用于酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)移位的納米孔傳感器的制造方法
【專利說明】用于酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)移位的納米孔傳感器
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年2月16日由Jeffrey Nivala提交的題目為"Unfolding and Translocation of Proteins Through a Nanopore Sensor and Methods of Use，'的美國 臨時專利申請No. 61/599, 754,及2012年10月12日由Jeffrey Nivala等提交的題目為 "Nanopore Sensor for Enzyme-Mediated Protein Translocation" 的美國臨時專利申請 No. 61/713, 163的優(yōu)先權(quán)，兩者在此通過提及完整并入。
[0003] 政府支持的聲明
[0004] 本發(fā)明在國立健康研究所授予的合同R01HG006321和國立人基因組研究研究所 授予的合同24033-444071下在政府支持下進(jìn)行。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005] 提及序列表、計算機(jī)程序或光盤
[0006] 根據(jù) "EFS-Web 法律框架（Legal Framework for EFS-Web) "（11 年 4 月 06 日）， 申請人隨本文一起以ASCII文本文件提交序列表。文本文件會充當(dāng)根據(jù)37CFR 1. 821 (c) 需要的紙質(zhì)拷貝和根據(jù)37CFR 1.821(e)需要的計算機(jī)可讀形式（CRF)兩者。創(chuàng)建文件的 日期是2/13/2013,并且以字節(jié)計的ASCII文本文件大小是24, 576。申請人通過提及完整 并入序列表的內(nèi)容。 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明涉及單分子蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域并且還涉及納米孔分析領(lǐng)域。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 下文呈現(xiàn)了關(guān)于本發(fā)明的某些方面的背景信息，因為它們可以涉及發(fā)明詳述中提 及但不一定詳細(xì)描述的技術(shù)特征。也就是說，本發(fā)明中使用的各個組合物或方法可以在下 文討論的出版物和專利中更為詳細(xì)地描述，該出版物和專利可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供進(jìn) 一步指導(dǎo)以進(jìn)行或使用如要求保護(hù)的本發(fā)明的某些方面。下文的討論不應(yīng)解釋為承認(rèn)描述 的專利或出版物的關(guān)聯(lián)性或現(xiàn)有技術(shù)作用。
[0010] 納米孔（nanopore)已經(jīng)用于各種生物感測應(yīng)用，最普遍的應(yīng)用是DNA分析（例如 測序）。類似地，還設(shè)想了蛋白質(zhì)的納米孔測序。然而，與核酸不同，蛋白質(zhì)一般不是均一帶 電荷的（使得難以通過應(yīng)用的電壓驅(qū)動移位），并且它們還折疊成復(fù)雜的，較大的，且穩(wěn)定 的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)不能橫穿納米孔徑。更具體地，蛋白質(zhì)測序比DNA測序在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性 的原因包括：i)與DNA測序的4種核苷酸相比蛋白質(zhì)中存在20種不同的天然氨基酸（不 包括翻譯后和表遺傳（印igenetic)修飾）；ii)必須將三級和二級結(jié)構(gòu)兩者解折疊以容許 變性的蛋白質(zhì)以單一行列次序通過納米孔感應(yīng)器；以及iii)盡管沿著多肽主鏈的電荷不 一致，但是必須實現(xiàn)變性多肽行進(jìn)單向移位到納米孔電場。
[0011] 納米孔用于對生物聚合物測序的用途在超過10年前提出（Pennisi, E. Search for pore-fection. Science 336, 534-537 (2012), Church, G. M. , Deamer, D. ff. , Branton, D. ,Baldarelli, R. &Kasianowicz, J. Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interaction)〇
[0012] 基于酶的 DNA 移位控制（Cherf，G. M.，Lieberman，K. R. , Rashid, Hythamj R. , Lamj C. E. , Karplusj K. &Akeson, M. Automated iiForward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-A precision，，'Nat. Biotechnol. 30, 344-348 (2012).)及使用改良生物孔的DNA核苷酸解析（Manrao, et al. "DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase，"Nat. Biotechnol. 30, 349-353(2012))的最近進(jìn)展已經(jīng)為 2012 年晚期 預(yù)期用于商業(yè)推廣的納米孔DNA測序儀打好基礎(chǔ)（Hallam，K. "Oxford nanopore to sell tiny DNA sequencer，，'Bloomberg，published online 17 February 2012, Hayden, E. Nanopore genome sequencer makes its debut. Nature, published online 17February 2012)。
[0013] 雖然蛋白質(zhì)運(yùn)動通過納米孔已經(jīng)得到建立（Mohammadet al. .，"Controlling a single protein in a nanopore through electrostatic traps, J. Am. Chem. Soc. 130, 4081-4088 (2008)，Talaga，D. S. &Li，J. "Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores，"J. Am. Chem. Soc. 131，9287-9297 (2009)，Merstorf，et al. "Wild type, mutant protein unfolding and phase transitiondetected by single-nanopore recoixling，"ACS Chem. Biol. 7, 652-658(2012))，直到現(xiàn)在尚未證明用于解折疊蛋白質(zhì)以 實現(xiàn)受控的，序貫移位的技術(shù)。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 以下簡要概述并不意圖包括本發(fā)明的所有特征和方面，它也不暗示本發(fā)明必須包 括此概述中討論的所有特征和方面。
[0016] 本發(fā)明提供了用于將蛋白質(zhì)移位通過納米孔的裝置，其包含：其中具有納米孔的 膜，所述膜將室分成順側(cè)（Cis side)和反側(cè)（trans side)，其中要將所述蛋白質(zhì)添加到所 述順側(cè)，并移位通過所述納米孔到所述反側(cè)；和在所述室的至少一側(cè)的蛋白質(zhì)移位酶，其結(jié) 合所述蛋白質(zhì)并將所述蛋白質(zhì)移位通過所述納米孔。移位會以序貫次序發(fā)生，也就是說，以 通到納米孔中的氨基酸殘基的限定順序，這一般會遵循蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列。可以移 位多種蛋白質(zhì)，一次一種。
[0017] 本發(fā)明還提供了用于將蛋白質(zhì)移位通過納米孔的裝置，其包含：膜中的納米孔，所 述膜將流體室分成順側(cè)和反側(cè)，其中將要移位的蛋白質(zhì)添加到所述順側(cè)，并移位通過所述 納米孔到所述反側(cè)；電路，用于提供所述順側(cè)和所述反側(cè)之間的電壓梯度及測量流過所述 納米孔的離子電流（ionic current)電路；和特定的酶，諸如蛋白質(zhì)移位酶和/或NTP驅(qū)動 的解折疊酶，其對流體室添加，例如通過容許被附著于順側(cè)的所述納米孔，或者通過在溶液 中添加至反側(cè)進(jìn)行。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施方案中，納米孔以孔蛋白限定。在一個優(yōu)選的實施方案中，孔 蛋白是Ct -溶血素。
[0019] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，蛋白質(zhì)移位酶是NTP驅(qū)動的解折疊酶，其對要移 位的蛋白質(zhì)分子起作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，NTP驅(qū)動的解折疊酶是AAA+酶。在另 一個優(yōu)選的實施方案中，AAA+酶是大腸桿菌ClpX的亞基的組合。
[0020] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于檢測蛋白質(zhì)移位的電路包括對反側(cè)應(yīng)用正電 壓的膜片鉗放大器。膜片鉗放大器維持恒定電壓并測量電流變化。在一個優(yōu)選的實施方 案中，裝置包含與膜片鉗放大器附接的計算機(jī)，其用于快速記錄通過所述納米孔的離子電 流的變化。隨著蛋白質(zhì)通過納米孔，獲得離子電流標(biāo)記，其可以檢測每秒近似1至100, 〇〇〇 次波動，提供關(guān)于移位通過孔的個別氨基酸的信息。例如，在IOOkHz記錄可以用于產(chǎn)生每 10 μ S -個數(shù)據(jù)點?？梢詫?shù)據(jù)與移位的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征相關(guān)聯(lián)。
[0021] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種用于將蛋白質(zhì)移位通過納米孔的系 統(tǒng)，其包含將流體室分成順側(cè)和反側(cè)的膜中的納米孔，其中將要移位的蛋白質(zhì)添加到所述 順側(cè)，并移位通過所述納米孔到所述反側(cè)；所述流體室，其在所述順側(cè)包含含有酶輔因子諸 如NTP (核苷5' -三磷酸，例如ATP和/或GTP)的離子緩沖液和要移位的非變性蛋白質(zhì)；電 路，用于提供所述順側(cè)和所述反側(cè)之間的電壓及測量流過所述納米孔的離子電流；和在順 側(cè)在室中的溶液中的蛋白質(zhì)移位酶，諸如NTP驅(qū)動的解折疊酶。
[0022] 在本發(fā)明的一個備選實施方案中，納米孔以孔蛋白諸如多聚體孔蛋白限定，并且 將蛋白質(zhì)移位酶諸如NTP驅(qū)動的解折疊酶附著于多聚體孔蛋白。蛋白質(zhì)移位酶可以共價或 非共價附著于孔蛋白，并且可以在膜和孔蛋白的順側(cè)，反側(cè)或兩側(cè)。
[0023] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，要移位的蛋白質(zhì)是非變性蛋白質(zhì)（S卩，為其天然 狀態(tài)），并且進(jìn)一步包含外源序列，該外源序列包含蛋白質(zhì)的靶向域，該蛋白質(zhì)被靶向通過 納米孔，并接觸NTP驅(qū)動的解折疊酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，NTP驅(qū)動的解折疊酶是 ClpX，并且納米孔蛋白是α -溶血素。外源序列中的靶向域用來將蛋白質(zhì)引導(dǎo)至納米孔。靶 向域可以構(gòu)造為受到納米孔間的電壓影響。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶向域包含約5個 帶負(fù)電荷的氨基酸或至少約5-30個帶負(fù)電荷的氨基酸，并且由于順側(cè)和反側(cè)之間應(yīng)用的 電壓梯度而被吸引到室的陽側(cè)。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于將非變性蛋白質(zhì)移位通過納米孔的方法，其包括下列步驟： 提供用于將蛋白質(zhì)移位通過納米孔的裝置，所述裝置包含膜中的納米孔，所述膜將流體室 分成順側(cè)和反側(cè)，其中將要移位的蛋白質(zhì)添加到所述順側(cè)，并移位通過所述納米孔到所述 反側(cè)；電路，用于提供所述順側(cè)和所述反側(cè)之間的電壓及測量流過所述納米孔的離子電流 電路；和反側(cè)的在溶液中的蛋白質(zhì)移位酶；對所述流體室添加含有NTP的緩沖液（其中移 位酶是NTP驅(qū)動的）；任選地，將非變性的蛋白質(zhì)添加至順側(cè)；容許非變性蛋白質(zhì)被捕捉或 者穿過納米孔（例如根據(jù)電荷），使得它可以接觸蛋白質(zhì)移位酶；并測量由非變性蛋白質(zhì)移 位通過納米孔引起的離子電流變化。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施方案中，測量電流變化的步驟包括對（i)納米孔中的開放通 道，（ii)所述納米孔對非變性蛋白質(zhì)的捕獲，和（iii)來自（ii)的蛋白質(zhì)通過所述納米 孔的狀態(tài)測量電流變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述測量包括檢測狀態(tài)（i)，（ii)和 (iii)之間的差異。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述測量包括測量由通過所述納米孔的 所述蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)引起的狀態(tài)（iii)期間的差異。所述方法可以進(jìn)一步包括如下步 驟：測量所述NTP驅(qū)動的解折疊酶結(jié)合所述非變性蛋白質(zhì)并所述解折疊酶向所述納米孔移 位的狀態(tài)，其作為狀態(tài)（ii)和（iii)之間的狀態(tài)發(fā)生。這會導(dǎo)致測量4種狀態(tài)。如例如圖 2中描述并顯示的，可以有在移位完成并且納米孔返回到初始狀態(tài)時測量的最終狀態(tài)（V)。
[0026] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，納米孔以孔蛋白限定。在另一個優(yōu)選的實施方案中， 孔蛋白是α-溶血素。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將NTP驅(qū)動的解折疊酶附著于孔蛋白。 在另一個優(yōu)選的實施方案中，NTP驅(qū)動的解折疊酶是AAA+酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中， AAA+酶是ClpX。在另一個實施方案中，電路包含在順式室和反式室之間應(yīng)用恒定電壓的膜 片鉗放大器。
[0027] 在本發(fā)明的某些方面，納米孔以α-溶血素或另一種多聚體孔蛋白限定?？椎鞍?不需要被功能化；也就是說，它可以在其天然環(huán)境中用作蛋白質(zhì)出口；它不需要具有對其 添加以附著或結(jié)合移位的蛋白質(zhì)的任何分子結(jié)構(gòu)。也就是說，它對于任何蛋白質(zhì)序列的移 位可以是通用的，并且不特異性結(jié)合或識別要移位的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，要移位的蛋白質(zhì)也處 于天然形式。在本發(fā)明的某些實施方案中，它可以具有對其附著的分子結(jié)構(gòu)以改善蛋白質(zhì) "穿過"納米孔。在本發(fā)明的某些方面，要移位的蛋白質(zhì)包含外源序列，該外源序列包含蛋白 質(zhì)移位酶的靶向域。靶向域可以包含至少約5-30個氨基酸，或10-30個氨基酸。氨基酸可 以是位于要移位的蛋白質(zhì)的氨基或羧基端的帶負(fù)電荷的氨基酸，例如30-100個谷氨酰胺 或天冬酰胺殘基，或其他帶負(fù)電荷的合成單體，例如硫酸右旋糖苷（dextran sulfate)。氨 基酸也可以是帶正電荷的，例如精氨酸或賴氨酸，若電壓極性從下文例示的電壓極性反轉(zhuǎn)。
[0028] 在本發(fā)明的某些方面，要移位的蛋白質(zhì)以其天然狀態(tài)移位，也就是說，不被變性或 以其他方式解折疊；移位酶用于解折疊蛋白質(zhì)，在其橫穿納米孔間的電壓梯度時。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖IA是具有脂質(zhì)雙層中包埋的單一 AHL(a -溶血素）孔的納米孔感應(yīng)器的簡圖 (草圖）。
[0031] 圖IB是顯示納米孔中捕獲的蛋白質(zhì)的簡圖。
[0032] 圖IC是顯示用于移位的本實施例中使用的工程化蛋白質(zhì)的簡圖。
[0033] 圖2A，2B是顯示ClpX介導(dǎo)的蛋白質(zhì)移位期間離子電流跡線的圖形表示和圖。
[0034] 圖2C是跡線，其顯示蛋白質(zhì)S2-35移位期間離子電流跡線。
[0035] 圖2D是跡線，其顯示蛋白質(zhì)S2-148移位期間離子電流跡線。
[0036] 圖3A，3B和3C是一系列柱形圖，其顯示了三種模型蛋白質(zhì)的離子電流狀態(tài)停留時 間（停留時間）的比較。
[0037] 圖4A-D是圖形表示和電流跡線，其顯示在反式溶液（trans solution)中在不存 在ClpX的情況下在電壓介導(dǎo)的蛋白質(zhì)移位期間的離子電流跡線。在高度可變的捕捉持續(xù) 時間（<5 sec->2min)后，測試的所有物質(zhì)最終會由于應(yīng)用的電壓而解折疊并移位。沒有觀 察到陡變（ramping)狀態(tài)，詳細(xì)的信號特征從S2-35和S2-148接頭狀態(tài)喪失，并且所有狀 態(tài)與ClpX介導(dǎo)的事件相比都具有更廣泛分布的持續(xù)時間。圖4A顯示了電壓介導(dǎo)的Sl移 位期間的離子電流跡線。與圖2A相比，狀態(tài)i i i是缺乏的，并且狀態(tài)iv具有更長且更可變 的平均持續(xù)時間。圖4B顯示電壓介導(dǎo)的蛋白質(zhì)移位的模型。圖4B顯示了 4種草圖結(jié)構(gòu)。 i.至Ijiv.草圖i-iv對應(yīng)于圖4A中的離子電流狀態(tài)i-iv。圖4C顯示了電壓介導(dǎo)的S2-35 移位期間的離子電流跡線。狀態(tài)iii和vi的陡變是缺乏的，并且狀態(tài)V的分辨率（圖2C) 是減少的。圖4D顯示了電壓介導(dǎo)的S2-148期間的離子電流跡線與S2-35展現(xiàn)出相似的性 能，其中省略相應(yīng)的狀態(tài)（圖2D)。
[0038] 圖5是頻率柱形圖，其證明了三種模型蛋白質(zhì)的ClpX依賴性（其中ClpX存在于 反側(cè)）陡變狀態(tài)iii的離子電流狀態(tài)停留時間的比較。Sln = 45, S2-35n = 62, S2-148n = 66〇
[0039] 圖6是頻率柱形圖，其顯示了包括ClpX依賴性陡變狀態(tài)iii和vi的事件中 S2-35(n = 42)和S2-148(n = 41)蛋白的推定第二Smt3域移位狀態(tài)vii的離子電流狀態(tài) 停留時間的比較。
[0040] 圖7是頻率柱形圖，其顯示了 了蛋白S2-35 (η = 44)和S2-148 (η = 44)的ClpX-依 賴性陡變狀態(tài)vi的離子電流停留時間的比較。
[0041] 圖8是頻率柱形圖，其顯示了三種模型蛋白的推定Smt3域移位狀態(tài)iv和vii的 離子電流停留時間的比較。黑色柱形代表包括陡變狀態(tài)iii (ClpX驅(qū)動）的事件的停留時 間?；疑未聿话ǘ缸儬顟B(tài)（非ClpX驅(qū)動）的事件。在陡變的情況中η = 254,在 無陡變的情況中η = 183。
[0042] 圖9是頻率柱形圖，其顯不了 S2_35移位事件的狀態(tài)V停留時間。黑色柱形代表包 括陡變狀態(tài)iii (ClpX驅(qū)動）的事件的停留時間?；疑未聿话ǘ缸儬顟B(tài)（非ClpX 驅(qū)動）的事件。在陡變的情況中η = 50,不無陡變的情況中η = 45。
[0043] 圖10是圖形表示，其顯示了脂膜內(nèi)包埋的ClpP/a-HL融合蛋白。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 概述
[0046] 本文中描述了用于將單獨的蛋白質(zhì)移位通過納米孔，從而使得能夠通過反映蛋白 質(zhì)通過納米孔的電子信號獲得關(guān)于蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)的氨基酸內(nèi)容物的信息的系統(tǒng)。通 過提供在膜中的納米孔，膜的順側(cè)和反側(cè)之間的電壓，和蛋白質(zhì)移位酶，本裝置使用蛋白質(zhì) 移位酶以如下的方式實現(xiàn)天然蛋白質(zhì)的酶控制的解折疊和移位通過納米孔感應(yīng)器，使得 順側(cè)和反側(cè)之間的電路可以監(jiān)測并記錄指示蛋白質(zhì)的氨基酸內(nèi)容物，例如氨基酸序列的信 號。對于實踐目的，可以提供納米孔和電路的陣列。這些可以在單一室中或在多個室中。
[0047] 現(xiàn)在參考圖1Α，本裝置運(yùn)轉(zhuǎn)為移位底物蛋白101，并且包含在脂質(zhì)雙層104中包埋 的孔蛋白102 ( α -溶血素，或"AHL"），該脂質(zhì)雙層104被包含在膜106中約25 μ m孔徑中， 所述膜106將流體區(qū)室分成含有蛋白質(zhì)101的順側(cè)和蛋白質(zhì)101將要被移位通過孔102前 往的反側(cè)。該裝置包括可控放大器108,用于在反側(cè)的正電極110和順側(cè)的負(fù)電極之間應(yīng)用 恒定電壓。蛋白質(zhì)移位酶1〇9(下文例示為ClpX)存在于室的反側(cè)。放大器108還提供電 路，其用于檢測且優(yōu)選記錄在蛋白質(zhì)101移位時非常快速發(fā)生的離子電流（即離子諸如描 繪的Cl-和K+流動）變化。在例子中，在IOOkHz收集數(shù)據(jù)，但是高速數(shù)據(jù)取樣裝置是已知 的并且可以使用（例如來自Pentek，Inc的200MHz 7150型）。圖IB顯示了脂質(zhì)雙層104中 AHL孔蛋白102的詳細(xì)視圖，而且還顯示了蛋白質(zhì)移位酶109,其在反側(cè)，并且其作用于蛋白 質(zhì)101，該蛋白質(zhì)101在草圖中被穿過，并且在孔102的兩側(cè)。如圖IC中顯示，在其氨基端 攜帶Smt3域的模型底物蛋白質(zhì)在其羧基端通過帶電荷的柔性接頭與ssrA標(biāo)簽偶聯(lián)。將帶 電荷的柔性標(biāo)簽穿過納米孔進(jìn)入反側(cè)溶液中，而在這點時，折疊的Smt3域阻止捕獲的蛋白 質(zhì)的完全移位。存在于反側(cè)溶液中的ClpX結(jié)合底物蛋白質(zhì)的C端ssrA序列。通過ATP水 解推動，ClpX沿著蛋白質(zhì)尾部向通道移位，隨后催化Smt3域的解折疊和移位通過孔。Smt3 域是折疊的，而接頭不是。Smt3進(jìn)一步記載于US 2009/0280535，"SUMO Fusion Protein Expression System for Producing Native Proteins"。下文實施例中證明了蛋白質(zhì)解折 疊和移位通過α -溶血素納米孔的酶促控制。每個底物蛋白質(zhì)的區(qū)段在它們通過長約50埃 的反式膜孔腔