一株降解含酯鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。更具體地，涉及一株降解含醋鍵農(nóng)藥的 銅綠假單胞菌菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)藥的大量、頻繁使用已給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，特別是擬除蟲(chóng)菊 醋類殺蟲(chóng)劑和甲氧基丙帰酸醋類殺菌劑的廣泛使用帶來(lái)的農(nóng)藥殘留污染問(wèn)題不容忽視。該 兩類農(nóng)藥均是結(jié)構(gòu)上含有醋鍵的農(nóng)藥，是目前農(nóng)藥市場(chǎng)上的主要類型。大量研究表明，該兩 類農(nóng)藥殘留不但對(duì)非祀標(biāo)生物如蜜蜂、魚(yú)類和水生無(wú)脊椎動(dòng)物等造成極大的危害，而且對(duì) 人類和其他哺乳動(dòng)物具有慢性毒性，長(zhǎng)期接觸或攝入該兩類農(nóng)藥將導(dǎo)致慢性疾病，甚至有 致癌、致崎、致突變的危險(xiǎn)。因此，消除環(huán)境中的擬除蟲(chóng)菊醋類和甲氧基丙帰酸醋類農(nóng)藥殘 留污染已成為科研工作者亟待解決的具有重大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義的科研命題。
[0003] 近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，人們迫切需要無(wú)農(nóng)藥殘留污染的綠色食品和 清潔環(huán)境。而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中農(nóng)藥也不可減少。因此，尋求高效、安全、經(jīng)濟(jì)的農(nóng)藥殘留 處理新技術(shù)，解決病蟲(chóng)害防治用藥與農(nóng)藥殘留的矛盾，顯得尤為必要。生物降解是農(nóng)藥殘留 治理的新領(lǐng)域、新途徑，與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、環(huán)境友好等 優(yōu)點(diǎn)，擁有廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)際上已有利用微生物成功治理石油污染的先例。國(guó)內(nèi)的北 京佳農(nóng)新貿(mào)易發(fā)展有限公司已成功生產(chǎn)"比亞"降解酶制劑用于治理有機(jī)磯類農(nóng)藥污染。但 是，目前還沒(méi)有專口針對(duì)含醋鍵農(nóng)藥的微生物及其生物降解制劑產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株降解含醋鍵農(nóng)藥的銅綠假 單胞菌菌株。該菌株能有效降解高效氯氯菊醋、高效氯氣氯菊醋、漠氯菊醋、氯氯菊醋、甲氯 菊醋、聯(lián)苯菊醋、離菌醋、化哇離菊醋和嚼菌醋等含有醋鍵的農(nóng)藥，因此，該菌株在水體、± 壤等環(huán)境中的農(nóng)藥殘留去除方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明另一目的是提供上述菌株在制備降解含醋鍵農(nóng)藥的制劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供一種降解含醋鍵農(nóng)藥的制劑。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供上述菌株在降解含醋鍵農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一株降解含醋鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌aerwinosa)菌株P(guān)A01，所述菌 株于2014年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)，保藏號(hào)是CCTCC NO: M 2014630。所述中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也的地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。
[000引 所述銅綠假單胞菌aerwinosa)菌株P(guān)A01通過(guò)富集培養(yǎng)法對(duì)野生 型菌株進(jìn)行反復(fù)篩選復(fù)壯而來(lái)，使其具有高度耐藥、降解穩(wěn)定的能力。
[0010] 所述銅綠假單胞菌aerwifliosa)菌株P(guān)A01在LB固體平板中生長(zhǎng) 較快，菌落形態(tài)為黃綠色、中央凸起、邊緣扁平。通過(guò)生理生化特性測(cè)定，顯示該菌株屬于革 蘭氏陰性桿菌，好氧，氧化酶、明膠液化、硝酸鹽還原反應(yīng)陽(yáng)性；剛巧反應(yīng)陰性。該菌可分解 利用葡萄糖和木糖；不分解利用藏糖和乳糖。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌（Aew/offlmas aerwinosa)菌株P(guān)A01能有 效降解高效氯氯菊醋、高效氯氣氯菊醋、漠氯菊醋、氯氯菊醋、甲氯菊醋、聯(lián)苯菊醋、離菌醋、 化哇離菌醋和嚼菌醋等含有醋鍵的農(nóng)藥，因此本發(fā)明要求保護(hù)菌株P(guān)A01在制備降解含醋 鍵農(nóng)藥的制劑中的應(yīng)用。
[0012] 一種降解含醋鍵農(nóng)藥的制劑，含如上所述的銅綠假單胞菌菌株P(guān)A01和其他輔劑。
[0013] 所述菌株在降解水體或±壤中含醋鍵農(nóng)藥的應(yīng)用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 1.本發(fā)明提供了一株銅綠假單胞菌aerwinosa)菌株P(guān)A01,經(jīng)試驗(yàn)證 明，該菌株能在短時(shí)間內(nèi)有效降解高效氯氯菊醋、高效氯氣氯菊醋、漠氯菊醋、氯氯菊醋、甲 氯菊醋、聯(lián)苯菊醋、離菌醋、化哇離菌醋和嚼菌醋等含有醋鍵的農(nóng)藥，降解效率高。
[001引 2.本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌菌株P(guān)A01環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，使用方便，因此，該菌株 在修復(fù)農(nóng)藥殘留污染的水體、±壤等環(huán)境方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1.菌株P(guān)A01降解高效氯氯菊醋產(chǎn)生明顯透明圈。
[0017] 圖2.菌株P(guān)A01隨時(shí)間降解高效氯氯菊醋（100 y g/mL)的HPLC色譜圖。
[0018] 圖3.菌株P(guān)A01降解不同濃度高效氯氯菊醋的比降解速率。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。W下實(shí)施例為本 發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做任何形式的限定。本發(fā)明主要闡述所 述菌株W及基于所述菌株的應(yīng)用思想，實(shí)施方式中簡(jiǎn)單參數(shù)的替換不能一一在實(shí)施例中費(fèi) 述，但并不因此限制本發(fā)明，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修 飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，應(yīng)被視為等效的置換方式，都應(yīng)包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0020] 除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè) 備。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購(gòu)。
[002。 實(shí)施例1菌株P(guān)A01的富集培養(yǎng) 本發(fā)明人通過(guò)富集培養(yǎng)法對(duì)野生型菌株P(guān)A01進(jìn)行反復(fù)篩選復(fù)壯，使具有高度耐藥、降 解穩(wěn)定的能力。用來(lái)富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(配方為；(NH4)2S04，2 g; M拆04，0.2 g; CaCl], 0.01 g; FeS〇4, 0.005 g; MnCl；^, 0.002 g; K2HPO4, 10. 5 g;皿2口〇4, 4.5 g, 蒸觸水1000 mL，pH 7. 5)。同時(shí)加入高效氯氯菊醋原藥母液值MSO為溶劑），使高效氯氯菊 醋初始質(zhì)量濃度為50 113/111以于30 ° C、150 r/min搖床下進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后， 按10%的接種量轉(zhuǎn)接到第二批含100 yg/mL高效氯氯菊醋的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。相同條件培 養(yǎng)7 d后，再按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含高效氯氯菊醋為200 y g/mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù) 培養(yǎng)7 d。W此類推，不斷增加農(nóng)藥的選擇壓力，反復(fù)篩選。最后取0.2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵 液均勻涂抹到含高效氯氯菊醋的固體平板中反復(fù)進(jìn)行劃線分離，直至得到單菌落，并使用 高效液相色譜法（WLC )驗(yàn)證其降解效果。
[0022] 將所述菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)，保藏日期是2014年12月5 日，保藏號(hào)是CCTCC M 2014630,所述菌株命名為銅綠假單胞菌（Aew/offlmas aerwinosa) 菌株P(guān)AOl。
[0023] 所述中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也的地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。
[0024] 實(shí)施例2菌株P(guān)A01的生理生化特性 所述銅綠假單胞菌aerwinosa)菌株P(guān)A01在LB固體平板中生長(zhǎng)較快， 菌落形態(tài)為黃綠色、中央凸起、邊緣扁平。通過(guò)生理生化特性測(cè)定，顯示該菌株屬于革蘭氏 陰性桿菌，好氧，氧化酶、明膠液化、硝酸鹽還原反應(yīng)陽(yáng)性；剛巧反應(yīng)陰性。該菌可分解利用 葡萄糖和木糖；不分解利用藏糖和乳糖。
[002引實(shí)施例3菌株P(guān)A01降解農(nóng)藥試驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（同實(shí)施例1)中分別加入高效氯氯菊醋、高效氯氣氯菊醋、漠氯菊醋、氯 氯菊醋、甲氯菊醋、聯(lián)苯菊醋、離菌醋、化哇離菌醋和嚼菌醋，使其終濃度為100 y g/mL ;接 種量為0.2 g/L，并設(shè)不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，30 ° C培養(yǎng)0~5 d，定期取樣，應(yīng)用HPLC檢 測(cè)農(nóng)藥的殘留量并計(jì)算降解率，結(jié)果見(jiàn)表1所示。結(jié)果表明，菌株P(guān)A01在短時(shí)間內(nèi)可有效降 解高效氯氯菊醋、高效氯氣氯菊醋、漠氯菊醋、氯氯菊醋、甲氯菊醋、聯(lián)苯菊醋、離菌醋、化哇 離菌醋和嚼菌醋，5 d內(nèi)對(duì)上述農(nóng)藥的降解率分別達(dá)到91. 4%、86. 1%、84. 5%、82. 8%、70. 2%、 52. 2%、87. 7%、86. 3%和68. 0%，具有較好的生物降解效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株降解含酯鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌aerygifliosa)菌株P(guān)A01，其特 征在于，所述菌株于2014年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號(hào)是 CCTCC M 2014630。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形態(tài)為黃綠色、中央凸起、 邊緣扁平。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于，所述含酯鍵農(nóng)藥為高效氯氰菊酯、高效氯氟 氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯中的一種 或多種。
4. 權(quán)利要求1或2所述菌株在制備降解含酯鍵農(nóng)藥的制劑中的應(yīng)用。
5. -種降解含酯鍵農(nóng)藥的制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌菌 株P(guān)A01和其他輔劑。
6. 權(quán)利要求1或2所述菌株在降解含酯鍵農(nóng)藥中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1或2所述菌株在降解水體或土 壤中含酯鍵農(nóng)藥的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一株降解含酯鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株P(guān)AO1，菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2014630。所述菌株降解譜廣，可降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯鍵的農(nóng)藥。該菌株環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，降解效果好，使用方便，可用于降解含有酯鍵的農(nóng)藥，在水體、土壤等環(huán)境中的農(nóng)藥殘留去除方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。CCTCC NO: M 201463020141205
【IPC分類】B09C1-10, C12R1-385, C02F3-34, C12N1-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104673704
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410774238
【發(fā)明人】張煉輝, 陳少華, 常長(zhǎng)青, 鄧音樂(lè), 劉詩(shī)胤
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日