侵襲力因子綠膿菌素的產(chǎn)生。
[0032]所述的外源N0供體包括能夠直接或間接向銅綠假單胞菌提供N0的化合物，外源N0供體存在于銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中。具體的，本發(fā)明利用微量N0供體來抑制銅綠假單胞菌侵襲力因子之一的綠膿菌素(PCN)的生物合成，能夠在不殺死細(xì)菌的前提下降低細(xì)菌的侵襲力。
[0033]所述的內(nèi)源N0代謝的調(diào)控包括對N0代謝相關(guān)酶的抑制、阻斷或增強(qiáng)。所述的內(nèi)源N0代謝阻斷是向銅綠假單胞菌中克隆入能夠與N0代謝相關(guān)酶重組并使其功能缺失的質(zhì)?；蜉d體；或者采用N0代謝相關(guān)酶的抑制劑，使其酶活降低或喪失，達(dá)到N0在銅綠假單胞菌中的積累；或者采用基因重組或使用激動劑使有利于內(nèi)源N0產(chǎn)生的酶的增強(qiáng)，達(dá)到N0在銅綠假單胞菌中的積累。具體的以與內(nèi)源N0積累有關(guān)的N0還原酶(Nor)作為代表。通過構(gòu)建缺失Nor的突變株研究了此靶點(diǎn)對PCN生物合成的影響。結(jié)果表明，外源加入微量的N0供體或抑制作用靶點(diǎn)Nor均可以顯著減少銅綠假單胞菌PCN的生物合成。
[0034]本發(fā)明還提供能夠促使銅綠假單胞菌侵襲力降低的的靶點(diǎn)，所述的靶點(diǎn)包括銅綠假單胞菌胞內(nèi)與N0代謝相關(guān)的基因位點(diǎn)、與N0代謝相關(guān)的酶；
[0035]與NO代謝相關(guān)的基因位點(diǎn)、與N0代謝相關(guān)的酶被抑制或激活后能夠達(dá)到N0累積，降低銅綠假單胞菌的侵襲力因子綠膿菌素的產(chǎn)生。
[0036]基于上述表述，本發(fā)明提供在銅綠假單胞菌的生存或培養(yǎng)環(huán)境中通過外源N0供體或內(nèi)源N0代謝阻斷的方式達(dá)到N0累積，以降低銅綠假單胞菌的侵襲力因子綠膿菌素產(chǎn)生的應(yīng)用。
[0037]下面給出本發(fā)明的一些說明:
[0038]1)利用微量N0供體有效抑制銅綠假單胞菌侵襲力因子的生物合成
[0039]所述的銅綠假單胞菌為一種條件致病菌，本發(fā)明涉及其模式菌株P(guān)A01及臨床分離的銅綠假單胞菌株。
[0040]所述的侵襲力因子為銅綠假單胞菌的次級代謝產(chǎn)物綠膿菌素，綠膿菌素屬于吩嗪化合物，其分子式C13H1QN2。。
[0041]外源微量的N0供體來抑制銅綠假單胞菌綠膿菌素PCN的生物合成。其中涉及的N0供體可以為硝普鈉SNP (Na2Fe (CN) 5N0)，亞硝基谷胱甘肽GSN0 (C10H16N407S)等。
[0042]2)利用選擇性抑制N0下游代謝靶點(diǎn)有效抑制銅綠假單胞菌侵襲力因子的生物合成
[0043]所述的銅綠假單胞菌N0下游代謝的關(guān)鍵酶一一N0還原酶，此酶的作用是將胞內(nèi)的N0轉(zhuǎn)化為N20，避免過量N0積累對細(xì)胞造成不利影響。
[0044]所述的選擇性抑制是本發(fā)明通過基因敲除手段構(gòu)建了缺失Nor的突變菌株。
[0045]實(shí)施例1:通過平板培養(yǎng)確定N0供體SNP能夠顯著抑制銅綠假單胞菌PCN的生物合成
[0046]本案例所用菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)模式菌株P(guān)A01 (較為常見，從各保藏中心即可獲得)。本菌為專性需氧菌，37°C培養(yǎng)普通細(xì)菌培養(yǎng)基(如LB培養(yǎng)基)20?24ho
[0047]本案例通過加入不同濃度SNP的多組平板樣品和一個空白平板樣品來研究N0對菌體PCN合成的影響。其中各組樣品SNP的終濃度分別為20，40，60，80，100 μ M。在ΡΑ01培養(yǎng)22h后，利用氯仿萃取平板中菌體產(chǎn)生的PCN，濃縮，然后用鹽酸顯色，根據(jù)顯色液在520nm處的光吸收值來確定菌體產(chǎn)PCN的水平。
[0048]結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示隨著平板中SNP濃度的增大，銅綠假單胞菌PCN合成明顯減少，在20 μ Μ?60 μ Μ濃度范圍內(nèi)的PCN減少趨勢顯著，當(dāng)大于60 μ Μ減少趨于平緩，可見60 μ Μ是較為理想的濃度(圖1中C所示)。
[0049]實(shí)施實(shí)例2:通過搖瓶培養(yǎng)確定SNP能夠顯著抑制銅綠假單胞菌PCN的生物合成且不會給菌體的生長帶來壓力
[0050]實(shí)施依據(jù):
[0051]1)菌體生長的檢測:通過每2小時菌液在600nm處的光吸收值來確定菌體的生長情況。
[0052]2)PCN檢測:利用氯仿萃取菌液中菌體產(chǎn)生的PCN，濃縮，然后用鹽酸顯色，根據(jù)顯色液在520nm處的光吸收值來確定菌體產(chǎn)PCN的水平。
[0053]具體實(shí)施:
[0054]本案例所用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)模式菌株P(guān)A01 ;臨床菌株分離自陜西省人民醫(yī)院，分離方法如下:對有正常菌群存在的臨床標(biāo)本或采自環(huán)境中的標(biāo)本接種選擇性培養(yǎng)基如麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC);對無正常菌群存在的臨床標(biāo)本如血液、腦脊液、穿刺液等接種普通或血瓊脂培養(yǎng)基。該菌氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖。液化明膠、可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)猓胚彡幮?，不產(chǎn)生H2S，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性，綜合以上生理生化特征確定分離得到的菌株為銅綠假單胞菌。
[0055]本案例通過搖瓶培養(yǎng)確定SNP對PA01生長和PCN的生物合成的影響。設(shè)計(jì)加入不同濃度SNP的多組樣品和一個空白樣品來研究N0對菌體生長和PCN合成的影響。其中各組樣品SNP的終濃度分別為20，60，100, 140，160和200 μ M。搖瓶培養(yǎng)期間每隔2h進(jìn)行取樣，進(jìn)行菌體生長檢測和PCN檢測。結(jié)果如圖1中的A、B所示，當(dāng)N0供體SNP濃度小于100 μ Μ時，其對銅綠假單胞菌模式菌株ΡΑ01生長影響較小。在20?100 μ Μ之間隨著SNP濃度增大PCN合成顯著減少，且在60 μ M PCN的減少量與菌體生長減少量的比值最大，這說明60 μΜ的SNP在對菌體生長影響較小的情況下，對PCN合成的抑制作用最為顯著。
[0056]最后對臨床分離銅綠假單胞菌進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，得到了相似的結(jié)果，證明與Ν0供體共培養(yǎng)對銅綠假單胞菌的PCN合成抑制具有普適性(如圖2，其中對生長的影響、對PCN合成的抑制分別如A、B所示)。
[0057]實(shí)施實(shí)例3:對N0還原酶(Nor)這一靶點(diǎn)進(jìn)行抑制，構(gòu)建缺失Nor的突變菌株
[0058]實(shí)施原理:編碼Nor基因的敲除:首先構(gòu)建含有抗性插入片段nor基因的質(zhì)粒，此時nor由于插入了抗性片段而無法表達(dá)。通過三親株雜交將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入到PA01中，由于重組質(zhì)粒和基因組上的nor基因含有相同的同源臂，通過同源重組使質(zhì)粒上插入失活的nor基因置換了基因組上的nor基因，從而使PA01無法表達(dá)nor基因，也就無法合成Nor，從而影響N0的正常代謝，實(shí)現(xiàn)N0累積。
[0059]具體實(shí)施:首先構(gòu)建nor兩端的引物，然后通過PCR獲得nor基因。然后通過2次酶切、連接構(gòu)建了含有插入Gm抗性nor基因的重組質(zhì)粒--nor-pexGm。
[0060]得到目的片段nor-pexGm后，純化后用不同的酶切后，與相應(yīng)酶切處理的質(zhì)粒pEX 18-Amp 或 pE)(18-Tc 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用含 Χ-gal 和 AMP (50 μ g/ml)或 TET (15 μ g/ml)的LB平板篩選陽性克隆。酶切驗(yàn)證后(如圖3B所示)，再向重組質(zhì)粒的PCR片段(norBC中的部分片段，如圖3A)中克隆入來源于pZ1918-LacZ的lacZ_GM片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用含有GM(15yg/ml)的LB固體平板篩選并驗(yàn)證lacZ-GM片段插入方向，最終構(gòu)建成用于基因敲除的重組質(zhì)粒(如圖3A，其中與nor基因相關(guān)的片段為morBC-GM片段)。
[0061]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，質(zhì)粒上的插入片段(norBC-GM片段)和銅綠假單胞菌基因組上同源片段發(fā)生同源重組，需要三親株雜交的方法。通過三親株雜交種的協(xié)助質(zhì)粒將此質(zhì)粒帶入到目的菌株P(guān)A01中。
[0062]三親株雜交過程如下:
[0063]1.將供體菌(含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，15 μ 1/ml的GM)和介導(dǎo)菌(含有協(xié)助質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌，50 μ g/ml的ΚΑΝ)分別在25mlLB培養(yǎng)基中37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)14小時，受體菌(銅綠假單胞菌)接種在25ml的LB培養(yǎng)基中，置于42°C、200rpm震蕩培養(yǎng)14小時。<