專(zhuān)利名稱(chēng):產(chǎn)生嘌呤核糖核苷和核糖核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，且具體涉及產(chǎn)生嘌呤核糖核苷的方法，其作為嘌呤核苷酸合成中的原材料是重要的。所述方法使用經(jīng)修飾而弱化編碼3-己酮糖-6-磷酸的基因的表達(dá)的芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。
背景技術(shù)：
已知使用腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵產(chǎn)生嘌呤核苷的方法。而且，這些菌株可被進(jìn)一步賦予針對(duì)多種藥物如嘌呤類(lèi)似物和磺胺胍(sulfaguanidine)的抗性。這些菌株的實(shí)例包括多種芽孢桿菌屬菌株(日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)38-23039 (1963)、54-17033 (1979)、 55-2956(1980)和55-45199(1980)，日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)56-162998(1981)、日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)57-14160(1982)和57-41915 (1982)，以及日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)59-42895 (1984))，短桿菌屬(Brevibacterium)菌株(日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào) 51-5075 (1976)和 58-17592 (1972)，以及 Agric. Biol. Chem.，42，399 (1978))，埃希氏菌屬(Escherichia)菌株(W09903988)等。
獲得上述突變體菌株常規(guī)地是通過(guò)對(duì)微生物通過(guò)UV輻射或通過(guò)用亞硝基胍 (N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)處理進(jìn)行誘變，并通過(guò)使用合適的選擇培養(yǎng)基來(lái)選擇具有所需特征的菌株而實(shí)現(xiàn)的。或者，突變體菌株已通過(guò)使用遺傳工程技術(shù)進(jìn)行培育而獲得， 例如對(duì)于芽孢桿菌屬的菌株(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)58-158197 (1983)、58-175493 (1983)、 59-28470(1984)、60_156388(1985)、1-27477(1989)、1-174385 (1989)、3-58787 (1991)、 3-164185 (1991) ,5-84067 (1993)和 5-192164(1993)號(hào)，美國(guó)專(zhuān)利 7，3 , 546 Q008))和短桿菌屬的菌株(日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)63-248394(1988))。這些產(chǎn)生肌苷的菌株的生產(chǎn)力(productivity)可進(jìn)一步通過(guò)增加它們分泌肌苷酸的能力來(lái)改進(jìn)(俄羅斯專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2002101666,2002104463 和 2002104464)。
核酮糖單磷酸(RuMP)途徑是用于從一碳單位合成含碳碳鍵化合物的代謝途徑之一，并存在于許多利用甲醇和甲醛，稱(chēng)作甲基營(yíng)養(yǎng)菌(methylotroph)的細(xì)菌中。該途徑的特征性酶是3-己酮糖-6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphatesynthase，HPS)和 6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶(6-phospho-3-hexuloisomerase，PIH)，人們認(rèn)為兩者皆不存在于非甲基營(yíng)養(yǎng)菌之外。然而，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的假定的yckG基因產(chǎn)物(YckG)具有類(lèi)似于甲基營(yíng)養(yǎng)菌HPS相應(yīng)基因產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)。也研究了 yckF基因產(chǎn)物(YckF)與甲基營(yíng)養(yǎng)菌PHI之間的序列相似性，并發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的yckG和yckF基因分別表達(dá)具有HPS和PHI酶活性的蛋白質(zhì)。在枯草芽孢桿菌中，用甲醛可相伴地誘導(dǎo)這兩種活性，顯示對(duì)yckH基因的依賴(lài)性，但用甲醇、甲酸或甲胺并無(wú)法對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)。破壞兩個(gè)基因任一導(dǎo)致對(duì)甲醛的中等敏感性，表明這些酶可在枯草芽孢桿菌中作為對(duì)甲醛的解毒系統(tǒng)起作用。在非甲基營(yíng)養(yǎng)菌枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了活性的yckG(對(duì)于HPS)-yckF(對(duì)于 PHI)基因結(jié)構(gòu)，其固有地保存了 RuMP 途徑(Yasueda, H.等，J. Bacteriology, 181 (23)， p.7154-7160(1999))。
然而，先前并未報(bào)道為了改善嘌呤核糖核苷生產(chǎn)力的目的使編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因失活。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是改善適于通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生嘌呤核苷的微生物，并提供使用所述微生物的菌株產(chǎn)生嘌呤核苷的方法。
該目標(biāo)是通過(guò)發(fā)現(xiàn)弱化編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因的表達(dá)可增強(qiáng)嘌呤核苷如肌苷、黃苷、鳥(niǎo)苷或腺苷的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供了具有增加的產(chǎn)生嘌呤核苷的能力的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，特別是，提供了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供能夠產(chǎn)生嘌呤核苷的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而減少了 3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)活性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供能夠產(chǎn)生嘌呤核苷的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而弱化了編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶的表達(dá)是通過(guò)使所述基因失活來(lái)弱化的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因是hxlA基因。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是解淀粉芽孢桿菌。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述嘌呤核苷選自下組肌苷、 黃苷、鳥(niǎo)苷和腺苷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生嘌呤核苷的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌，使所述嘌呤核苷分泌至所述培養(yǎng)基中，并從培養(yǎng)基收集所述嘌呤核苷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的方法，其中所述嘌呤核苷選自下組肌苷、 黃苷、鳥(niǎo)苷和腺苷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌，使所述嘌呤核苷能夠分泌至所述培養(yǎng)基中，將所述嘌呤核苷磷酸化，并分離嘌呤核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供如上所述的方法，其中所述嘌呤核苷酸選自下組 5’ -肌苷酸、黃苷-5’ -磷酸、5’ -鳥(niǎo)苷酸和5’ -腺苷酸。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示pKSl質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的限制位點(diǎn)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
下面詳細(xì)描述本發(fā)明。
1.本發(fā)明的細(xì)菌
所述細(xì)菌能夠產(chǎn)生嘌呤核苷，并經(jīng)修飾而減少3-己酮糖-6-磷酸合酶活性。所述細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬。
芽孢桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. subtilis)菌株 168 (B. subtilis 168)或解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢桿菌是異源物種。已知多種解淀粉芽孢桿菌菌株，包括SB、Τ、P、W、F、N、K和H(ffelker N. Ε. , Campbell L.L., Unrelatedness of Bacillusamyloliquefaciens and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. ,94 :1124-1130,1967)。近來(lái)，從植物分離了芽孢桿菌屬菌株，其視為解淀粉芽孢桿菌的不同生態(tài)型(Reva等，Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria relatedto Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Ecol.，48 :249-259, 2004)。已確定了所述菌株之一，解淀粉芽孢桿菌FZB42的完整核苷酸序列(Chen等，Comparative analysis of the complete genome sequence ofthe plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol. ,25 :1007—1014，2007)。
屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌的實(shí)例還包括下述地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)、巨大芽孢桿菌 (Bacillusmegaterium)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymixa),禾口嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。
除了已經(jīng)提及的性質(zhì)之外，所述細(xì)菌還可具有多種營(yíng)養(yǎng)需求、藥物抗性、藥物敏感性和藥物依賴(lài)性。
短語(yǔ)“嘌呤核苷”包括肌苷、黃苷、鳥(niǎo)苷和腺苷，優(yōu)選為肌苷。
短語(yǔ)“能夠產(chǎn)生嘌呤核苷”意指產(chǎn)生嘌呤核苷并導(dǎo)致其在培養(yǎng)基中積累的能力。短語(yǔ)“細(xì)菌具有產(chǎn)生嘌呤核苷的能力”意指所述屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌能夠以大于或芽孢桿菌屬細(xì)菌例如枯草芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌168)的野生型或未經(jīng)修飾的菌株的量產(chǎn)生嘌呤如嘌呤核苷，并導(dǎo)致其在培養(yǎng)基中積累。優(yōu)選地，該短語(yǔ)意指所述微生物能夠以不少于 10mg/l，更優(yōu)選不少于50mg/l的量產(chǎn)生嘌呤核苷(如肌苷、黃苷、鳥(niǎo)苷和腺苷)，并導(dǎo)致其在培養(yǎng)基中積累。
術(shù)語(yǔ)“HPC的活性”意指催化通過(guò)甲醛與核酮糖-5-磷酸的Mg2+-依賴(lài)性羥醛縮合而形成D-阿拉伯-3-己酮糖-6-磷酸的反應(yīng)的活性。所述HPS活性可如^sueda，H.等 (J. Bacteriology, 181 (23)，p. 7154-7160 (1999))中所述進(jìn)行測(cè)量。
已經(jīng)闡明了編碼來(lái)自枯草芽孢桿菌的HPS的基因，更具體地，來(lái)自枯草芽孢桿菌枯草亞種菌株168的hxlA基因(同物異名yckG)(與GenBank登錄號(hào)NC 000964的核苷酸374725至375357互補(bǔ)的核苷酸)。來(lái)自枯草芽孢桿菌的hxlA基因位于染色體上hxlB 和hxlR基因之間?？莶菅挎邨U菌hxlA基因的核苷酸序列和由hxlA基因編碼的氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
已經(jīng)闡明了編碼來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的HPS的基因，更具體地，來(lái)自解淀粉芽孢桿菌菌株的hxlA基因(與GenBank登錄號(hào)NC 009725的核苷酸；340797至；341432 互補(bǔ)的核苷酸)。來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的hxlA基因位于染色體上hxlB和hxlR基因之間。 解淀粉芽孢桿菌hxlA基因的核苷酸序列和由hxlA基因編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4。
通常，基因在引入細(xì)菌之前，可克隆入能夠在芽孢桿菌屬細(xì)菌中起作用的載體。為此目的，可使用穿梭載體如PHY300PLK、pMWMXU pLF22或pKSl。通過(guò)同源重組將野生型基因替換為突變體。
因?yàn)樵谘挎邨U菌屬菌株的DNA序列之間可能有一些差異，在染色體上待失活的hxlA基因并不限于示于SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的基因，而可包括與SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :3同源并編碼變體HPS蛋白質(zhì)的基因。如本發(fā)明中所用的短語(yǔ)“變體HPS蛋白質(zhì)”意指在序列上具有變化(所述變化無(wú)論為缺失、插入、添加或取代)但仍保持HPS蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。變體蛋白質(zhì)中的變化數(shù)取決于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的類(lèi)型。其可為在SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4中1至30，優(yōu)選1至15，且更優(yōu)選1至5 個(gè)。這些變化可發(fā)生于蛋白質(zhì)中對(duì)該蛋白質(zhì)功能并不重要的區(qū)域中。這是因?yàn)橐恍┌被岜舜司哂懈咄葱?，從而使三維結(jié)構(gòu)或活性不受上述變化的影響。因此，由hxlA基因編碼的蛋白質(zhì)變體可為與SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 4中所示的完整氨基酸序列相比具有不少于80 %，優(yōu)選不少于90 %，更優(yōu)選不少于95 %，還更優(yōu)選不少于98 %，且最優(yōu)選不少于99 % 的同源性的變體，只要其在失活所述hxlA基因之前保持HPS蛋白質(zhì)的活性。
兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性可使用眾所周知的方法來(lái)確定，例如，計(jì)算機(jī)程序 BLAST 2. 0，其計(jì)算三個(gè)參數(shù)得分、同一性和相似性。
而且，所述hxlA基因可為在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3中所示的核苷酸序列，或在嚴(yán)格條件下與可從該核苷酸序列制備的探針雜交的變體，只要其編碼在失活之前具有功能的HPS蛋白質(zhì)?！皣?yán)格條件”包括那些形成特異性雜合體例如具有不少于60 %，優(yōu)選不少于70 %，更優(yōu)選不少于80 %，更優(yōu)選不少于90 %，更優(yōu)選不少于95 %，還更優(yōu)選不少于98%，且最優(yōu)選不少于99%的特異性的雜合體，且不形成非特異性雜合體如具有低于上述同源性的雜合體的條件。例如，嚴(yán)格條件可例示為在60°C，在lxSSC，0. 1% SDS，優(yōu)選0. IxSSC, 0. SDS的鹽濃度洗滌一次或多次，優(yōu)選兩次或三次。洗滌的持續(xù)時(shí)間取決于用于印跡的膜的類(lèi)型，并一般而言，可為制造商推薦的持續(xù)時(shí)間。例如，在嚴(yán)格條件下，對(duì)于Hybond N+尼龍膜(Amersham)的推薦的洗滌持續(xù)時(shí)間是15分鐘。優(yōu)選地，洗滌可進(jìn)行2至3次。可根據(jù)雜交條件合適地選擇探針的長(zhǎng)度，通常為IOObp至ΙΙΛρ。
可通過(guò)將突變引入染色體上的hxlA基因來(lái)弱化其表達(dá)，從而使得由該基因編碼的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性與未經(jīng)修飾的菌株相比減少。上述突變可為一個(gè)或多個(gè)堿基的替代， 導(dǎo)致由該基因編碼的蛋白質(zhì)中的氨基酸取代(錯(cuò)義突變)，引入終止密碼子(無(wú)義突變)， 缺失一個(gè)或兩個(gè)堿基以導(dǎo)致移碼，插入藥物抗性基因，或缺失基因的部分或整個(gè)基因。還可通過(guò)修飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子，Shine-Dalgarno (SD)序列等來(lái)弱化hxlA基因的表達(dá)。
例如，可使用下述方法通過(guò)基因重組引入突變。制備含突變基因的DNA片段，并將其轉(zhuǎn)化入細(xì)菌。然后通過(guò)同源重組用所述突變基因替代細(xì)菌染色體上的天然基因，并選擇所得的菌株。所述使用同源重組的基因替代可通過(guò)采用線(xiàn)性DNA的方法來(lái)進(jìn)行，其稱(chēng)作 “Red—馬區(qū)云(Red-driven integration) "(Datsenko, K. Α.禾口 Warmer，B. L. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，97，12，p6640_6645 Q000))，或可通過(guò)采用含溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法來(lái)進(jìn)行(美國(guó)專(zhuān)利6，303，383或JP 05-007491A)。而且，如上所述的使用同源重組通過(guò)基因取代來(lái)并入位點(diǎn)-特異性突變還可通過(guò)用缺乏在宿主中復(fù)制能力的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。
還可通過(guò)將轉(zhuǎn)座子或IS因子插入基因的編碼區(qū)(美國(guó)專(zhuān)利5，175，107號(hào))，或通過(guò)常規(guī)方法如通過(guò)使用UV輻射的誘變或用亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)處理來(lái)弱化所述基因的表達(dá)。
還可通過(guò)常規(guī)方法如通過(guò)使用UV輻射的誘變或用亞硝基胍(N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍)處理、定位誘變、使用同源重組的基因破壞和/或插入_缺失誘變來(lái)進(jìn)行基因的失活。
可通過(guò)在固有地具有產(chǎn)生嘌呤核苷的能力的細(xì)菌中弱化編碼HPS的基因的表達(dá)來(lái)獲得所述細(xì)菌?；蛘?，可通過(guò)將產(chǎn)生嘌呤核苷的能力賦予其中HPS基因的表達(dá)弱化的細(xì)菌來(lái)獲得所述細(xì)菌。
可用于得到所述芽孢桿菌屬細(xì)菌的親本芽孢桿菌屬菌株的實(shí)例是產(chǎn)生肌苷的枯草芽孢桿菌菌株 KMBS375(KMBS375 :Ppur*_ Aatt ApurA ApurR ApupGAdeoD guaB24 ；參考實(shí)施例)。其它親本芽孢桿菌屬菌株包括枯草芽孢桿菌菌株AJ12707(FERM P-12951)(日本專(zhuān)利申請(qǐng)JP6113876A2)、枯草芽孢桿菌菌株AJ3772 (FERM P-2555) (日本專(zhuān)利申請(qǐng)JP62014794A2)、短小芽孢桿菌NA-1102 (FERMBP-289)、枯草芽孢桿菌 NA-6011 (FERMBP-291)、枯草芽孢桿菌 G1136A(ATCC No. 19222)(美國(guó)專(zhuān)利 3，575，809)(重新鑒定為解淀粉芽孢桿菌AJ1991，于2005年10月3日作為解淀粉芽孢桿菌Gl 136A保藏于 VKPM (VKPM B-8994)，并在2006年10月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏)、枯草芽孢桿菌NA-6012 (FERM BP-292)(美國(guó)專(zhuān)利 4，701，413)、短小芽孢桿菌 Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005)(美國(guó)專(zhuān)利3，616，206)、解淀粉芽孢桿菌菌株ASl 15-7 (VKPM B-6134)(俄羅斯專(zhuān)利號(hào)2003678) 等。還可使用枯草芽孢桿菌菌株KMBS16。該菌株是已知的枯草芽孢桿菌168trpC2菌株的衍生物，其中編碼嘌呤阻遏物的PurR基因(purR: spc)、編碼琥珀酰-AMP合酶的purA基因(purA: :erm)和編碼嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因(deoD: :kan)(俄羅斯專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2002103333，美國(guó)專(zhuān)利7，326，546，2008)均含有突變。
可通過(guò)增強(qiáng)一種或多種涉及嘌呤生物合成的基因，包括枯草芽孢桿菌的pur操縱子(Ebbole D. J.和Zalkin H. J. Biol. Chem.，262 :8274_87 (1987)，Bacillus subtilis and Its Closest Relatives,Editor in Chief :A. L. Sonenshein,ASMPress,Washington D. C., 2002)的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步改善所述細(xì)菌。已經(jīng)描述了具有經(jīng)修飾的pur操縱子調(diào)節(jié)區(qū)的產(chǎn)生肌苷的枯草芽孢桿菌菌株(美國(guó)專(zhuān)利7，326，546，2008)。
用于制備染色體DNA、雜交、PCR、制備質(zhì)粒DNA，消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化、選擇寡聚核苷酸作為引物等的方法可為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的普通方法。這些方法描述于Sambrook， J.,禾口 Russell D. , "Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 3 版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等。
2.產(chǎn)生核苷的方法
產(chǎn)生核苷如肌苷和/或鳥(niǎo)苷的方法，包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，以使所述核苷在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累，并從培養(yǎng)基收集所述核苷。
培養(yǎng)和從所述培養(yǎng)基收集和純化嘌呤核苷等可以以類(lèi)似于常規(guī)發(fā)酵的方式進(jìn)行， 其中使用微生物產(chǎn)生嘌呤核苷。用于嘌呤核苷產(chǎn)生的培養(yǎng)基可為含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和根據(jù)需要的其它有機(jī)組分的一般培養(yǎng)基。作為碳源，可使用糖類(lèi)如葡萄糖、乳糖、半乳糖、 果糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解物；醇類(lèi)如甘油、甘露醇和山梨醇； 有機(jī)酸如葡糖酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸等。作為氮源，可使用無(wú)機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有機(jī)氮如大豆水解物；氨氣；氨水等。合意的是維生素如維生素Bi，必需物質(zhì)， 例如有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物如核酸(如腺嘌呤和RNA)，或者酵母提取物等可以適量或甚至痕量存在。 除這些之外，如果需要，可添加少量磷酸鈣、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。[0049]培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行16至72小時(shí)，且將培養(yǎng)期間的培養(yǎng)溫度控制在30至 45°C，而pH控制在5至8?？墒褂脽o(wú)機(jī)或有機(jī)的酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣來(lái)調(diào)整pH。
在培養(yǎng)之后，可通過(guò)離心或膜過(guò)濾從液體培養(yǎng)基去除固形物如細(xì)胞，然后可從發(fā)酵液通過(guò)常規(guī)技術(shù)(如離子交換樹(shù)脂和沉淀)的任意組合回收目標(biāo)嘌呤核苷。
3.產(chǎn)牛嘌呤核苷酸的方法
產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，將所需的嘌呤核苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌入培養(yǎng)基，并收集嘌呤核苷酸。此外，產(chǎn)生5’ -肌苷酸的方法包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，將肌苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌入培養(yǎng)基，并收集 5’-肌苷酸。此外，產(chǎn)生5’-黃苷酸的方法包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，將黃苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌入培養(yǎng)基，并收集5’ -黃苷酸。此外，產(chǎn)生5’ -鳥(niǎo)苷酸的方法包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，將鳥(niǎo)苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌入培養(yǎng)基，并收集5’ -鳥(niǎo)苷酸。且產(chǎn)生5’ -鳥(niǎo)苷酸的方法包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，將黃苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌入培養(yǎng)基，將5’ -黃苷酸胺化，并收集5’ -鳥(niǎo)苷酸。
可從細(xì)菌將嘌呤核苷分泌至培養(yǎng)基的培養(yǎng)基收集待磷酸化的嘌呤核苷。然而含有嘌呤核苷的培養(yǎng)基可用于磷酸化反應(yīng)，而無(wú)需分離或純化嘌呤核苷。
培養(yǎng)和從所述培養(yǎng)基收集和純化肌苷等可以以類(lèi)似于常規(guī)發(fā)酵方法的方式進(jìn)行， 其中使用微生物產(chǎn)生肌苷。此外，將肌苷磷酸化，使其通過(guò)細(xì)菌分泌至培養(yǎng)基和收集5’-肌苷酸的步驟可以以類(lèi)似于常規(guī)發(fā)酵方法的方式進(jìn)行，其中從嘌呤核苷如肌苷產(chǎn)生嘌呤核苷酸如5’ -肌苷酸。
嘌呤核苷的磷酸化可使用不同的磷酸酶、核苷激酶或核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶以酶法進(jìn)行，或使用磷酸化劑如POCl3等以化學(xué)方法進(jìn)行?？墒褂媚軌虼呋瘜⒔沽姿岬牧柞；?C-5，位選擇性轉(zhuǎn)移至核苷的磷酸酶(Mihara等，Phosphorylation ofnucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganu. Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816(2000))或利用多聚磷酸(鹽)、苯基磷酸(鹽)或氨甲酰磷酸(鹽)作為磷酸供體的酸性磷酸酶(W09637603A1)等。同樣，可使用能夠利用對(duì)硝基苯基磷酸 (Mitsugi，K.等，Agric. Biol. Chem.，沘，586-600 (1964))、無(wú)機(jī)磷酸(日本專(zhuān)利申請(qǐng)或日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)JP42-1186)或乙酰基磷酸(日本專(zhuān)利申請(qǐng)或日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)JP61-41555)作為底物，催化將磷?；D(zhuǎn)移至核苷的C-2’、3’或5’位的磷酸酶。作為核苷激酶的實(shí)例，可使用來(lái)自大腸桿菌的鳥(niǎo)苷/肌苷激酶(Mori，H.等Cloning of a guanosine-inosine kinasegene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177 :4921-4926(1995) ；W09108286) 等。 可使用由 Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p. 203-258. In A Munch-Petesen(編)，Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York)描述的核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶等。核苷的化學(xué)磷酸化可使用磷酸化劑如 P0Cl3(Yoshikawa，K.等 Studies of phosphorylation. III.Selective phosphorylationof unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42 3505-3508(1969))等進(jìn)行。
5’黃苷酸的胺化可使用例如來(lái)自大腸桿菌的GMP合酶以酶法進(jìn)行(Fujio等.High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and itsapplication forthe industrial production of 5' -guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997,61 840-845 ；EP0251489B1)。
實(shí)施例
下面參照下述非限定性實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。
1.構(gòu)律H有經(jīng)失活的hxlA某因的菌株
為了將枯草芽孢桿菌肌苷產(chǎn)生者KMBS375的染色體上的hxlA基因失活(菌株KMBS375的構(gòu)建描述于參考實(shí)施例)，將hxlA基因的上游和下游區(qū)克隆入pKSl質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)(Shatalin K. Y.和 Neyfakh A. A. , FEMSMicrobiology Letters, 245 315-9(2005))(圖1)。所述hxlA基因上游區(qū)中的886bp片段的擴(kuò)增是使用引物Pl (SEQ ID NO 5)和P2(SEQ ID NO 6)和作為模板的枯草芽孢桿菌KMBS375的染色體DNA通過(guò)PCR來(lái)進(jìn)行的。引物Pl和P2分別含有內(nèi)切核酸酶McII和I^stI的識(shí)別位點(diǎn)。所述hxlA基因下游區(qū)中的923bp片段的擴(kuò)增是使用引物P3(SEQ ID NO 7)和P4(SEQ ID NO 和作為模板的枯草芽孢桿菌KMBS375的染色體DNA通過(guò)PCR來(lái)進(jìn)行的。引物P3和P4分別含有內(nèi)切核酸酶ClaI和KpnI的識(shí)別位點(diǎn)。將使用Pl和P2得到的純化PCR產(chǎn)物用內(nèi)切核酸酶 SacII和I^stI消化，然后克隆入pKSl質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)。將使用P3和P4得到的純化PCR產(chǎn)物用內(nèi)切核酸酶ClaI和KpnI消化，然后也克隆入pKSl質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)。在克隆了兩個(gè)片段后，將含有KmK盒和hxlA基因上游和下游區(qū)的質(zhì)粒用內(nèi)切核酸酶SacII和KpnI消化，并將所得的片段(3194bp)亞克隆入來(lái)自芽孢桿菌屬的非復(fù)制性的pBluescript II KS載體 (Stratagene)。將所得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌KMBS375，并分離了 12個(gè)化體。 為了確證KmK盒的整合將hxlA基因失活，進(jìn)行了使用引物Pl和P4的對(duì)照PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)使用引物Pl和P4及hxlA基因的野生型等位基因的PCR獲得的DNA片段的大小為M76bp ； 然而3194bp的DNA片段的存在確證了 10^盒整合入hxlA基因。在使用引物P5(SEQ ID NO: 9-引物P5含有20-nt，與位于距hxlA基因翻譯起始位置-IOUbp的位置的區(qū)域互補(bǔ)，在與 Pl引物互補(bǔ)的區(qū)域上游)和引物P6 (SEQ ID而10-引物？6含有21-壯，其與位于1(1^盒內(nèi)的區(qū)域互補(bǔ))的其它對(duì)照PCR實(shí)驗(yàn)中，PCR生成的1491bp的片段的存在確證了 KmK盒整合入KMBS375染色體上的hxlA基因中。含有整合的KmK盒的KMBS375轉(zhuǎn)化體之一用于進(jìn)一步工作。該菌株命名為KMBS375Ahxl: :Km。
實(shí)施例2.由枯草芽孢桿菌菌株KMBS375 A hxl :Km產(chǎn)生肌苷
為了測(cè)試hxlA對(duì)肌苷產(chǎn)生的失活作用，將枯草芽孢桿菌菌株KMBS375和 KMBS375Ahxl: :Km各在34°C在L-培養(yǎng)液中培養(yǎng)18小時(shí)，然后將0. 3ml培養(yǎng)物接種入 20x200mm試管中的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在34°C培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果示于表1。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/Ι)
葡萄糖30.0
NH4Cl32.0
權(quán)利要求
1.一種能夠產(chǎn)生嘌呤核苷的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而減少了 3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而弱化了編碼3-己酮糖-6-磷酸合酶 (HPS)的基因的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的細(xì)菌，其中所述表達(dá)是通過(guò)使所述基因失活來(lái)弱化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3的細(xì)菌，其中所述基因是hxlA基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是枯草芽孢桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是解淀粉芽孢桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1至6中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述嘌呤核苷選自下組肌苷、黃苷、鳥(niǎo)苷和腺苷。
8.—種產(chǎn)生嘌呤核苷的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
1至7中任一項(xiàng)的細(xì)菌，使所述嘌呤核苷分泌至所述培養(yǎng)基中，并從所述培養(yǎng)基收集所述嘌呤核苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的產(chǎn)生嘌呤核苷的方法，其中所述嘌呤核苷選自下組肌苷、黃苷、 鳥(niǎo)苷和腺苷。
10.一種產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
1至7中任一項(xiàng)的細(xì)菌，使所述嘌呤核苷分泌至所述培養(yǎng)基中，將所述嘌呤核苷磷酸化，并分離嘌呤核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10的產(chǎn)生嘌呤核苷酸的方法，其中所述嘌呤核苷酸選自下組5’_肌苷酸、黃苷_5’ -磷酸、5’ -鳥(niǎo)苷酸和5’ -腺苷酸。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，并具體涉及產(chǎn)生嘌呤核糖核苷的方法，其作為供合成嘌呤核苷酸的原材料是重要的。所述方法使用經(jīng)修飾而減少3-己酮糖-6-磷酸合酶活性的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12P19/34GKCN102171346SQ200980138368
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年9月30日
發(fā)明者德米特里.V.羅馬南科夫, 淺原貴之, 瑟吉.V.格朗斯基, 納塔利婭.P.扎卡泰瓦 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan