能以監(jiān)測可溶性物質(zhì)諸如酶底物或信號(hào) 傳導(dǎo)分子之間的相互作用。例子包括血液組分諸如葡萄糖，尿酸和尿液，激素諸如類固醇和 細(xì)胞因子，和通過對受體分子結(jié)合施加其功能的藥劑。
[0169] 本納米孔裝置可以實(shí)時(shí)監(jiān)測重要生物結(jié)構(gòu)諸如核糖體的功能，并且用單一功能單 元實(shí)時(shí)此操作。
[0170] 本方法和裝置也可以用于檢測并量化改變的蛋白質(zhì)表達(dá)，缺乏/存在對過量，蛋 白質(zhì)表達(dá)或監(jiān)測治療性干預(yù)期間的蛋白質(zhì)水平。可以使用依照本發(fā)明的納米孔裝置的陣列 評估給定樣品中的蛋白質(zhì)量。也可以利用要移位的多肽或蛋白質(zhì)在范圍為幾天至數(shù)月的時(shí) 段里作為針對上文記錄的疾病和其它腦病癥，狀況，和疾病的治療效力的標(biāo)志物。用于此比 較的定性或定量方法是本領(lǐng)域中公知的。
[0171] 診斷學(xué)
[0172] 可以使用可通過本系統(tǒng)移位的多肽，片段，寡肽，和PNA檢測并量化改變的蛋 白質(zhì)表達(dá)，缺乏/存在對過量，蛋白質(zhì)的表達(dá)或監(jiān)測治療性干預(yù)期間的蛋白質(zhì)水平。與 改變的表達(dá)有關(guān)的狀況，疾病或病癥包括特發(fā)性肺動(dòng)脈高血壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension)，繼發(fā)性月市高血壓（secondary pulmonary hypertension)，細(xì)胞 增殖性病癥（cell proliferative disorder),特別是間變性少突星形細(xì)胞瘤（anaplastic oligodendroglioma)，星細(xì)胞瘤（astrocytoma)，少突星形細(xì)胞瘤（oligoastrocytoma)， 成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（glioblastoma)，腦膜瘤（meningioma)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤（ganglioneuroma)， 神經(jīng)元新生物（neuronal neoplasm),多發(fā)性硬化，亨丁頓（Huntington)氏病，乳腺癌 (breast adenocarcinoma),前列腺癌(prostate adenocarcinoma),胃腺癌(stomach adenocarcinoma)，轉(zhuǎn)移性神經(jīng)內(nèi)分泌癌（metastasizing neuroendocrine carcinoma), 非增殖性纖維囊性和增殖性纖維囊性乳房疾病（nonproliferative fibrocystic and proliferative fibrocystic breast disease),膽囊膽囊炎(gallbladder cholecystitis)和膽石?。╟holelithiasis)，骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis)，和類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis);獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),阿狄森（Addison)氏病，成人呼吸窘迫綜合征（adult respiratory distress syndrome),變態(tài)反應(yīng)，強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis),淀粉樣變 性?。╝myloidosis)，貧血，哮喘，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia)，自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis)，良性前列腺 增生（benign prostatic hyperplasia)，支氣管炎（bronchitis)，切-東二氏綜合 征（Chediak-Higashi syndrome)，膽囊炎，克羅恩（Crohn)氏病，特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis)，皮肌炎（dermatomyositis)，糖尿病，氣腫，胎兒成紅血細(xì)胞增多癥 (erythroblastosis fetalis)，結(jié)節(jié)性紅斑（erythema nodosum)，萎縮性胃炎（atrophic gastritis)，腎小球性腎炎（glomerulonephritis)，古德帕斯丘（Goodpasture)氏綜 合征，痛風(fēng)（gout)，慢性肉芽腫性疾病（chronic granulomatous diseases)，格里夫氏 病（Graves' disease)，橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis)，嗜曙紅細(xì)胞過多 (hypereosinophilia)，過敏性腸綜合征（irritable bowel syndrome)，多發(fā)性硬化，重癥 肌無力（myasthenia gravis)，心肌或心包炎癥，骨關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，胰腺炎，多囊性卵巢 綜合征（polycystic ovary syndrome)，多肌炎（polymyositis)，銀屑?。╬soriasis)， 賴特爾（Reiter)氏綜合癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，硬皮病，重度組合免疫缺陷疾?。╯evere combined immunodeficiency disease，SCID)，斯耶格倫（Sjogren)氏綜合征，系統(tǒng)性過敏 性（systemic anaphylaxis)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus)，系統(tǒng) 性硬化（systemic sclerosis)，血小板減少性紫廠 （thrombocytopenic purpura)，潰瘍 性結(jié)腸炎（ulcerative colitis)，葡萄膜炎（uveitis)，沃納綜合征（Werner syndrome)， 血液透析（hemodialysis)，身體外循環(huán)（extracorporeal circulation)，病毒，細(xì)菌，真 菌，寄生物，原生動(dòng)物，和蠕蟲感染；催乳激素生成病癥，不育（infertility)，包括輸卵管 疾病（tubal disease)，排卵缺陷（ovulatory defect)，和子宮內(nèi)膜異位，動(dòng)情周期破壞 (disruption of the estrous cycle)，月經(jīng)周期破壞（disruption of the menstrual cycle)，多囊性卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome)，卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome)，子宮內(nèi)膜或卵巢腫瘤，子宮纖維瘤（uterine fibroid)， 自身免疫性病癥（autoimmune disorder)，子宮外孕（ectopic pregnancy)，和畸形生長 (teratogenesis);乳腺癌，纖維囊性乳房疾病，和乳漏（galactorrhea);精子發(fā)生破壞 (disruption of spermatogenesis)，異常精子生理學(xué)（abnormal sperm physiology), 良性前列腺增生，前列腺炎，佩羅尼（Peyronie)氏病，陽萎（impotence)，男性乳房發(fā)育 (gynecomastia);光線性角化病（actinic keratosis)，動(dòng)脈硬化（arteriosclerosis)， 粘液囊炎（bursitis)，硬化（cirrhosis)，肝炎，混合性結(jié)締組織?。╩ixed connective tissue disease，MCTD)，骨髓纖維化（myelofibrosis)，陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿 (paroxysmal, nocturnal hemoglobinuria)，真性紅細(xì)胞增多（polycythemia vera)，原發(fā) 性血小板增多癥（primary thrombocythemia)，癌癥并發(fā)癥（complications of cancer)， 癌癥，包括腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸胎癌和特別是腎上腺，膀胱，骨， 骨髓，腦，乳腺，宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)（ganglia)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，副 甲狀腺，陰莖，前列腺，唾腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，和子宮癌。在另一個(gè)方面，本發(fā)明 的多核苷酸。
[0173] 可以使用多肽，片段，寡肽，和PNA或其片段檢測并量化改變的蛋白質(zhì)表達(dá)，缺 乏/存在對過量，蛋白質(zhì)的表達(dá)或監(jiān)測治療性干預(yù)期間的蛋白質(zhì)水平。與改變的表達(dá)有 關(guān)的病癥包括靜坐不能（akathesia)，阿耳茨海默（Alzheimer)氏病，健忘癥（amnesia)， 肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis),共濟(jì)失調(diào)（ataxias),雙相 障礙（bipolar disorder)，緊張癥（catatonia)，腦性麻搏（cerebral palsy)，腦血管 疾病，克-雅二氏?。–reutzfeldt-Jakob disease),癡呆，抑郁，唐氏綜合征（Down's syndrome),遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙（tardive dyskinesia)，肌張力障礙（dystonias)，癲癇 (epilepsy),亨丁頓（Huntington)氏病，多發(fā)性硬化，肌肉萎縮癥（muscular dystrophy), 神經(jīng)痛（neuralgias)，神經(jīng)纖維瘤病（neurofibromatosis)，神經(jīng)病（neuropathies)，帕金 森氏?。≒arkinson's disease),皮克氏?。≒ick's disease),色素性視網(wǎng)膜炎（retinitis pigmentosa)，精神分裂癥（schizophrenia)，季節(jié)性情感障礙（seasonal affective disorder)，老年性癡呆（senile dementia)，中風(fēng)（stroke)，圖列特氏綜合癥（Tourette's syndrome)和癌癥，包括腺癌，黑素瘤，和畸胎癌，特別是腦的。也可以利用這些多肽或蛋白 質(zhì)在范圍為幾天至數(shù)月的時(shí)段里作為針對上文記錄的疾病和其它腦病癥，狀況，和疾病的 治療效力的標(biāo)志物。用于此比較的定性或定量方法是本領(lǐng)域中公知的。
[0174] 例如，可以將多肽或肽通過標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記，并在雜交復(fù)合物形成的條件下添加到 來自患者的生物學(xué)樣品。在溫育期后，將樣品清洗，并將標(biāo)記物（或信號(hào)）的量量化并與標(biāo) 準(zhǔn)值比較。若患者樣品中的標(biāo)記物量與標(biāo)準(zhǔn)值相比顯著改變，則指示關(guān)聯(lián)狀況，疾病或病癥 的存在。
[0175] 為了提供與蛋白質(zhì)表達(dá)有關(guān)的狀況，疾病或病癥的診斷的基礎(chǔ)，建立正?；驑?biāo)準(zhǔn) 的表達(dá)概況。這可以通過在雜交或擴(kuò)增條件下組合從正常受試者（動(dòng)物或人）采集的生物 學(xué)樣品與肽標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^比較使用正常受試者獲得的數(shù)值與使用已知量的基本上純 化的靶序列的實(shí)驗(yàn)的數(shù)值量化標(biāo)準(zhǔn)雜交?？梢员容^以此方式獲得的標(biāo)準(zhǔn)值與從來自在特定 狀況，疾病或病癥方面有癥狀的患者的樣品獲得的數(shù)值。從標(biāo)準(zhǔn)值向那些與特定狀況有關(guān) 的數(shù)值的偏離用于診斷所述狀況。
[0176] 還可以使用此類測定法在動(dòng)物研究中及在臨床試驗(yàn)中評估特定治療性處理方案 的效力或監(jiān)測個(gè)別患者的治療。在將狀況的存在建立并啟動(dòng)治療方案后，可以定期重復(fù)診 斷測定法，以測定患者中的表達(dá)水平是否開始接近在正常受試者中觀察到的水平?？梢允?用從連續(xù)測定法獲得的結(jié)果在范圍為幾天或幾個(gè)月的時(shí)段里顯示治療效力。
[0177] 實(shí)施例1 :用于監(jiān)測蛋白質(zhì)移位的納米孔裝置的構(gòu)律
[0178] 圖IA中圖解此實(shí)施例的納米孔裝置，其代表使用的設(shè)置。納米孔感應(yīng)器制備為具 有脂質(zhì)雙層中包埋的單一 AHL孔，所述脂質(zhì)雙層分開兩個(gè)Teflon? PTFE聚合物孔，其各自 含有100 μ 1 0. 2M KCl溶液（30°C )。在孔間應(yīng)用電壓（反側(cè)+180mV)，引起離子電流流過 通道。電流在存在捕捉的蛋白質(zhì)分子的情況下下降。
[0179] 簡言之，對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將單一 AHL納米孔插入30 μ m直徑脂質(zhì)雙層，其分開兩 個(gè)各含有100 μ I ro緩沖液（ρΗ7· 6)的孔（稱作順式和反式）。使用N端截短的ClpX變 體的共價(jià)連接三聚體（ClpX-AN3)進(jìn)行所有ClpX納米孔實(shí)驗(yàn)。ClpX-Λ N3BLR表達(dá)菌株獲 自 Andreas Martin (UC Berkeley)。在 OD 600 為約 1 時(shí)通過添加 0.5mM IPTG 誘導(dǎo) ClpX 蛋白表達(dá)，并于23°C在搖動(dòng)的情況下溫育3-4小時(shí)。將培養(yǎng)物沉淀，在裂解緩沖液（50mM NaH2P04pH 8, 300mM NaCl, IOOmM KCl, 20mM 咪唑，10%甘油，IOmM BME)中重懸，通過用玻 璃珠渦旋振蕩裂解。在裂解物的離心和過濾后，將蛋白質(zhì)在Ni2+-NTA親和柱（Thermo)和 Uno-Q陰離子交換柱（Bio-Rad)上純化。
[0180] 給順式區(qū)室和反式區(qū)室兩者填充針對ClpX功能優(yōu)化的100μ I 200mM KCl緩 沖液。根據(jù)指示，此緩沖液補(bǔ)充有5mM ATP。膜片鉗放大器（Axopatch 200B, Molecular Devices)在兩個(gè)Ag/AgCl電極之間應(yīng)用恒定的180mV電勢（反側(cè)+)，并記錄通過納米孔 的離子電流作為時(shí)間的函數(shù)。將底物蛋白質(zhì)添加到約1 μ M終濃度的順式溶液，而約IOOnM ClpX存在于反式溶液中。
[0181] 在雙層間應(yīng)用恒定的ISOmV電勢，并通過與電壓鉗模式的集成膜片鉗放大 器（Axopatch 200Β, Molecular Devices)串聯(lián)的Ag/AgCl電極間的納米孔測量離子電 流。將數(shù)據(jù)在全細(xì)胞構(gòu)造 （β = 1)中以IOOkHz帶寬使用模擬至數(shù)字轉(zhuǎn)換器（Digidata 1440Α, Molecular Devices)記錄，然后以5kHz使用模擬低通Bessel濾器過濾。通過F1D/ ATP 5mM和HVATP 4mM的每日制備準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)條件。將ClpX以1:10在HVATP 5mM中稀釋， 在最終4. 5mM ATP中實(shí)現(xiàn)終濃度30-100nM ClpX。使用ClpX溶液填充整個(gè)系統(tǒng)，之后分離 單一 AHL納米孔。在插入后，給順式孔灌注約6mL HVATP 4mM。于30°C用瞬時(shí)孔添加的 1-2 μ M底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)底物捕捉事件由于孔阻塞或在預(yù)先確定的持續(xù)時(shí)間后用反極 性噴出。通常將電壓誘導(dǎo)的移位排出以阻止堵塞并且提高數(shù)據(jù)收集的效率。單一納米孔實(shí) 驗(yàn)定義為離子電流數(shù)據(jù)在由于雙層破裂，通道電導(dǎo)喪失或完成預(yù)置數(shù)目的移位事件而終止 前在完整雙層中從一個(gè)AHL納米孔獲得的時(shí)間。
[0182] 實(shí)施例2 :用于移位的工稈化蛋白SI, S2-35和S2-148
[0183] 圖IC中示意性顯示了用于移位的底物蛋白質(zhì)，其顯示了⑴S1，即一種蛋白質(zhì)，該 蛋白質(zhì)攜帶偶聯(lián)的單一 N端Smt3域和長65個(gè)氨基酸的帶電荷柔性的區(qū)段，其在其羧基端 用11個(gè)氨基酸的ClpX-靶向域（ssrA tag)加帽；（ii)S2-35,其類似于S1，但是在其N端 附加有35個(gè)氨基酸的接頭和第二Smt3域；（iii)S2-148,其與S2-35相同，只是在Smt3域 間的延長的148個(gè)氨基酸接頭。
[0184] 對于我們的初步實(shí)驗(yàn)，我們使用泛素樣蛋白質(zhì)Smt3的修飾形式。Smt3由安排成4 個(gè)β -鏈和單一 α -螺旋的約100個(gè)氨基酸構(gòu)成。我們進(jìn)一步將Smt3工程化改造成Sl。 為了構(gòu)建底物蛋白Sl，將編碼76個(gè)氨基酸尾部的DNA (GGSSGGSGGSGSS⑶GGSSGGSGGSGSS⑶G GSSGGSGGDGSS⑶GGSD⑶SDGSD⑶⑶SD⑶DAANDENYALAA) (SEQ ID N0:1)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)進(jìn)行，并在T/A克隆位點(diǎn)克隆到pET-SUMO載體（Invitrogen)中，將尾部序列融合到 Smt3序列3'端上。
[0185] 76個(gè)氨基酸的尾部含有約10個(gè)帶負(fù)電荷的殘基和11個(gè)氨基酸的Clpx結(jié)合域 s srA〇
[0186] 為了便于納米孔分析，以兩種方式修飾工程化Smt3蛋白Sl，1)它附加有長65個(gè) 氨基酸的甘氨酸/絲氨酸尾部，包括13個(gè)散布的帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基（SEQ ID N0:6)。 此非結(jié)構(gòu)化聚陰離子設(shè)計(jì)為促進(jìn)納米孔間的電場中SI的捕捉和保留?；谄渚w結(jié)構(gòu)13， 預(yù)測Smt3折疊域位于AHL通道（vestibule)頂部（圖1B)。2)附加的聚陰離子在其C端 加帽有ssrA標(biāo)簽，即一種11個(gè)氨基酸的ClpX靶向基序 14。此ssrA肽標(biāo)簽容許ClpX在其 穿過孔進(jìn)入順式區(qū)室中時(shí)特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的C端。
[0187] 通過編碼 35 個(gè)氨基酸的接頭的 DNA (GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG) (SEQ ID N0:2)對SlSmt-3序列的5'端的基于PCR的添加構(gòu)建S2-35(SEQ ID N0:5)。然 后，將此接頭修飾的SI基因在BsaI位點(diǎn)克隆到pE-SUMO載體（LifeSensors)中，將添加的 接頭和SI序列與pE-SUMO Smt3序列的3'端融合。
[0188] 將用于 S2-148 (SEQ ID NO: 6)接頭添加的 DNA (GGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSA GSRGSGASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGS GASGSAGSGSSGS) (SEQ ID N0:3)通過PCR構(gòu)建，并通過Gibson裝配方法克隆到S2-35載體 中，在35個(gè)氨基酸的接頭區(qū)內(nèi)。將這些工程化蛋白質(zhì)在大腸桿菌菌株BL21 (DE3) *中表達(dá)。 在約0. 60D 600通過添加0. 5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并于37°C在搖動(dòng)的情況中溫育4-6小時(shí)。 將培養(yǎng)物沉淀，在裂解緩沖液中重懸，通過用玻璃珠渦旋振蕩裂解。在裂解物的離心和過濾 后，將蛋白質(zhì)在Ni2+-NTA親和柱（Thermo)上純化。
[0189] 實(shí)施例3 :蛋白Sl移位的檢測
[0190] 圖2A中顯示了在存在ClpX和ATP的情況中蛋白Sl的捕捉和移位的代表性離子 電流跡線。圖2A顯示了 Sl移位期間的離子電流跡線。（i)在標(biāo)準(zhǔn)條件（約34±2pA，RMS 噪音1.2±0,1pA)下通過AHL納米孔的開放通道電流。（ii)Sl底物的捕捉。在蛋白質(zhì)捕 捉后，離子電流下降到約HpA(約0. 7pA RMS噪音）。（iii)ClpX介導(dǎo)的陡變狀態(tài)。離子電 流降低到低于10pA，并且特征在于一個(gè)或多個(gè)逐漸的振幅過渡。此樣式僅在存在ClpX和 ATP的情況中觀察到（反式區(qū)室）。（iv) Smt3域折疊和移位通過納米孔（約3. 8pA, I. 7pA RMS噪音）。（V)在完成底物移位到反式區(qū)室后返回到開放通道電流。從開放通道電流約 34±2pA(圖2A，i)，Sl捕捉導(dǎo)致電流下降到約HpA(圖2A，ii)。此穩(wěn)定的電流持續(xù)數(shù)十 秒，并且在存在或缺乏對反式區(qū)室添加的ClpX和ATP的情況中觀察到（圖4)。這與由在孔 電場中作用于有電荷的多肽尾部的電場力在孔通道頂部保持固定的Smt3結(jié)構(gòu)一致。在存 在ClpX和ATP的情況中，此初始電流狀態(tài)經(jīng)常繼之以進(jìn)行性向下電流斜坡，達(dá)到平均值約 10pA，中值持續(xù)時(shí)間是4. 3秒（圖2A，iii和圖5)。用蛋白Sl觀察到此電流斜坡（current ramp)，在ClpX和ATP存在時(shí)在約5. 5小時(shí)的實(shí)驗(yàn)里總共45次；比較而言，在ClpX和ATP 從反式溶液中缺乏時(shí)在約2. 3小時(shí)的實(shí)驗(yàn)里在狀態(tài)ii后從來沒有觀察到斜坡。在大多數(shù) 的事件中，ClpX依賴性陡變狀態(tài)以突然的離子電流降低至約3pA結(jié)束（圖2A，iv)。狀態(tài)iv 的中值持續(xù)時(shí)間是約700ms (圖3A)，之后其以快速升高到開放通道電流結(jié)束（圖2A，v)。
[0191]