廣州管圓線蟲的實時熒光pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物檢測技術領域，具體涉及一種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR 檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis)原僅在亞洲和泛太平洋地區(qū)流 行，2003年以來在非洲和南美州國家出現(xiàn)了多起爆發(fā)，同時不斷有散發(fā)病例發(fā)現(xiàn)和自然疫 源地報道，并通過貝類中間宿主和轉宿宿主感染人類；是一種新發(fā)傳染病原。
[0003] 其病原體一般多出于水產品，現(xiàn)有傳統(tǒng)的檢測方法主要通過形態(tài)學鑒定技術，操 作繁瑣，比較耗時，檢出率低。相比傳統(tǒng)檢測方法的缺點，生物分子檢測方法，多通過將待測 樣品進行前處理、核酸提取、凝膠電泳等步驟進行，但方法實施過程中凝膠電泳的操作，容 易出現(xiàn)假陽性結果，同時過程也比較繁瑣。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明實施例的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種針對廣州管圓線蟲 核糖體ITS-I基因，采用特異性引物和探針進行實時熒光PCR檢測的方法和檢測試劑盒。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術方案如下：
[0006] 一種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括PCR特異性引物和熒光探針； 其中，
[0007] 所述PCR特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物和具有序 列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物；
[0008] 所述熒光探針為具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且所述熒光探針5'端標記熒 光報告基團、3'端標記焚光淬滅基團。
[0009] 本發(fā)明還提出一種采用上述試劑盒進行廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測方法， 包括如下步驟：
[0010] 提取待測樣本DNA ;
[0011] 以提取的待測樣本DNA為模板進行實時熒光PCR ;PCR過程中采用上述試劑盒中的 PCR特異性引物和熒光探針進行；
[0012] 檢測PCR過程中的熒光信號。
[0013] 采用本發(fā)明的上述檢測方法，以廣州管圓線蟲核糖體ITS-I基因為研宄對象、設 計引物，對熒光PCR擴增條件進行優(yōu)化，最終實現(xiàn)快速檢測廣州管圓線蟲病病原；采用本發(fā) 明的方法相比現(xiàn)有的檢測方法，是實時反映靶基因擴增的過程，并根據內參或外參直接反 映出靶基因的拷貝數；相比現(xiàn)有的方法，具有靈敏度高、特異性強、周期短、高通量等優(yōu)點， 同時通過光學系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，既減少了假陽性的發(fā)生率 和對人、環(huán)境的潛在危害，同時縮短了檢測時間。
【附圖說明】
[0014] 下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0015] 圖1為本發(fā)明以廣州管圓線蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲、弓形體、日本血吸蟲、華支睪吸蟲、 異尖線蟲為標樣進行檢測過程中的熒光變化圖；
[0016] 圖2為采用本發(fā)明的以廣州管圓線蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲、弓形體、日本血吸蟲、華支 睪吸蟲、異尖線蟲標樣進行擴增產物的電泳結果圖；
[0017] 圖3為靈敏性實驗分析驗證本發(fā)明方法的靈敏性過程中的熒光變化圖；
[0018] 圖4為靈敏性實驗分析驗證本發(fā)明方法的靈敏性結果的線性曲線；
[0019] 圖5為靈敏性實驗分析驗證本發(fā)明方法的靈敏性結果的數據表。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明實施例提供一種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：
[0022] S10,獲取待測樣本，并提取待測樣本DNA ;
[0023] S20,以提取的待測樣本DNA為模板進行實時熒光PCR ;
[0024] S30,檢測PCR過程中的熒光信號。
[0025] 本發(fā)明上述過程通過對待測的DNA樣本進行擴增，并通過擴增過程中熒光探針產 生的熒光信號變化，從而便可以得知待測樣本是否含有目標病原體；其中，在步驟S20的實 時熒光PCR中采用的特異性引物和熒光探針如下：
[0026]
【主權項】
1. 一種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR特異性引物和 熒光探針；其中， 所述PCR特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物和具有序列表 SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物； 所述熒光探針為具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且所述熒光探針5'端標記熒光報 告基團、3'端標記熒光淬滅基團。
2. 如權利要求1所述的廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒 光報告基團為HEX。
3. 如權利要求1或2所述的廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包括有陽性對照；所述陽性對照為帶有廣州管圓線蟲核糖體ITS-I基因的重組 質粒。
4. 如權利要求1或2所述的廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包括有陰性對照；所述陰性對照為RNase free dH20。
5. -種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 提取待測樣本DNA ; 以提取的待測樣本DNA為模板進行實時熒光PCR ;其中所述實時熒光PCR過程中采用 的引物為具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序 列的下游引物；所述實時熒光PCR過程中采用的熒光探針為具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基 序列的熒光探針，且所述熒光探針5'端標記熒光報告基團、3'端標記熒光淬滅基團； 檢測PCR過程中的熒光信號。
6. 如權利要求5所述的廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光 報告基團為HEX。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種廣州管圓線蟲的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括PCR特異性引物和熒光探針；其中，PCR特異性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物；熒光探針為具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且熒光探針5’端標記熒光報告基團、3’端標記熒光淬滅基團。本發(fā)明的試劑盒中的引物和探針以廣州管圓線蟲核糖體ITS-1基因為對象進行設計，檢測中通過對熒光PCR擴增條件進行優(yōu)化，最終實現(xiàn)快速檢測廣州管圓線蟲病病原；特異性強、穩(wěn)定性好，操作簡單，大大減少了原有的工作量；具有靈敏度高、特異性強、周期短、高通量等優(yōu)點，同時通過光學系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，既減少了假陽性的發(fā)生率，同時縮短了檢測時間。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561266
【申請?zhí)枴緾N201410676273
【發(fā)明人】張仁利, 黃達娜, 陽帆, 吳春利, 李玥, 武偉華, 高世同, 李曉恒, 耿藝介
【申請人】深圳市疾病預防控制中心
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月21日