No累積降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法、靶點及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術領域，涉及N0累積降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法、靶點及應用。
【背景技術】
[0002]銅綠假單胞菌(ΡΑ0)是一種非常重要的機會致病菌，被認為是醫(yī)院感染性疾病三大致死菌之一。在人體免疫力低下的情況例如患有慢性疾病的人群，器官移植的病人或大面積燒傷的病人等等，它能引起各種不同的急性或是慢性感染甚至導致死亡，特別是敏感患者免疫系統(tǒng)和囊性纖維化(CF):超過80%的CF患者死于這些感染。銅綠假單胞菌對大部分的抗生素(頭孢菌素、青霉素、氟喹諾酮類原料藥和氨基糖甙類的抗生素)都有強的抗藥性。目前臨床應用的抗生素其作用靶點僅限于蛋白合成、細胞壁、DNA復制、細胞膜和葉酸輔酶等等，數量極為有限，而且存在嚴重的耐藥性問題。細菌的侵襲力是其感染宿主并導致疾病的能力，而細菌的侵襲力取決于細菌所產生的毒性因子及其損傷宿主的作用機制。病原菌通過釋放多種毒素類蛋白破壞宿主細胞的正常生理功能，甚至導致宿主細胞的死亡。近年來研究發(fā)現將細菌的侵襲力作為靶點來開發(fā)新型抗生素，可以通過抑制細菌致病性從而達到治療細菌感染類疾病的目的，而且由于其對細菌的生長不產生影響，因此可以較少或者避免傳統(tǒng)抗生素所引起的細菌耐藥性問題的出現。
[0003]綠膿菌素(PCN)是銅綠假單胞菌一種重要的侵襲力因子。PCN是一種易穿透生物膜的藍色吩嗪化合物，常見于CF患者感染銅綠假單胞菌的痰液中。最近動物模型實驗結果顯示，PCN是銅綠假單胞菌侵染過程中的關鍵化合物，其所具有的毒力能顯著的減少靶點所侵染組織器官中的細胞，同時PCN還能抑制呼吸道上皮細胞的纖毛蠕動，并增加胞內過氧化物產生。目前已經報道一些化合物能夠不同程度抑制銅綠假單胞菌綠膿菌素的合成，如兒茶素(2?4mM)能夠減少50% PCN的合成；丁子香酚(50?400 μπι)能夠減少56% PCN的合成；云南白藥(2.5g/l)能夠減少76.5% PCN的合成。但這些化合物多存在用藥量大、對PCN合成抑制效率不高的問題，并且其中很多本身就具有強的殺菌性，這樣不僅會增加菌株的耐藥性，而且會影響人體內正常菌群的生長，損害人體健康。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明解決的問題在于提供一種N0累積降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法、靶點及應用，從“降低細菌侵襲力”角度出發(fā)，尋找到了一種新的能有效抑制銅綠假單胞菌侵襲力因子的途徑，相關藥物靶點可應用于藥物的制備。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術方案來實現:
[0006]一種降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法，在銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中，通過外源N0供體或內源N0代謝阻斷的方式達到N0累積，以降低銅綠假單胞菌的侵襲力因子綠膿菌素的產生。
[0007]所述的外源N0供體包括能夠直接或間接向銅綠假單胞菌提供N0的化合物，外源NO供體存在于銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中。
[0008]所述的內源N0代謝阻斷的調控包括對N0代謝相關酶的抑制或、阻斷或增強。
[0009]其特征在于，所述的內源N0代謝阻斷是向銅綠假單胞菌中克隆入能夠與N0代謝相關酶重組并使其功能缺失的質?；蜉d體；或者采用N0代謝相關酶的抑制劑，使其酶活降低或喪失，達到N0在銅綠假單胞菌中的積累；或者采用基因重組或使用激動劑使有利于內源N0產生的酶的增強，達到N0在銅綠假單胞菌中的積累。
[0010]一種能夠促使銅綠假單胞菌侵襲力降低的靶點，所述的靶點包括銅綠假單胞菌胞內與N0代謝相關的基因位點、與N0代謝相關的酶；
[0011]與N0代謝相關的基因位點、與N0代謝相關的酶被抑制或激活后能夠達到N0累積，降低銅綠假單胞菌的侵襲力因子綠膿菌素的產生。
[0012]在銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中通過外源N0供體或內源N0代謝阻斷的方式達到N0累積，以降低銅綠假單胞菌的侵襲力因子綠膿菌素產生的應用。
[0013]N0供體化合物在制備降低銅綠假單胞菌的侵襲力的藥物中的應用。
[0014]能夠對銅綠假單胞菌N0代謝阻斷的質粒、載體或化合物在制備降低銅綠假單胞菌的侵襲力的藥物中的應用。
[0015]所述的應用包括:
[0016]以N0代謝的拮抗、抑制或阻斷的方式實現N0代謝阻斷的化合物在制備降低銅綠假單胞菌的侵襲力的藥物中的應用；
[0017]以N0代謝途徑中關鍵酶分子為作用靶點或重組靶點的酶、載體或化合物在制備降低銅綠假單胞菌的侵襲力的藥物中的應用。
[0018]以銅綠假單胞菌的N0還原酶為作用靶點的藥物或載體在制備降低銅綠假單胞菌的侵襲力的藥物中的應用。
[0019]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:
[0020]1)本發(fā)明提供了利用N0累積降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法、靶點及應用，利用外源的微量N0供體或內源的N0聚集有效抑制銅綠假單胞菌侵襲力因子的生物合成，其中僅用微量的N0即可實現對銅綠假單胞菌PCN的顯著抑制(60 μ M SNP處理，PCN合成減少82% )，具有高效的特點；這為治療銅綠假單胞菌感染提供了一種可能的新方法以及一系列藥物靶點。
[0021 ] 2)本發(fā)明中的N0下游代謝的關鍵酶Nor若被抑制將產生與外源N0供體相同抑制侵襲力的效果(缺失Nor的突變株相比野生株其PCN合成減少84% )，因此以N0為代表的N0代謝相關酶將是抑制N0累積，從而降低銅綠假單胞菌侵襲力的有效靶點，是一個有效的藥物制備針對的靶點。
[0022]3)本發(fā)明涉及的N0供體，比如硝普鈉(SNP)于1929年就開始用于臨床，其本身就是一種傳統(tǒng)的強效、速效血管擴張藥，所以在安全性上沒有問題。而且本發(fā)明進一步通過實驗證實SNP與傳統(tǒng)抗生素沒有拮抗作用，鑒于其提供可促使N0累積從而降低銅綠假單胞菌侵襲力，擴展了 SNP的應用，使其可以與抗生素聯合用進行銅綠假單胞菌抑制藥物的制備。
[0023]4)本發(fā)明從“抗細菌侵染力”角度出發(fā)尋找新型抗菌物質。N0在其不抑菌、殺菌的前提下，可以抑制病原菌的侵染力，不會給細菌本身帶來生存壓力，可以較少或者避免耐藥性的產生，因此利用N0累積進行抑制細菌感染類藥物的制備，有助于解決臨床上細菌耐藥性帶來的難題。
[0024]5)本發(fā)明用N0供體，或通過抑制銅綠假單胞菌N0代謝相關酶，作為抗細菌感染類疾病的方式，將不會像傳統(tǒng)抗生素那樣影響人體的正常微生物群體，而人體正常微生物群體對人體健康有著非常重要的作用。
【附圖說明】
[0025]圖1為N0供體SNP對PA01生長和PCN合成的影響；(其中A為不同濃度SNP對PA01生長的影響為不同濃度SNP對PA01產PCN的影響；C為不同濃度SNP對PA01產PCN的影響趨勢圖)
[0026]圖2為60 μ M SNP對臨床分離銅綠假單胞菌生長和PCN合成的影響；(A為60 μ ΜSNP對臨床分離銅綠假單胞菌生長的影響；B為60 μ M SNP對臨床分離銅綠假單胞菌PCN合成的影響)
[0027]圖3為nor基因敲除及PCR和抗性檢測；(A為nor基因的結構以及含有插入Gm抗性nor基因結構；B為Δ nor菌株的PCR驗證；C為Δ nor菌株的抗性驗證)
[0028]圖4為一氧化氮還原酶Nor對PA01和PA515生長的影響；(A為PA01與其Δ nor突變株PAN1的生長差異；B為P515與其Δ nor突變株PAN515的生長差異；)
[0029]圖5為一氧化氮還原酶Nor對PA01和PA515PCN合成的影響。(A為PA01與其Δ nor突變株PAN1的產PCN的差異為P515與其Δ nor突變株PAN515的產PCN的差異，C為提取的PCN比色比較)。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0031]本發(fā)明提供一種降低銅綠假單胞菌侵襲力的方法，在銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中，通過外源N0供體或內源N0代謝調控的方式達到N0累積，以降低銅綠假單胞菌的