一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌苗的獲得、組織破碎、細胞懸浮液的獲得、懸浮細胞的調(diào)控等步驟。本發(fā)明方法可以快速獲得大量的秋牡丹細胞，操作簡單，細胞增殖速度快，可以無限度的提供秋牡丹細胞，有助于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】 一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下秋牡丹懸浮細胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]秋牡丹,又名野棉花,毛茛科Anemones /apoflicae,原產(chǎn)于我國中部。喜溫暖濕潤和陽光充足環(huán)境，耐寒，怕高溫，夏李宜涼爽氣候，耐半陰，忌干旱，要求疏松肥沃的沙壤土。分布于日本以及中國安徽、江蘇、浙江、福建、江西、廣東、云南等地。喜溫暖濕潤和陽光充足環(huán)境，耐寒，怕高溫，夏季宜涼爽氣候，耐半陰，忌干旱，要求疏松肥沃的沙壤土。主治:蛔蟲病，蟯蟲病，體癬，肌癬，中暑發(fā)熱。栽培技術(shù):常用播種和根插繁殖，利用組培技術(shù)可以短期內(nèi)獲得大量的細胞，操作簡單，節(jié)約成本，不受季節(jié)的限制，但目前此方面尚無研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供秋牡丹細胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，可以快速獲得大量的秋牡丹細胞，操作簡單，細胞增殖速度快，可以無限度的提供秋牡丹細胞，有助于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l-2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5-7遍，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C，培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊，篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/l+4mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，溫度26°C，搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率I1r/min,振巾畐 2-4cm。
[0005]采用本發(fā)明制備的秋牡丹細胞，增殖率高，操作簡單，能耗小，次生代謝物含量高。
[0006]下面將結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1
取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l-2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5-7遍，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C，培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊，篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.1mg/L+KT0.2mg/l+3mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，溫度26°C，搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0008]實施例2
取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l-2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5-7遍，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C，培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊，篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/l+5mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，溫度26°C，搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0009]實施例3
取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l-2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5-7遍，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C，培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊，篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/l+3mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，溫度26°C，搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0010]實施例4
取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l-2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5-7遍，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C，培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊，篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/l+5mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，溫度26°C，搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
【權(quán)利要求】
1.一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌苗的獲得、組織破碎、細胞懸浮液的獲得、懸浮細胞的調(diào)控等，主要步驟如下: (1)取秋牡丹種子，按照常規(guī)的消毒方法對其進行消毒處理； (2)將步驟(I)消毒處理過的秋牡丹種子接種到培養(yǎng)皿中，放置光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)無菌苗； (3)取步驟(2)培養(yǎng)出來的無菌苗在玻璃勻漿器中研磨使其破碎，然后將破碎組織用孔徑100目的鋼網(wǎng)過濾，除去大的組織塊； (4)取步驟(3)篩選出來的破碎組織接入培養(yǎng)基配方為改良MS+NAA0.1-0.2mg/L+KT0.2-0.5mg/l+3-5mg/L硝普納培養(yǎng)基中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照 2000lx，溫度 26。。。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(O中所述秋牡丹無菌種子的獲得為:取秋牡丹的種子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污潰和被毛，流水沖洗l_2h，超凈工作臺上氯化汞處理20min，無菌水沖洗5_7遍。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(2)中所述秋牡丹無菌苗的獲得為，取消毒處理過的秋牡丹種子接種到已經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖中，傾倒滅菌處理過的MS培養(yǎng)液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，光強40001x，光期14h，暗期10h，濕度60%，溫度26°C。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中懸浮細胞的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中附加硝普納，可以促進懸浮細胞的生長和次生代謝物質(zhì)的積累。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種秋牡丹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中秋牡丹懸浮細胞培養(yǎng)采用搖床震蕩，攪拌通氣式培養(yǎng)，每10ml三角瓶接種30mL液體，速率 110r/min，振幅 2_4cm。
【文檔編號】C12N5/04GK104263694SQ201410463235
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司