專利名稱：一種h3r高表達(dá)的重組hek293細(xì)胞構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
組胺是一種人體自身成份的小分子胺類物質(zhì).它是由組氨酸脫羧酶作用于L-組氨酸而合成，組氨酸脫羧酶在整個機(jī)體細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、胃黏膜壁細(xì)胞、肥大細(xì)胞及嗜堿粒細(xì)胞。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs),又稱為七a螺旋跨膜蛋白受體(seven a-helices transmembrane segment receptors, 7TM receptors),是體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族。在結(jié)構(gòu)上面它包括七個跨膜區(qū)段，它們與配體結(jié)合G蛋白分子開關(guān)后，通過與受體偶聯(lián)的G蛋白的介導(dǎo)，使第二信使物質(zhì)增多或減少，轉(zhuǎn)而改變膜上的離子通道，引起膜電位發(fā)生變化。其作用比離子通道型受體緩慢，這類受體與G蛋白之間的偶聯(lián)關(guān)系也頗為復(fù)雜；一種受體可以和多種G蛋白偶聯(lián)，激活多種效應(yīng)系統(tǒng)；也可同時和幾種受體偶聯(lián)或幾種G蛋白與一種效應(yīng)系統(tǒng)聯(lián)系而使來自不同受體的信息集中于同一效應(yīng)系統(tǒng)。組胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員，與其他單胺GPCR具有共同的保守序列。但序列同源性很低，在與組胺的親和力上存在很大差異，通過偶聯(lián)激活特異的G 蛋白進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。組胺受體3 (Histamine receptor3, H3R)H3R是突觸前自身受體,調(diào)節(jié)組胺在神經(jīng)元的合成與釋放。H3R在體內(nèi)分布廣泛，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在周圍組織中也有分布。H3R不僅參與腦內(nèi)組胺的釋放、合成與代謝，還能抑制N型、P型鈣離子通道， 也參與調(diào)節(jié)腦內(nèi)組胺(HA)、乙酰膽堿(Ach)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5 —羥色胺 (5-HT)、谷氨酸(Glu)、y-氨基丁酸(GABA)等多種神經(jīng)遞質(zhì)和激素的合成或釋放。具體的調(diào)節(jié)方式是H3R激動劑抑制組胺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而拮抗劑則促進(jìn)遞質(zhì)的釋放。過敏是指由免疫機(jī)制誘導(dǎo)的高敏反應(yīng)。過敏可以是體液(抗體)或者是細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的。在大多數(shù)情況下，可產(chǎn)生過敏反應(yīng)的抗體屬于IgE類，這些個體可以歸類于患有IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。然而，并非所有的"特異反應(yīng)性"(atopy)個體都會發(fā)生與IgE 相關(guān)的"過敏反應(yīng)。在非-IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中，抗體也可以屬于IgG—類。實驗表明， H3受體可能治療過敏性鼻炎。組胺H3R拮抗劑被當(dāng)作治療老年癡呆癥，ADHD (注意力缺陷多動癥)，癲癇，焦慮癥以及帕金森氏綜合征等疾病的候選藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，能夠作為篩選H3R阻斷劑的細(xì)胞模型，為同H3R過敏相關(guān)的藥物篩選建立細(xì)胞模型。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體是包含H3R全長基因的表達(dá)載體。
所述的H3R全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。所述的包含H3R全長基因的表達(dá)載體是PEZ-M02，該表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。所述的H3R高表達(dá)的HEK293-H3R重組細(xì)胞應(yīng)用于抗過敏藥物篩選，應(yīng)用是將H3R 高表達(dá)的HEK293/H3R重組細(xì)胞構(gòu)建成細(xì)胞膜色譜柱，以保留時間為指示，篩選以H3R為靶點的抗過敏藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果I、本發(fā)明擴(kuò)增了組胺受體3 (H3)的真核表達(dá)載體PEZ-M02/H3R，經(jīng)過克隆測序證實序列同NCBI數(shù)據(jù)庫中的人H3R序列一致；經(jīng)過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，G418抗性篩選獲得能夠穩(wěn)定生長、存活的細(xì)胞株，經(jīng)過Western blot,免疫熒光檢測，篩選出穩(wěn)定、高表達(dá)H3R的重組HEK293/H3R細(xì)胞株；本發(fā)明構(gòu)建的包含H3R基因全長的重組HEK293/H3R細(xì)胞株能夠穩(wěn)定表達(dá)H3R，具有完整的分子結(jié)構(gòu)。2、作為宿主細(xì)胞的HEK293細(xì)胞為原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化細(xì)胞，該細(xì)胞本身還有的各種受體表達(dá)量相對較低，而重組后的HEK293/H3R細(xì)胞表達(dá)的H3R的相對表達(dá)量較HEK293空載明顯升高，相對于其他細(xì)胞表面分子占據(jù)優(yōu)勢表達(dá)量， 處于特異配體結(jié)合優(yōu)勢地位，這樣就大大提高了以H3R為藥物篩選靶標(biāo)的特異性及靈敏性。3、重組后的HEK293/H3R細(xì)胞表達(dá)的H3R利用Western blot技術(shù)檢測表達(dá)量及免疫熒光技術(shù)檢測其在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況，顯示細(xì)胞膜上有H3R表達(dá)，且比HEK293細(xì)胞表達(dá)量高，并體現(xiàn)出H3R的分子活性。4、由于重組細(xì)胞所表達(dá)的H3R的識別能力，而且H3R表達(dá)量足夠，使得其與配體的結(jié)合能力成為其進(jìn)行藥物篩選的依據(jù)，可用于抗過敏中藥活性成分及活性化合物的篩選。


圖I是雙酶切pEZ-M02/H3R電泳檢測圖譜。圖2是經(jīng)G418抗性篩選的陽性細(xì)胞培養(yǎng)圖。圖3_a是Western blot分析陽性細(xì)胞H3R表達(dá)量；圖3_b是是對Western blot 結(jié)果灰度分析柱狀圖。 圖4是免疫熒光分析H3R在HEK293/H3R細(xì)胞表達(dá)定位。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施對本發(fā)明做詳細(xì)描述。本發(fā)明在擴(kuò)增H3R全長基因的真核表達(dá)載體pEZ-M02/H3的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，獲得穩(wěn)定、高表達(dá)H3R的重組HEK293/H3細(xì)胞株，下面是對本方面做的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，包括以下步驟1)H3R基因克隆按照分子克隆實驗指南制備大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，將10 y L的pEZ_M02/H3 質(zhì)粒加入200 u L感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入IOmL的無氨芐青霉素抗
6性LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖lh，3000rpm離心3min，將菌體沉淀吹打均勻，加入30mL的含有氨芐青霉素抗性(lOOmg/mL) LB固體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆在含有氨芐青霉素抗性(100mg/mL) LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，采用商品化試劑盒獲得高純度質(zhì)粒，菌液 PCR初步鑒定陽性克隆，結(jié)果如圖I所示，并送金瑞斯生物科技公司進(jìn)行測序，驗證序列堿基，DNAstar Seqman進(jìn)行序列拼接，得到的測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. I所示，測序結(jié)果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列即為pEZ-M02/H3表達(dá)載體。2)高表達(dá)H3重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建①使用Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，在6孔板中接種3 X IO5細(xì)胞/孔，加入2mL完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37°C 培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至50-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；在無菌離心管中配制如下溶液溶液A :將5 ii g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到200 U L無血清培養(yǎng)基中；溶液B :將8 ii L LipofectAMINE稀釋到200 U L無血清培養(yǎng)基中；混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15 45min ;用2mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0. SmL無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37°C孵育6h ;用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)；HEK293細(xì)胞的篩選濃度為800 y g/ mL ;轉(zhuǎn)染72小時后按I : 10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，換為含G418的選擇培養(yǎng)基；在6孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，可見單個細(xì)胞分裂增殖形成單個抗性集落，如圖2所示；②有限稀釋法抗性集落細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋(10_2 10_1(1)，將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，15天左右細(xì)胞長滿整個孔，胰酶消化，傳代至大瓶培養(yǎng)，反復(fù)凍存、培養(yǎng)細(xì)胞兩次；3)高表達(dá)H3R重組HEK293鑒定①Western Blot :4°C條件下，將轉(zhuǎn)染H3R、未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，按I. 5 X IO6個細(xì)胞加入200 ii L細(xì)胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑PMSF)的比例裂解細(xì)胞，加入50 ii L loading buffer，沸水浴lOmin，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜完成全濕電轉(zhuǎn)印，后用含5% (m/v)脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜，經(jīng)TBST洗滌加經(jīng)過5% (m/v) BSA的TBST稀釋的特異性一抗與靶蛋白4°C過夜孵育，TBST洗滌3次后，再加5% (m/v) BSA 的TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白表達(dá)，檢測HEK293/H3 細(xì)胞H3蛋白表達(dá)；經(jīng)檢測，如圖3-a所示，H3-7，H3_8，H3-9為篩選的轉(zhuǎn)染了 HEK293/H3的細(xì)胞克隆，PcDNA為轉(zhuǎn)染空載的重組HEK293細(xì)胞，克隆H3_7，H3_8，H3-9的H3R表達(dá)量較克隆HEK293-pcDNA的表達(dá)量均有提高，而以克隆H3-8的H3R表達(dá)量最高JfWestern blot 的灰度分析結(jié)果表明，H3-8較陰性細(xì)胞HEK293的H3R的表達(dá)升高12倍；如圖3_b所示；②免疫熒光分析H3表達(dá)定位取對數(shù)生長期的HEK293空載細(xì)胞和pEZ_M02/H3細(xì)胞，0. 25% (m/v)胰蛋白酶消化，按IX IO5個/孔左右接種于放有多聚賴氨酸預(yù)處理的無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌爬有細(xì)胞的蓋玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH = 7. 4PBS溶解)ImL固定細(xì)胞15min后棄去；PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST孵育細(xì)胞 Ih ;用含 I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBST 以 I : 100 稀釋兔抗人Hl多克隆抗體，加到蓋玻片上，室溫孵育2h ；PBS輕輕洗滌三次；每次5min ;用含1% (m/v)BSA的PBST以I 200稀釋FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室溫避光孵育Ih ;于暗處，PBS洗滌三次，每次5min ;在載玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要產(chǎn)生氣泡。用熒光顯微鏡觀察并拍照，結(jié)果如圖4所示，圖4-a、圖4-d為DAPI分別染p-HlR 8和HEK293細(xì)胞核，藍(lán)色熒光。圖4_b、圖4_e為cy-3分別染p-HIR 8和HEK293 細(xì)胞膜，紅色熒光。圖4-c、圖4-f分別為p-HIR 8克隆和HEK293細(xì)胞核和細(xì)胞膜熒光疊加后的圖譜。與J1EK293空載細(xì)胞相比，p-HIR 8細(xì)胞膜上有H3R的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體的是包含H3R全長基因的表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于 所述的H3R全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示核苷酸序列表 〈110〉西安交通大學(xué)〈120〉一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法<160>1<210>1〈211>1338<212>DNA〈213〉人工合成<400>1ATGGAGCGCGCGCCGCCCGACGGGCCGCTGAACGCTTCGGGGGCGCTGGCGGGCGAGGCGGCGGCGGCGGGCGGGGCGCGCGGCTTCTCGGCAGCCTGGACCGCGGTGCTGGCCGCGCTCATGGCGCTGCTCATCGTGGCCACGGTGCTGGGCAACGCGCTGGTCATGCTCGCCTTCGTGGCCGACTCGAGCCTCCGCACCCAGAACAACTTCTTCCTGCTCAACCTCGCCATCTCCGACTTCCTCGTCGGCGCCTTCTGCATCCCACTGTATGTACCCTACGTGCTGACAGGCCGCTGGACCTTCGGCCGGGGCCTCTGCAAGCTGTGGCTGGTAGTGGACTACCTGCTGTGCACCTCCTCTGCCTTCAACATCGTGCTCATCAGCTACGACCGCTTCCTGTCGGTCACCCGAGCGGTCTCATACCGGGCCCAGCAGGGTGACACGCGGCGGGCAGTGCGGAAGATGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCTTCCTGCTGTACGGACCAGCCATCCTGAGCTGGGAGTACCTGTCCGGGGGCAGCTCCATCCCCGAGGGCCACTGCTATGCCGAGTTCTTCTACAACTGGTACTTCCTCATCACGGCTTCCACCCTGGAGTTCTTTACGCCCTTCCTCAGCGTCACCTTCTTTAACCTCAGCATCTACCTGAACATCCAGAGGCGCACCCGCCTCCGGCTGGATGGGGCTCGAGAGGCAGCCGGCCCCGAGCCCCCTCCCGAGGCCCAGCCCTCACCACCCCCACCGCCTGGCTGCTGGGGCTGCTGGCAGAAGGGGCACGGGGAGGCCATGCCGCTGCACAGGTATGGGGTGGGTGAGGCGGCCGTAGGCGCTGAGGCCGGGGAGGCGACCCTCGGGGGTGGCGGTGGGGGCGGCTCCGTGGCTTCACCCACCTCCAGCTCCGGCAGCTCCTCGAGGGGCACTGAGAGGCCGCGCTCACTCAAGAGGGGCTCCAAGCCGTCGGCGTCCTCGGCCTCGCTGGAGAAGCGCATGAAGATGGTGTCCCAGAGCTTCACCCAGCGCTTTCGGCTGTCTCGGGACAGGAAAGTGGCCAAGTCGCTGGCCGTCATCGTGAGCATCTTTGGGCTCTGCTGGGCCCCATACACGCTGCTGATGATCATCCGGGCCGCCTGCCATGGCCACTGCGTCCCTGACTACTGGTACGAAACCTCCTTCTGGCTCCTGTGGGCCAACTCGGCTGTCAACCCTGTCCTCTACCCTCTGTGCCACCACAGCTTCCGCCGGGCCTTCACCAAGCTGCTCTGCCCCCAGAAGCTCAAAATCCAGCCCCACAGCTCCCTGGAGCACTGCTGGAAGTGA 。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于 所述的包含H3R全長基因的表達(dá)載體是PEZ-M02，該表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于 所述的H3R高表達(dá)的HEK293-H3R重組細(xì)胞應(yīng)用于抗過敏藥物篩選，應(yīng)用是將H3R高表達(dá)的 HEK293/H3R重組細(xì)胞構(gòu)建成細(xì)胞膜色譜柱，以保留時間為指示，篩選以H3R為靶點的抗過敏藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一權(quán)利要求所述的一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)H3R基因克隆按照分子克隆實驗指南制備大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，將10 ii L的pEZ_M02/H3質(zhì)粒加入200 u L感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入IOmL的無氨芐青霉素抗性LB 液體培養(yǎng)基，37°C振搖lh，3000rpm離心3min，將菌體沉淀吹打均勻，加入30mL的含有氨芐青霉素抗性(100mg/mL)LB固體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆在含有氨芐青霉素抗性(lOOmg/mL) LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，采用商品化試劑盒獲得高純度質(zhì)粒，菌液PCR初步鑒定陽性克隆，并送金瑞斯生物科技公司進(jìn)行測序，驗證序列堿基，DNAstar Seqman進(jìn)行序列拼接，得到的測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. I所示，測序結(jié)果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列即為pEZ-M02/H3表達(dá)載體；2)高表達(dá)H3重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建①使用Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng) HEK293細(xì)胞，在6孔板中接種3 X IO5細(xì)胞/孔，加入2mL完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37°C培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至50-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；在無菌離心管中配制如下溶液溶液A :將5 ii g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到200 u L無血清培養(yǎng)基中；溶液B :將8 ii L LipofectAMINE稀釋到200 u L無血清培養(yǎng)基中；混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15 45min ;用2mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞， 加入0. SmL無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中 37°C孵育6h ;用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)；HEK293細(xì)胞的篩選濃度為800 u g/mL ； 轉(zhuǎn)染72小時后按I : 10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，換為含G418的選擇培養(yǎng)基；在 6孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，可見單個細(xì)胞分裂增殖形成單個抗性集落；②有限稀釋法抗性集落細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋(10_2 10_1(1)，將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，15天左右細(xì)胞長滿整個孔，胰酶消化，傳代至大瓶培養(yǎng)， 反復(fù)凍存、培養(yǎng)細(xì)胞兩次；3)高表達(dá)H3R重組HEK293鑒定①Western Blot :4°C條件下，將轉(zhuǎn)染H3R、未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，按I. 5X IO6個細(xì)胞加入200 u L細(xì)胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑PMSF)的比例裂解細(xì)胞，加入50 u L loadingbuffer，沸水浴lOmin，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜完成全濕電轉(zhuǎn)印，后用含5% (m/v)脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜，經(jīng)TBST洗滌加經(jīng)過5% (m/v) BSA的TBST稀釋的特異性一抗與靶蛋白4°C過夜孵育，TBST洗滌3次后，再加5% (m/v)BSA 的TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白表達(dá)，檢測HEK293/H3 細(xì)胞H3蛋白表達(dá)；經(jīng)檢測，H3-7，H3-8，H3-9為篩選的轉(zhuǎn)染了 HEK293/H3的細(xì)胞克隆，pcDNA 為轉(zhuǎn)染空載的重組J1EK293細(xì)胞，克隆H3-7，H3-8，H3-9的H3R表達(dá)量較克隆HEK293_pcDNA 的表達(dá)量均有提高，而以克隆H3-8的H3R表達(dá)量最高JfWestern blot的灰度分析結(jié)果表明，H3-8較陰性細(xì)胞HEK293的H3R的表達(dá)升高12倍；②免疫熒光分析H3表達(dá)定位取對數(shù)生長期的HEK293空載細(xì)胞和pEZ_M02/H3細(xì)胞，0.25% (m/v)胰蛋白酶消化，按IX IO5個/孔左右接種于放有多聚賴氨酸預(yù)處理的無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌爬有細(xì)胞的蓋玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH =7. 4 PBS溶解)ImL固定細(xì)胞15min后棄去；PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST孵育細(xì)胞 Ih ;用含 I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBST 以 I : 100 稀釋兔抗人Hl多克隆抗體，加到蓋玻片上，室溫孵育2h ；PBS輕輕洗滌三次；每次5min ;用含 I % (m/v) BSA的PBST以I : 200稀釋FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室溫避光孵育Ih ;于暗處，PBS洗滌三次，每次5min ;在載玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要產(chǎn)生氣泡。
全文摘要
一種H3R高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞構(gòu)建方法，重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體的是包含H3R全長基因的表達(dá)載體，包含H3R全長基因的表達(dá)載體是pEZ-M02，該表達(dá)載體是真核表達(dá)載體，H3R高表達(dá)的HEK293-H3R重組細(xì)胞應(yīng)用于抗過敏藥物篩選，提取真核表達(dá)載體pEZ-M02/H1R質(zhì)粒，進(jìn)而以其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用G418篩選得到高表達(dá)全長H1R的基因工程細(xì)胞系HEK293-H3R，并證實該細(xì)胞系可將全長H3R的表達(dá)提高12倍。
文檔編號C12N15/85GK102604990SQ20121004236
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者張濤, 王嗣岑, 賀浪沖, 韓省力, 黃靜 申請人:西安交通大學(xué)