取總RNA，具體提取程序按提取試 劑的廠家說明書進行。
[0069] 采用抗體可變區(qū)上游引物和重鏈和輕鏈可變區(qū)下游引物，以樣品5 ' RACE產(chǎn)物為模 板，分別擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)，制備重鏈和輕鏈可變區(qū)的測序文庫。
[0070] PCR擴增體系和擴增程序分別見以下表3和表4。
[0071] 表3
[0072]
[0076] 在擴增產(chǎn)物末端通過PCR的方法添加 Barcode，用于區(qū)分不同樣品的測序結果。PCR 擴增體系和擴增程序分別見以下表5和表6。
[0077] 表 5
[0078]
[0079] 表 6
[0080]
[0081 ] 擴增產(chǎn)物的純化：在PCR產(chǎn)物中加入0.8倍體積的AMPure Beads，混勻室溫靜置 5min;瞬時離心后置于磁力架上5分鐘；棄上清液，加70 %無水乙醇洗兩遍后小心棄去殘余 乙醇，室溫放置10分鐘待乙醇揮發(fā)完全。加入30μ1 10mM Tris(pH8.0)混勻beads，室溫靜 置5分鐘，洗脫DNA并轉移至新管中。
[0082]由上述PCR擴增所得重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。 [0083] 此外，使用Agilent 2100Bioanalyzer分析系統(tǒng)檢測文庫插入片段大小及含量，所 得重鏈和輕鏈可變區(qū)文庫的Bioanalyzer鑒定結果如圖3所示。
[0084] 使用Illumina MiSeq 2X250(GENEWIZ)進行高通量測序。對重鏈和輕鏈可變區(qū)文 庫的每一個設定適量的測序數(shù)，數(shù)據(jù)產(chǎn)生后，去除掉不完全序列，將完整的包含CDR3的R2序 列進行IgBlast比對，產(chǎn)生⑶R3區(qū)氨基酸序列信息庫。由于⑶R3序列是不同抗體基因接近唯 一的標示符，可以依據(jù)獲得的CDR3序列的數(shù)量評估其在抗體可變區(qū)基因譜中的豐度。以樣 品GW02-5為例，比較來自于脾臟和骨髓的抗體可變區(qū)基因譜(見圖4-5,表7-8)，結果表明兩 種組織中⑶RH3或⑶RL3豐度的相關性相近，R 2值分別為0.69和0.71;其中排名位于抗體可 變區(qū)基因譜前十位的高豐度CDR3的相關性較低，這意味著在強化免疫條件下，高通量測序 結果可以反映骨髓與脾臟組織中抗體細胞種類和數(shù)量的差異。
[0085] 表 7
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091] 此外，還比較了各個重復間的CDRH3和CDRL3氨基酸序列豐度的相關性（見圖6-圖 9)，結果顯示各個重復間的CDRH3和CDRL3序列豐度具有很高的相關性，說明實驗體系是穩(wěn) 定的。
[0092] 實施例3雜交瘤和抗體可變區(qū)基因譜序列的比較以及候選配對序列的選擇
[0093] 總計分析了 18個GW02和23個GW01單克隆雜交瘤細胞系，提交雜交瘤抗體基因可變 區(qū)進行IgBlast，確定⑶R3H和⑶R3L片段信息。將⑶R3H和⑶R3L與對應的抗體可變區(qū)基因譜 比較，大部分雜交瘤⑶R3H和⑶R3L都包含在抗體可變區(qū)基因譜當中，而且部分⑶R3對應的 測序條數(shù)超過測序總條數(shù)的1%，屬于高豐度CDR3。高豐度CDR3的數(shù)目以及雜交瘤CDR3在抗 體可變區(qū)基因譜中的比例見以下表9。
[0094] 表 9
[0095]
[0096] 表9中，CDR3>1% :超過抗體測序條數(shù)1%的雜交瘤⑶R3的數(shù)量;CDR3數(shù)量:選取的 雜交瘤CDR3數(shù)量；％總測序條數(shù):雜交瘤CDR3在抗體測序條數(shù)中的比例。
[0097] 進一步的分析表明，雜交瘤天然配對⑶R3H和⑶R3L在抗體庫中的豐度并不均一。 部分0)1?3!1和0)1?31^的豐度相近，例如樣品6101-3-11/6101-3-30)1?3!1了1^0￥的豐度為 9.58%，配對CDR3L WQGTHFPWT的豐度為5.57% ;部分配對的豐度差別較大，以樣品GW02-5 為例，GW02-5-191 和GW02-5-231 的CDR3H ARAYGDYGFIY和ASLLDF，它們的豐度分別為6 · 78 % 和3.02 % ;但是配對CDR3L FQGSLAPST和LQYDEIPYT的豐度分別為0.22 %和0.23 % ;此外， GW02-5-5/5-24/5-43和GW02-5-10的CDR3L WQGTHFPWT和QQYNSYPLT的豐度分別8·64%和 7.21 %，配對CDR3H的豐度為0.58 %和接近為0。而且WQGTHFPWT和QQYNSYPLT在兩個抗原GW-01和GW-02中都以高豐度存在。由此我們推測抗體基因可能具有多種配對形式，包含高豐度 CDR3的抗體基因，或者包含高豐度和低豐度CDR3抗體基因間都可能配對形成功能性抗體。 以下表10-表13為各個雜交瘤序列在抗體庫中的豐度分析結果。
[0098]表1〇
[0100]
[0101]表11
[0109]
[0110] 上述表格中，VH:重鏈可變區(qū);VL:輕鏈可變區(qū)。
[0111] 針對兩個抗原選取6條雜交瘤抗體重鏈基因，與抗體可變區(qū)基因譜中包含高豐度 CDR3的輕鏈基因以及天然配對的雜交瘤抗體輕鏈基因在體外配對表達。選擇的雜交瘤重鏈 基因 CDR3都同時存在于抗體可變區(qū)基因譜當中，而且其中三條CDR3，TRGDY， ARS⑶AYYFAWFAY和ARGGGA在抗體可變區(qū)基因譜當中的排名分別為第1，2和10位;其余三條 CDR3屬于低豐度CDR3。其對應的抗體天然配對輕鏈中的2條包含高豐度CDR3其余4條包含低 豐度。選取的包含高豐度CDR3的輕鏈候選配對基因在至少一個免疫受體抗體可變區(qū)基因譜 中排名位于前十位。
[0112] GW01和GW02候選⑶R3H和⑶R3L配對基因信息分別見以下表14和表15。表14
[0116]
[0117] 候選配對基因全長信息來源于雜交瘤基因測序，或者通過抗體可變區(qū)全長序列挑 選方法獲取，例如輕鏈基因可變區(qū)K10和K11，首先在基因可變區(qū)測序結果中確定候選CDR3 序列，繼爾依次挑選最高豐度⑶R2和⑶R1序列，以此確定⑶R1，CDR2和⑶R3的序列信息，然 后從測序結果中獲取包含確定CDR1，CDR2和CDR3的最高豐度片段，獲取抗體可變區(qū)全長氨 基酸序列和核苷酸序列信息。在體外從頭合成抗體基因并配對表達。
[0118] 比較了候選配對輕鏈基因的CDR3區(qū)序列，在部分基因具有較高的相似性，例如K5， K8，K9，K10之間的相似性達到78%-89%，它們有可能是在抗體形成過程中形成的超變異 體，在抗體可變區(qū)基因譜中的富集可能意味著他們與特異性抗原相關。
[0119] 實施例4GW01和GW02配對抗體的體外表達
[0120] 將候選重鏈和輕鏈的可變區(qū)通過搭橋PCR的方法構建表達框，表達框包括啟動子， 可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)。將包含重鏈和輕鏈表達框的質粒配對轉染293FT細胞，進行體外表 達和抗體功能分析。收集293FT細胞并調整細胞密度接種48孔板至1.2Χ10 5/孔;37°C，5% C02孵箱培養(yǎng)過夜，待細胞密度長至60-80%時進行轉染。將0.25以8重鏈和0.75以 8輕鏈質粒 在室溫孵育5分鐘，然后與轉染試劑混勻后在室溫孵育20min形成轉染復合物。將轉染復合 物加入細胞孔，輕輕混勻。37°C，5%C0 2孵箱培養(yǎng)72小時。收集上清用ELISA檢測活性。首先 將抗人18〇$(：)與檢測抗原分別用?!19.6碳酸包被液稀釋成1(^8/1111，96孔酶標板每孔包 被100μ1，4Γ，過夜;或者37°C，2小時;然后用4%脫脂奶粉-PBS封閉，300μ1/孔，37°C處理1 ~2小時。丟棄酶標孔內液體，用TOST洗三遍后加入轉染48小時培養(yǎng)上清100μΙ/孔，37 °C處 理1小時，設定培養(yǎng)基和對照。丟棄酶標孔內液體，用PBST洗三遍，分別加入HRP羊抗人 186$(3)，1 :2000;與冊?羊抗人186，1:5000;10(^1/孔，37°(：處理11^。棄酶標孔內液體，用 PBST洗五遍，加入(PD顯色液，100μΙ/孔，避光顯色;酶標儀讀取0D490波長吸收值。
[0121] 抗原GW01和GW02的配對抗體親和力分析結果分別如圖10和11所示，抗原GW01和 GW02的抗體配對效率分析結果分別如圖12所示。
[0122] 結果顯示，源于兩個免疫宿主受試者的44個重鏈/輕鏈配對當中，獲得7個具有親 和力的抗體，其中有3個是雜交瘤抗體基因天然配對;其余4個是雜交瘤重鏈基因與包含高 豐度⑶R3輕鏈的重組配對，重鏈基因 GW02-5-H2與3條輕鏈Κ5，Κ9和ΚΙ 1配對都形成具有親和 力的抗體，其中QQYNSYPLT(K5)在兩種靶抗原免疫宿主受試者的可變區(qū)基因譜當中都屬于 高豐度CDR3L，它與QQYNSYPFT(K9)CDR3的相似度為89%，基因可變區(qū)的相似度為84%，意味 著具有高相似度CDR3的輕鏈基因可能與同一個重鏈配對，形成功能抗體。也意味著可以采 用配對抗體CDR3區(qū)相似度高的序列形成一個小型文庫，直接為抗體的親和力成熟提供優(yōu)化 的選擇。
[0123] 6個雜交瘤天然配對中的3個如預期產(chǎn)生了有親和力的抗體，說明雜交瘤抗體序列 的鑒定是準確的，體外配對表達和Elisa實驗方法也是有效的。
[0124] 以上這些結果說明，結合雜交瘤抗體技術與高通量抗體測序技術，選取雜交瘤重 鏈基因與從抗體可變區(qū)基因譜中高豐度CDR3輕鏈基因配對表達，可以擴大配對候選基因的 選擇范圍，提高抗體結構優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體的可能性。雜交瘤重鏈GW02-5H2可以與多個高豐度輕鏈配對產(chǎn)生親和力抗體，說明某些重鏈基因也具有較好的配對特 性，可能與多個具有高相似度CDR3的輕鏈基因配對產(chǎn)生功能性抗體。
[0125]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的產(chǎn)品、詳細制備工藝及其用 途，但本發(fā)明并不局限于上述詳細制備工藝和用途，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細 制備工藝和用途才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本 發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護 范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1. 一種產(chǎn)生結合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，其包括： (1) 用所述至少一種靶抗原免疫宿主受試者； (2) 使用經(jīng)免疫的宿主受試者的脾臟細胞，制備雜交瘤細胞系，并獲取特異性結合所述 至少一種靶抗原的雜交瘤抗體基因信息； (3) 使用免疫后的宿主受試者的淋巴細胞，進行免疫球蛋白基因可變區(qū)的高通量測序， 獲取針對所述至少一種靶抗原的抗體可變區(qū)基因譜； (4) 選取雜交瘤抗體重鏈基因作為第一候選配對基因，并與從抗體可變區(qū)基因譜中選 擇的輕鏈基因作為第二候選配對基因進行配對，以產(chǎn)生候選重組抗體。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，所制備的雜交瘤細胞系產(chǎn)生與所述靶 抗原具有高親和力的單克隆抗體； 優(yōu)選地，所述雜交瘤抗體基因信息包含抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因信息； 優(yōu)選地，通過以下獲取雜交瘤抗體基因信息： 以雜交瘤細胞總mRNA為模板，01 igo dT為引物，經(jīng)反轉錄合成cDNA第一鏈，再以cDNA第 一鏈為模板，以混合的特異性引物擴增抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，測序分析得到 雜交瘤基因序列，將雜交瘤基因序列進行IgBlast分析，排除來源于構成雜交瘤的融合伴侶 瘤自身的抗體基因和無義基因，得到候選重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(3)中，所述抗體可變區(qū)基因譜包含抗體 的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因信息； 優(yōu)選地，所述基因信息是通過高通量DNA測序確定的； 進一步優(yōu)選地，所述高通量DNA測序包括在測序反應的同時進行合成、連接或者雜交； 以及單分子DNA測序、多聚合酶群落測序、納米孔測序或其組合； 優(yōu)選地，所述高通量測序通過以下實施： 以細胞總mRNA為模板，使用SMARTer RACE技術合成第一鏈cDNA;設計上游引物，并根據(jù) 抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設計下游引物，以擴增抗體序列可變區(qū)。4. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的方法，其中，步驟(4)中，從抗體可變區(qū)基因譜中選取 包含高豐度CDR3或者包含與所述高豐度CDR3高度相似的CDR3的輕鏈基因作為第二候選配 對基因。5. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的方法，其中，在從抗體可變區(qū)基因譜中選定第二候選 配對基因的CDR3的情況下，通過以下方法獲得第二候選配對基因的抗體可變區(qū)： 從包含所選定CDR3的抗體基因片段的測序結果中，依次選取最高豐度的CDR2和CDR1片 段信息，然后挑選最高豐度的包含選定CDR2和CDR1片段信息的可變區(qū)全長序列，作為第二 候選配對基因的抗體可變區(qū)序列。6. 根據(jù)權利要求1-5任一項所述的方法，其中，還包括用所述至少一種靶抗原對所得抗 體進行鑒定的步驟。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，所述鑒定步驟包括體外表達所得抗體的scFv或Fab片段 或IgG，將所得scFv、Fab片段或IgG與祀抗原進行結合力測試； 優(yōu)選地，所述體外表達方法包含但是不限于:通過原核細胞、噬菌體展示方法或酵母系 統(tǒng)表達scFv或者Fab片段，或者通過哺乳細胞外源基因表達Fab或者IgG; 優(yōu)選地，所述測試方法包括但不限于ELISA和/或SPR。8. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述的方法制得的重組抗體。9. 根據(jù)權利要求8所述的重組抗體，其為特異性靶向HA的重組抗體，所述重組抗體的重 鏈可變區(qū)包括如SEQ ID NO:40,42和50所示的⑶R3,并且所述重組抗體的輕鏈可變區(qū)包括 如SEQ ID 從)：20,53,68和103所示的〇)1?3。10. 根據(jù)權利要求8所述的重組抗體，其為特異性靶向ro-Li的重組抗體，所述重組抗體 的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID NO:84所示的⑶R3,并且所述重組抗體的輕鏈可變區(qū)包括如 SEQ ID 從)：23,89和105所示的〇)1?3。
【文檔編號】C07K16/28GK106065031SQ201610023897
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年1月14日 公開號201610023897.9, CN 106065031 A, CN 106065031A, CN 201610023897, CN-A-106065031, CN106065031 A, CN106065031A, CN201610023897, CN201610023897.9
【發(fā)明人】陳維之, 王曉紅, 洪媛媛, 陳豫, 孫中平
【申請人】蘇州金唯智生物科技有限公司