用于檢測蘋果牛眼果腐病致病菌的lamp引物組及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物檢測技術(shù)，尤其設(shè)及基于LAMP技術(shù)的植物病菌的快速檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果牛眼果腐病是由明抱盤菌屬真菌（Neof油raea a化a、N. perennans、 N.malico;rticis和Neof油raea undescribed species)引起的，被中國列為禁止入境的檢 疫性真菌病害。該病菌的寄主植物包括蘋果、梨在內(nèi)的多種蓄薇科果樹。根據(jù)癥狀特點(diǎn)和 病菌形態(tài)特征很難鑒定。對(duì)蘋果牛眼果腐病菌的鑒定，目前只有采用常規(guī)PCR和測序手段 同時(shí)進(jìn)行判定，雖然準(zhǔn)確率較高，但整個(gè)檢測周期最少在10天左右，有時(shí)甚至長達(dá)20天，而 根據(jù)《進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》規(guī)定，進(jìn)境貨物在實(shí)驗(yàn)室出具檢驗(yàn)檢疫結(jié)果之前，該批貨物不 得銷售、使用，因此較長的檢測周期，嚴(yán)重影響了貨物的通關(guān)速度，甚至?xí)o貨主帶來了不 必要的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 蘋果牛眼果腐病主要依靠進(jìn)境水果傳播蔓延，迂寧口岸是水果進(jìn)境的重要口岸， 業(yè)務(wù)量位居全國第二，進(jìn)境水果中蘋果牛眼果腐病菌的檢疫鑒定工作是阻止其傳入我國的 重中之重。LAMP法是近年來發(fā)展迅速的一種快速檢測方法，其較與PCR最大的優(yōu)勢(shì)在于，檢 測時(shí)間大大縮短，檢測結(jié)果肉眼可見，檢測特異性提高兩個(gè)數(shù)量及，且擴(kuò)增階段對(duì)儀器的要 求低，不需要檢測儀。
[0004] 此方法的研發(fā)能減少真菌的鑒定時(shí)間，使用方便，可推廣應(yīng)用于檢測一線本研究 首次將LAMP方法應(yīng)用于檢疫性植物真菌鑒定中，旨于開發(fā)出更高效、準(zhǔn)確的檢測方法，W 應(yīng)用推廣于實(shí)際檢測工作，針對(duì)不同的使用目的，建立相應(yīng)的明抱盤菌屬及=個(gè)致病種的 LAMP檢測方法，并形成相應(yīng)的試劑盒，探索建立高通量LAMP檢測法的可行性，簡化整個(gè)植 物檢疫過程，縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率，創(chuàng)造更好的檢驗(yàn)檢疫環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的首先在于提供用于檢測蘋果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物組，包 括由SEQ ID No. 1~4編碼的四條引物；
[0006] F3 ;5' -ACGGATCTCTTGGTTCTGG-3' [SEQ ID No. 1]
[0007] B3 ;5, -TTACTACGCTTAGAGCCAGA-3' [SEQ ID No. 2]
[0008] FIP ;5, -GCGCAATGTGCGTTCAAAGATT-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3, [SEQ ID No. 3]
[0009] BIP ;5, -TGTTCGAGCGTCATTACAACCC-CGCCACTGATTTTAGGGC-3, [SEQ ID No. 4]。
[0010] 上述本發(fā)明的技術(shù)方案，所述用于檢測蘋果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物組， 尤其適用于針對(duì)明抱盤菌屬致病菌的檢測，所述明抱盤菌屬致病菌包括；Neof油reae perennans，Neofabreae malicorticis 和 Neofabreae alba。
[0011] 本發(fā)明另一方面的目的，在于提供一種用于檢測蘋果牛眼果腐病致病菌的LAMP 試劑盒，包括上文所述的由SEQ ID No. 1~4編碼的引物組。
[0012] 本發(fā)明再一方面的目的在于提供一種基于LAMP的蘋果牛眼果腐病致病菌檢測方 法，包括如下步驟：
[001引 a.提取待測樣品DNA;
[0014] b. W SEQ ID No. 1~4編碼的4條核巧酸序?yàn)橐锝M，W步驟a所提取的DNA為 模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[0015] C.擴(kuò)增產(chǎn)物分析及結(jié)果判斷。
[0016] 上述關(guān)于基于LAMP的蘋果牛眼果腐病致病菌檢測方法的【具體實(shí)施方式】中，所述 的步驟b中LAMP擴(kuò)增條件為；65°C恒溫30~60min ;80°C恒溫5min或在95°C下恒溫2min ; 終止反應(yīng)。
[0017] 另一【具體實(shí)施方式】，步驟bLAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系各引物濃度為；F3,0.化mol/L ;B3， 0. 化 mol/L ;FIP，1. 6u mol/L ;BIP，1. 6u mol/L。
[0018] 再一【具體實(shí)施方式】，所述的步驟b中LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系的待測樣品DM濃度為 1. 6ng/ y L。優(yōu)選在所述的步驟a制備的DNA樣品時(shí)，控制所述DNA樣品孤2日。/〇〇28。為1. 7~ 2. 0。其中0〇2日。和0D 28。分別是DNA樣品在260皿和280皿的吸收值。
[0019] 具體的實(shí)施方式中，所述的基于LAMP的蘋果牛眼果腐病致病菌檢測方法包括如 下步驟：
[0020] a.提取待測樣品DNA，使所述DNA樣品孤2日。/0〇28。為1. 7~2. 0,其中0D 26。和0D 28。 分別是DNA樣品在260nm和280nm的吸收值；
[002U b. W SEQ ID No. 1~4編碼的4條核巧酸序?yàn)橐锝M，W步驟a所提取的DM為 模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[00。]所述擴(kuò)增體系中包括；F3, 0.化 mol/L ;B3, 0. 2u mol/L ;FIP, 1. 6u mol/L ; BIP, 1. 6u mol/L ;dNTPs, 1. 4m mol/L 巧etaine, 0. 8m mol/L ;Tris-肥1(p服.8), 20m mol/L ; KCl, 10m mol/L ; (NH4)2S04, 10m mol/L ;M掉〇4, 8m mol/L ;Tween 20, 0. 1% (體積百分含量）； BstDNA Polymerase, 8U ;DNA 模板 1. 6ng/ y L ;
[0023] c.擴(kuò)增產(chǎn)物分析及結(jié)果判斷。
[0024] 本研究建立的LAMP檢測蘋果牛眼果腐病菌的引物組及相關(guān)檢測技術(shù)，具有靈敏 度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡單、鑒定簡便等優(yōu)點(diǎn)。簡化整個(gè)植物檢疫過程，縮短檢測時(shí) 間，提高檢測效率，創(chuàng)造更好的檢驗(yàn)檢疫環(huán)境。
【附圖說明】
[0025] 本發(fā)明附圖6幅，分別為：
[0026] 圖1是蘋果牛眼果腐病菌（N. perennans)總DNA電泳圖。
[0027] 圖2是蘋果牛眼果腐病菌（N. malicodicis)總DNA電泳圖。
[002引 圖3是蘋果牛眼果腐病菌（N. a化a)總DNA電泳圖。
[0029] 圖4是實(shí)施例2的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，其中；1 ;N. perennans ;2 ;陽性對(duì)照；3 ; N. malico;rticis ;4 ;N. a化a ;5:陰性對(duì)照。
[0030] 圖5是實(shí)施例3的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，其中；1 ;陽性對(duì)照；2 ;N. a化a ;3 ;N. perennans ; 4 ;N. malico;rticis ;5 ;陰性對(duì)照。
[0031] 圖6是實(shí)施例4的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，其中；1 ;陽性對(duì)照；2 ;大豆疫霉菌 (Phyto地thora sojae) ;3 ;玉蜀泰赤霉菌（Gibberella zeae) ;4 ;蘋果黑星菌（Ven1:u;ria inaequalis) ;5 ;陰性對(duì)照。
[0032] 圖4、5、6中，橫坐標(biāo)均為時(shí)間（秒），縱坐標(biāo)均為實(shí)時(shí)濁度值。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 如無特殊說明，本發(fā)明中所設(shè)及的材料及設(shè)備包括：
[0034] 菌種；明抱盤菌屬及其S個(gè)致病種（N. perennans、N. malico;rticis、N. a化a); Neof油reae perennans(ATCC26206)和Neof油reae malicorticis(ATCC13903)購自于美國 菌種保藏中屯、（ATCC) ;Neof油reae a化a受贈(zèng)于廣東檢驗(yàn)檢疫局。
[0035] 試劑；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；DNA提 取試劑盒購自O(shè)mega ;其余分子生物學(xué)試劑均購自于大連寶生物公司。
[0036] 儀器；LAMP實(shí)時(shí)濁度儀（日本榮研LA-320C);定性PCR儀（ABI Veriti);酶標(biāo)儀 巧LX-808);電泳儀炬i〇-rad)離屯、機(jī)（eppendo;rf 5415R)。
[0037] 下述具體實(shí)施例為進(jìn)一步說明本
【發(fā)明內(nèi)容】
，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明任何形式的限 制。
[003引實(shí)施例1 ;明抱盤菌屬S個(gè)致病種LAMP通用引物設(shè)計(jì)
[0039] 本發(fā)明采用真菌的通用引物ITS序列作為LAMP引物設(shè)計(jì)的祀序列（ITS1 ; TCCGTAGGTGAACCTGCGG[SEQ ID No. 5] ;ITS4;TCCTCCGCTTATTGATATGC [沈Q ID No. 6])，設(shè)計(jì) 用于本發(fā)明明抱盤菌屬S個(gè)致病種的LAMP通用引物，是分別由SEQ ID No. 1~4編碼的 F3、B3、FIP 和 BIP ;
[0040] F3 ;5' -ACGGATCTCTTGGTTCTGG-3' [SEQ ID No. 1];
[004U B3 ;5, -TTACTACGCTTAGAGCCAGA-3' [SEQ ID No. 2];
[0042] FIP ;5, -GCGCAATGTGCGTTCAAAGATT-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3' [SEQ ID No. 3];
[0043] BIP ;5, -TGTTCGAGCGTCATTACAACCC-CGCCACTGATTTTAGGGC-3, [SEQ ID No. 4]。
[0044] 實(shí)施例2 ;使用明抱盤菌屬S個(gè)致病種LAMP通用引物組進(jìn)行檢測
[0045] 1、菌種的活化
[0046] 將 Neof油reae perennans (ATCC26206)、Neof油reae malico;rticis (ATCC13903) 和Neof油reae a化a分別標(biāo)記為樣品1、2、3。
[0047] 2、DM提取，采用CTAB方法提取DM ;
[0048] (1)取0.1 g干菌絲置于預(yù)冷的研鉢中，在液氮中迅速研磨成粉末狀，把粉末迅速 轉(zhuǎn)入1. 5ml的離屯、管中（同時(shí)做多管）。
[0049] 似加入800 y 1 65 °C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，禍旋振蕩充分混勻，65 °C水浴 50min，每隔lOmin輕輕顛倒混勻一次，目的是充分反應(yīng)，破壞細(xì)胞。
[0化0]