一種簡(jiǎn)便有效的懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 懸浮培養(yǎng)是游離的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)按照一定的細(xì)胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)的方法。為使細(xì)胞不斷增殖，培養(yǎng)一定時(shí)間必須進(jìn)行擴(kuò)培。擴(kuò)培的方法是取培養(yǎng)瓶 中一小部分懸浮細(xì)胞，按一定的稀釋比例轉(zhuǎn)移到成分相同的新鮮培養(yǎng)基中，需要較準(zhǔn)確的 控制懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基的量。整個(gè)懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作必須滿足無(wú)菌操作要求。在實(shí)驗(yàn)室搖 瓶研宄階段，細(xì)胞擴(kuò)培操作中懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基的無(wú)菌轉(zhuǎn)移一般采用移液器和已滅菌的量 筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）。當(dāng)移液體積較?。ㄈ?00mL以下）時(shí)，一般采用移液 器進(jìn)行液體無(wú)菌轉(zhuǎn)移。由于移液管的體積限制，當(dāng)移液體積較大時(shí)，用移液器操作會(huì)顯得特 別繁瑣，需要移液多次才能完成一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)培過(guò)程，操作效率低，在多次移液之后，容易忘 記移液次數(shù)，導(dǎo)致移液體積不準(zhǔn)。因此，當(dāng)移液體積較大（如200mL以上）時(shí)，一般用已滅 菌的量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）進(jìn)行液體無(wú)菌轉(zhuǎn)移。當(dāng)移液體積較大，用已滅 菌的量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）進(jìn)行液體無(wú)菌轉(zhuǎn)移時(shí)，需要提前對(duì)量筒（或其 他可滅菌的帶刻度的容器）進(jìn)行滅菌，增加實(shí)驗(yàn)量和實(shí)驗(yàn)成本。在操作過(guò)程中，需要在懸浮 細(xì)胞、培養(yǎng)液、無(wú)菌量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）和培養(yǎng)瓶之間進(jìn)行液體的反復(fù)轉(zhuǎn) 移，增加染菌風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)最基本也是最重要的要求，超凈工作臺(tái)或生物安全 柜雖可控制空氣潔凈度到百級(jí)，但并不是無(wú)菌環(huán)境。減少液體反復(fù)轉(zhuǎn)移的次數(shù)可顯著縮短 無(wú)菌液體與帶菌空氣的接觸時(shí)間，減少染菌幾率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題，提供一種簡(jiǎn)便、有效、安全的懸浮細(xì) 胞擴(kuò)培操作方法。
[0004] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0005] 一種簡(jiǎn)便有效的懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法，其步驟如下：
[0006] 1)復(fù)蘇一支293F細(xì)胞，加入到37°C水浴預(yù)熱的培養(yǎng)基中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0007] 2)進(jìn)行第一次擴(kuò)培：取20ml細(xì)胞懸浮液，向細(xì)胞懸浮液中倒入80g培養(yǎng)基，旋緊 培養(yǎng)瓶蓋，放入CO 2體積濃度為8%、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0008] 3)進(jìn)行第二次擴(kuò)培：將新的2L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的 培養(yǎng)基，再清零天平，繼續(xù)倒入IOOg懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋，細(xì)胞放入CO 2體積濃度為 8%、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0009] 4)進(jìn)行第三次擴(kuò)培：將新的3L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的 培養(yǎng)基，再清零天平，繼續(xù)倒入500g懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋混勻，再將一個(gè)新的3L培養(yǎng) 瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細(xì)胞倒入1250g到新的3L培養(yǎng)瓶，旋緊瓶蓋，兩瓶 細(xì)胞一起放入CO 2體積濃度為8%、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述步驟1)中，CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：co 2體積濃 度為8%、37°C、搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述步驟1)中，細(xì)胞培養(yǎng)3天。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為FreeStyle? 293 Expression Medium， Gibco 12338〇
[0013] 與現(xiàn)有的懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0014] (1)為控制實(shí)驗(yàn)成本，質(zhì)量稱(chēng)取設(shè)備的精度和最大量程都不必太高，精度在0. lg， 最大量程在3000g即可，這樣的設(shè)備市場(chǎng)售價(jià)在100元左右，能很好實(shí)現(xiàn)設(shè)備成本的控制；
[0015] (2)質(zhì)量稱(chēng)取設(shè)備放入超凈工作臺(tái)或生物安全柜里專(zhuān)用，能更好的避免污染風(fēng) 險(xiǎn)；
[0016] (3)不需要對(duì)量取器材進(jìn)行滅菌處理，當(dāng)天可完成細(xì)胞擴(kuò)培操作；傳統(tǒng)操作中需 要提前一天對(duì)器材進(jìn)行滅菌處理，烘干后第二天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；相比傳統(tǒng)操作方法，本發(fā)明 的方法使實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短一倍；
[0017] (4)傳統(tǒng)操作方法中在對(duì)量取器材進(jìn)行滅菌處理過(guò)程和烘干過(guò)程中，需要消耗電 力和人力資源，從長(zhǎng)遠(yuǎn)統(tǒng)計(jì)來(lái)看，本發(fā)明可以顯著減少能源消耗和提高生產(chǎn)率。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是懸浮細(xì)胞擴(kuò)培的活細(xì)胞密度。
[0019] 圖2是懸浮細(xì)胞擴(kuò)培的細(xì)胞活率。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0021] 37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium，Gibco 12338)，從 液氮中取出293F細(xì)胞（BIOWIT C0004)，手握解凍，與預(yù)熱的IOml培養(yǎng)基混勻，IOOOrpm離 心5分鐘，棄上清，IOml預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸，取樣計(jì)算活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，在無(wú)菌搖瓶 中將活細(xì)胞密度稀釋到5X10 5cellS/ml，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱條件設(shè)置為：8% CO2 (體積濃度）、37°C、搖床轉(zhuǎn)速140rpm。細(xì)胞培養(yǎng)3天后，取樣計(jì)算活細(xì)胞密度和細(xì)胞活 率。將細(xì)胞懸浮液用移液器精確分為兩份，每份20ml。其中一份為實(shí)驗(yàn)組，用天平稱(chēng)量的方 法進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)培；另一份為對(duì)照組，用體積量取的方法進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)培。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都為 3天擴(kuò)培一次，擴(kuò)增倍數(shù)都為5倍。每次擴(kuò)培前測(cè)定活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，擴(kuò)培3次后，量 筒量取培養(yǎng)體系的體積。
[0022] 實(shí)驗(yàn)組：第一次擴(kuò)培時(shí)，將原培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入80g的培養(yǎng) 基（與以上培養(yǎng)基相同），旋緊培養(yǎng)瓶蓋，細(xì)胞放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二次擴(kuò)培時(shí)，將新的2L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零， 倒入400g的培養(yǎng)基（與以上培養(yǎng)基相同），再清零天平，繼續(xù)倒入IOOg懸浮細(xì)胞液，旋緊培 養(yǎng)瓶蓋，細(xì)胞放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三 次擴(kuò)培時(shí)，將新的3L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的培養(yǎng)基（與以上培 養(yǎng)基相同），再清零天平，繼續(xù)倒入500g懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋混勻，再將一個(gè)新的3L 培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細(xì)胞倒入1250g到新的3L培養(yǎng)瓶，旋緊瓶蓋， 兩瓶細(xì)胞一起放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0023] 對(duì)照組采用常規(guī)體積量取法進(jìn)行擴(kuò)培。
[0024] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0025] 1.每次細(xì)胞擴(kuò)培時(shí)，取樣計(jì)算活細(xì)胞密度，數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)用天平稱(chēng)量進(jìn)行懸浮 細(xì)胞擴(kuò)培與用量筒量取進(jìn)行懸浮細(xì)胞擴(kuò)培對(duì)活細(xì)胞密度的影響一致，兩者沒(méi)有差異。
[0026] 2.每次細(xì)胞擴(kuò)培時(shí)，取樣計(jì)算細(xì)胞活率，數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2,發(fā)現(xiàn)用天平稱(chēng)量進(jìn)行懸浮細(xì) 胞擴(kuò)培與用量筒量取進(jìn)行懸浮細(xì)胞擴(kuò)培對(duì)細(xì)胞活率的影響一致，兩者沒(méi)有差異。
[0027] 3.培養(yǎng)結(jié)束后，用量筒對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行定量，最終體積相差很小，幾乎沒(méi)有區(qū)別， 數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種簡(jiǎn)便有效的懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法，其步驟如下： 1) 復(fù)蘇一支293F細(xì)胞，加入到37°C水浴預(yù)熱的40ml培養(yǎng)基中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 2) 進(jìn)行第一次擴(kuò)培：取20ml細(xì)胞懸浮液，向細(xì)胞懸浮液中倒入80g培養(yǎng)基，旋緊培養(yǎng) 瓶蓋，放入CO2體積濃度為8%、37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3) 進(jìn)行第二次擴(kuò)培：將新的2L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的培養(yǎng) 基，再清零天平，繼續(xù)倒入IOOg懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋，細(xì)胞放入CO 2體積濃度為8 %、 37°C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 4) 進(jìn)行第三次擴(kuò)培：將新的3L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的培養(yǎng) 基，再清零天平，繼續(xù)倒入500g懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋混勻，再將一個(gè)新的3L培養(yǎng)瓶旋 開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細(xì)胞倒入1250g到新的3L培養(yǎng)瓶，旋緊瓶蓋，兩瓶細(xì)胞 一起放入CO 2體積濃度為8 %、37 °C、轉(zhuǎn)速HOrpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為： CO2體積濃度為8%、37°C、搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，細(xì)胞培養(yǎng)3天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為Freestyle ? 293 ExpressionMedium,Gibco 12338。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種懸浮細(xì)胞擴(kuò)培操作方法，其步驟如下：1)復(fù)蘇一支293F細(xì)胞，加入到37℃水浴預(yù)熱的培養(yǎng)基中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2)進(jìn)行第一次擴(kuò)培：取20ml細(xì)胞懸浮液，向細(xì)胞懸浮液中倒入80g培養(yǎng)基，旋緊培養(yǎng)瓶蓋，放入CO2體積濃度為8％、37℃、轉(zhuǎn)速140rpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)進(jìn)行第二次擴(kuò)培：將新的2L培養(yǎng)瓶旋開(kāi)瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的培養(yǎng)基，再清零天平，繼續(xù)倒入100g懸浮細(xì)胞液，旋緊培養(yǎng)瓶蓋，細(xì)胞放入CO2體積濃度為8％、37℃、轉(zhuǎn)速140rpm的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4)進(jìn)行第三次擴(kuò)培。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便有效。
【IPC分類(lèi)】C12N5-071
【公開(kāi)號(hào)】CN104560863
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410836525
【發(fā)明人】賀煒華
【申請(qǐng)人】佛山安普澤生物醫(yī)藥有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月29日