專利名稱:家族44木葡聚糖酶變體的制作方法
家族44木葡聚糖酶變體
涉及序列表
本申請含有計算機可讀形式的序列表，所述計算機可讀形式通過提述并入本文。 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及屬于家族44糖苷水解酶的木葡聚糖酶變體，編碼所述變體的多核苷 酸和產生所述變體的方法。
發(fā)明背景
木葡聚糖是在植物的初級(生長的)細胞壁中主要的結構多糖。在結構上，木 葡聚糖由纖維素-樣β-1，4-鍵的葡萄糖骨架組成，所述葡萄糖骨架經常以多種側鏈取 代。據信木葡聚糖在植物初級細胞壁中通過交聯纖維素微纖維形成纖維素-木葡聚糖網絡 (network)而起作用。
木葡聚糖酶能夠催化木葡聚糖溶解(solubilization)為木葡聚糖寡糖 (xyloglucan oligosaccharide)。一些木葡聚糖酶僅顯示木葡聚糖酶活性，而其他顯示木 葡聚糖酶活性和纖維素酶活性。木葡聚糖酶可歸類為EC 3.2. 1.4或EC3.2. 1. 151。具有木 葡聚糖酶活性的酶，例如，在 Vincken 等(1997) CarbohydrateResearch 298 (4) :299-310 中 描述，其中表征了來自綠色木霉(Trichoderma viride)(類似于里氏木霉T. reesei)的三 種不同的內切葡聚糖酶EndoI、EndoV和EndoVI。EndoI、EndoV和EndoVI分別屬于糖苷水 解酶的家族 5、7 和 12，參見 Henrissat，B. (1991) Biochem. J. 280 :309-316 以及 Henrissat， B.和 Bairoch，Α. (1993)Biochem. J. 293 :781_788。WO 94/14953 公開了從真菌棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)克隆的家族12木葡聚糖酶(EG II)。WO 99/02663公開了分別 iAi&^^ifeff lif (Bacillus lichenioformis)禾口 Bacillus agaradhaerens 3 ! 12 和家族5木葡聚糖酶。WO 01/06四03公開了家族44木葡聚糖酶。
具體而言，WO 99/02663和WO 01/062903表明木葡聚糖酶可用于洗滌劑。
本發(fā)明的一個目的是提供屬于糖苷水解酶的家族44的木葡聚糖酶變體，與其親 本酶相比具有改善的特性。
發(fā)明內容
本發(fā)明涉及親本木葡聚糖酶分離的變體，在選自下組的位置編號的一個或多個 (幾個)位置處包含改變68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、 9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、 104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、 217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、 166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、 353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、 415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347 和507，所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO :3中的位置，且其中所述改變獨立地為[0010]i)在占據所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，
ii)缺失占據所述位置的氨基酸，或
iii)用不同的氨基酸取代占據所述位置的氨基酸；和
所述親本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；且所述變體具有木葡聚糖酶活性。
本發(fā)明還涉及編碼所述變體木葡聚糖酶的分離的多核苷酸或具有木葡聚糖酶活 性的多肽，包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生親本木葡聚糖酶變 體或具有木葡聚糖酶活性的多肽的方法。
發(fā)明的詳細說明
本發(fā)明涉及親本家族44木葡聚糖酶的變體，其包含改變，優(yōu)選為在一個或多個 (幾個)位置取代和/或插入和/或缺失的形式，其中所述位置的編號對應于SEQ ID NO 3中位置的編號。本發(fā)明的變體具有木葡聚糖酶活性并潛在地還具有纖維素分解活性。本 發(fā)明的變體與親本木葡聚糖酶相比具有改進的性質。在一個方面，所述變體在液體洗滌劑 中，特別是在液體洗衣洗滌劑(laundry detergent)組合物中具有改善的穩(wěn)定性。
定義
木葡聚糖酶活性
本文中術語“木葡聚糖酶活性”定義為催化木葡聚糖水解的酶。所述反應涉及木 葡聚糖酶中l(wèi)，4-i3-D-葡糖苷鍵的內水解。就本發(fā)明而言，木葡聚糖酶活性使用AZCL-木 葡聚糖(來自Megazyme)作為反應底物來確定。所述測定法可以以幾種方式進行，例如，如 本申請實施例2中描述的，或如W001/6^03中描述的。一個木葡聚糖酶活性單位(XyloU) 參照描述于W001/6^03第60頁第3-17行的測定方法來定義。
纖維素酶活性本文中術語“纖維素酶活性”定義為催化β-1，4_葡聚糖(纖維 素)中l(wèi)，4-i3-D-葡糖苷鍵的水解的酶。就本發(fā)明而言，纖維素酶活性使用AZCL-HE-纖維 素(來自Megazyme)作為反應底物來確定。
變體術語“變體”在本文中定義為具有木葡聚糖酶活性的多肽，其包含改變，如 在一個或多個(幾個)特定位置的氨基酸殘基的取代、插入和/或缺失，所述位置對應于 在SEQ ID NO :3中的氨基酸位置。本發(fā)明的變體還可具有纖維素酶活性。改變的多肽(變 體)經人為干預(human intervention)通過修飾編碼親本酶的多核苷酸序列來獲得。所 述親本酶可由SEQ ID NO 1, SEQ IDNO :4或SEQ ID NO :6或下述序列編碼，所述序列與這 些序列之一具有至少65 %、更優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少75 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至 少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的同一性，且其編碼活性多肽。所述變體多 肽序列優(yōu)選為自然界未發(fā)現的。
野生型酶術語“野生型”木葡聚糖酶指由天然存在的微生物(如在自然界發(fā)現的 細菌、酵母或絲狀真菌)表達的木葡聚糖酶。術語野生型可與術語“天然存在的”互換使用。
親本酶本文中使用的術語“親本”木葡聚糖酶或“親本的”木葡聚糖酶意為下述 木葡聚糖酶，對其進行修飾(例如，取代、插入、缺失和/或截短)以產生本發(fā)明的酶變體。 該術語還指與變體相比較和比對的多肽。所述親本可為天然存在的(野生型)多肽，如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 5或SEQ ID NO 7的酶或與這些序列之一具有至少 65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選 至少90%、最優(yōu)選至少95%的同一性的多肽。所述親本多肽還可以是天然存在的多肽的變體，其氨基酸序列經修飾或改變。親本還可以是等位變體，其為由占據相同染色體基因座的 基因的兩種或更多種可選形式編碼的多肽。
分離的變體或多肽本文中使用的術語“分離的變體”或“分離的多肽”指從下述 來源分離的變體或多肽，所述來源例如表達所述變體或多肽的宿主細胞，或其中所述變體 或多肽通常存在的酶復合物。優(yōu)選地，所述多肽如通過SDS-PAGE所確定的為至少40%純、 更優(yōu)選至少60%純、甚至更優(yōu)選至少80%純、更優(yōu)選至少90%純，且甚至最優(yōu)選至少95%純。
基本上純的變體或多肽本文中術語“基本上純的變體”或“基本上純的多肽”指 多肽制備物，其按重量計，包含最多10 %、優(yōu)選最多8 %、更優(yōu)選最多6 %、更優(yōu)選最多5 %、 更優(yōu)選最多4%、更優(yōu)選最多3%、甚至更優(yōu)選最多2%、最優(yōu)選最多1%、且甚至最優(yōu)選最多 0. 5%的與其天然或重組結合的其他多肽物質。因此，優(yōu)選所述基本上純的變體或多肽按存 在于所述制備物中的總多肽物質的重量計，為至少92%純、優(yōu)選至少94%純、更優(yōu)選至少 95%純、更優(yōu)選至少96%純、更優(yōu)選至少96%純、更優(yōu)選至少97%純、更優(yōu)選至少98%純、 甚至更優(yōu)選至少99 %純、最優(yōu)選至少99. 5 %純，且甚至最優(yōu)選100 %純。本發(fā)明的變體和多 肽優(yōu)選為基本上純的形式。這可通過，例如，以公知的重組方法或經典的(classical)純化 方法制備變體或多肽來完成。
成熟多肽本文中術語“成熟多肽”定義為具有木葡聚糖酶活性的多肽，其為翻譯 和任何翻譯后修飾(如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式。對于由 SEQ ID NO :2定義的多肽，成熟木葡聚糖酶序列理論上可在SEQ ID而2的觀位起始。所 述成熟序列在SEQ ID NO :2的551位結束。理論的成熟木葡聚糖酶序列示于SEQ ID NO 3。取決于表達系統，實際的成熟多肽長度可基于理論的成熟多肽有1-10個氨基酸長度的 變動。成熟多肽可，例如，在SEQ ID NO 2的33位起始，并在SEQ ID NO 2的551位結束。
成熟多肽編碼序列本文中術語“成熟多肽編碼序列”定義為編碼具有木葡聚糖 酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID N0:1的 82-1653。所述成熟多肽編碼序列在長度上可有3-30個核苷酸的變動，取決于表達系統。成 熟多肽編碼序列可，例如，對應于SEQ ID NO 1的核苷酸97-1653。
同一性兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的相關性(relatedness)可以由 參數“同一性”來定義。
就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如在EMBOSS程序包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss. org)中的 Needle 程序(優(yōu)選 3. 0. 0 或其后 版本)所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)來確定。使用的任選參數為缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”的Needle輸出(使 用-nobrief選項獲得)用作所述百分比同一性，并如下計算
(相同的殘基XlOO)/(比對長度-比對中缺口的總數)
就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列間的同一性程度使用如在EMBOSS程 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice ^,2000,Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)中的 Needle 程序(優(yōu)選 3. 0. 0 或其后版本)所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 1Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)來確定。使用的任選參數為缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，以及 EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”的Needle輸出 (使用-nobrief選項獲得)用作所述百分比同一性，并如下計算
(相同的脫氧核糖核苷酸χ100)/(比對長度-比對中缺口總數)
功能性片段術語“功能性片段”用于描述來源于更長多肽(例如，成熟多肽)的 多肽，所述更長多肽在其N端區(qū)或C端區(qū)或在兩個區(qū)中經截短以生成所述親本多肽的片段。 為了成為功能性多肽，所述片段必需保持全長/成熟多肽的木葡聚糖酶活性的至少20%、 優(yōu)選至少40 %、更優(yōu)選至少50 %、更優(yōu)選至少60 %、更優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少80 %、更 優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%，且甚至更優(yōu)選至少100%。
等位變體本文中術語“等位變體”指占據相同染色體基因座的基因的兩種或更多 種可選形式中的任一種。等位變異通過突變天然地出現，且可導致種群中的多態(tài)性?；?突變可為沉默的(在編碼多肽中無變化)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的 等位變體是由基因等位變體編碼的多肽。
分離的多核苷酸本文中術語“分離的多核苷酸”指從來源分離的多核苷酸。在一 個方面，所述分離的多核苷酸如通過瓊脂糖電泳確定為至少40%純、更優(yōu)選至少60%純、 甚至更優(yōu)選至少80%純，且最優(yōu)選至少90%純，且甚至最優(yōu)選至少95%純。
基本上純的多核苷酸本文中使用的術語“基本上純的多核苷酸”指下述的多核苷 酸制備物，其不含其他外源的或不需要的核苷酸，并為適于在經遺傳工程改造的多肽產生 系統中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計，包含最多10%、優(yōu)選最多8%、更 優(yōu)選最多6%、更優(yōu)選最多5%、更優(yōu)選最多4%、更優(yōu)選最多3%、甚至更優(yōu)選最多2%、最優(yōu) 選最多1%、且甚至最優(yōu)選最多0. 5%的與其天然或重組結合的其他多核苷酸物質。然而， 基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’或3’未翻譯區(qū)，如啟動子或終止子。優(yōu)選所述 基本上純的多核苷酸按重量計為至少90%純、優(yōu)選至少92%純、更優(yōu)選至少94%純、更優(yōu) 選至少95 %純、更優(yōu)選至少96 %純、更優(yōu)選至少97 %純、甚至更優(yōu)選至少98 %純、最優(yōu)選至 少99%純、甚至最優(yōu)選至少99. 5%純。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述 多核苷酸制備物基本上不含與其自然或重組結合的其他多核苷酸物質。所述多核苷酸可為 基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源的，或其任意組合。
編碼序列當在本文中使用時術語“編碼序列”意為多核苷酸，其直接指明其多肽 產物的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框確定，其通常以ATG起始密碼子或 替代的起始密碼子(如GTG和TTG)開始，并以終止密碼子(如TAA、TAG和TGA)結束。所 述編碼序列可為DNA、cDNA、合成或重組的多核苷酸。
可操作地連接本文中術語“可操作地連接”指下述構型(configuration)，其中 調控序列相對于多核苷酸序列的編碼序列置于合適位置，從而使得所述調控序列指導多肽 編碼序列的表達。
宿主細胞本文中使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，其對用包含本發(fā)明 多核苷酸的核酸構建體或載體的轉化、轉染、轉導等是易感的。術語“宿主細胞”涵蓋任何 親本細胞的子代，其由于在復制中發(fā)生的突變而與親本細胞不同。
改善的化學穩(wěn)定性本文中術語“改善的化學穩(wěn)定性”定義為變體酶在減少親本酶的酶活性的化學品(天然存在的或合成的)的存在下溫育一段時間后，顯示酶活性的保留。 改善的化學穩(wěn)定性還可導致能夠在上述化學品存在下更佳地催化反應的變體。在本發(fā)明的 一個具體方面，所述改善的化學穩(wěn)定性是在洗滌劑，特別是液體洗滌劑中改善的穩(wěn)定性。特 別地，所述改善的洗滌劑穩(wěn)定性是，當本發(fā)明的木葡聚糖酶變體混合入液體洗滌劑配制物 中，并在15_50°C的溫度儲存時，木葡聚糖酶活性的改善的穩(wěn)定性。 在本發(fā)明中，液體洗滌劑作為液體洗衣洗滌劑是特別有用的。
變體命名規(guī)則
就本發(fā)明而言，公開于SEQ ID NO 3中的木葡聚糖酶的氨基酸序列用于確定在其 他木葡聚糖酶中對應的氨基酸殘基。將其他木葡聚糖酶的氨基酸序列與公開于SEQ ID NO 3中的木葡聚糖酶的氨基酸序列進行比對，并基于該比對，可以確定SEQ ID NO :3所公開的 木葡聚糖酶的氨基酸序列中任何氨基酸殘基對應的氨基酸位置編號。
多肽序列的比對可使用，例如，“ClustalW”(Thompson, J. D.，Higgins，D. G.和 Gibson, Τ· J. ,1994, CLUSTAL W :Improving the sensitivity of progressivemultipIe sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gappenalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22 :4673-4680) ii^f。 DNA·歹lj白勺 比對可以使用所述多肽比對作為模板，將氨基酸用來自所述DNA序列的對應密碼子替代來 進行。
在描述本發(fā)明的多種木葡聚糖酶變體時，為了參照方便起見，采用了下面所述的 命名法。在所有情況下，使用通用的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。
取代。對于氨基酸取代，使用下述命名法初始氨基酸/位置/取代氨基酸。相應 地，在2 位用丙氨酸取代蘇氨酸命名為“Thr226Ala”或“T226A”。多個突變用加號(“ + ”) 分開，例如，“G205R+S411F”，代表在205和411位分別用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用 苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)的突變。當初始氨基酸可由選自一組的氨基酸取代時，其命 名為，如“1(1四1 ，5^，1，？，0”，表示用選自下組的氨基酸取代1四位的賴氨酸(K)精氨酸 (R)、絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)和谷氨酰胺(Q)。或者，“K129R， S, A, I, F, Q” 可寫作 KU9R 或 KU9S 或 KU9A 或 K129I 或 K129F 或 K129Q。
缺失。對于氨基酸缺失,使用下述命名法起始氨基酸/位置/星號(*)。相應地， 在195位缺失甘氨酸命名為“Glyl95*”或“G195*”。多個缺失用加號(“ +，，)分開，例如， G195*+S411*0
插入。對于氨基酸插入，使用下沭侖名法星號(*)/位置/小寫字母/插入的氨 基酸，其中所述小寫字母表明在所述位置編號下游添加氨基酸。相應地，在10位下游添加 谷氨酸(E)命名為“*10aE”。如果第二個氨基酸，例如纈氨酸(V)，在所述谷氨酸(E)之后 插入到10位的下游，則其命名為“*10aE+*10bV”。添加至多肽的N端以0命名。將谷氨酸 (E)和纈氨酸(V)添加至多肽的N端氨基酸的添加命名為“*0aE+*0bV”?！跋掠巍辈迦脒€可描 述為在指明的位置和緊接著指明位置之后的位置之間添加一個或多個氨基酸，例如，在195 位下游插入導致在195位和196位之間添加一個或多個氨基酸，由此生成新的位置*195a， *195b 等。
親本木葡聚糖酶
在本發(fā)明中，所述親本木葡聚糖酶是(a)屬于家族44的糖苷水解酶(也稱為家族44木葡聚糖酶)的木葡聚糖酶；或(b)選自下組的多肽SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 7 ；或(c)包含與SEQ ID NO :3的成熟多肽具有75%同一性的氨基酸序列的多肽；或 (d)由在至少中等嚴格條件下與下述序列雜交的多核苷酸編碼的多肽(i) SEQ ID N0:1或 SEQ ID NO 4 或 SEQ IDNO 6 的成熟多肽編碼序列、(ii)包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 6的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列或(iii) (i)或(ii)的全長互補 鏈；或(e)由包含與SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性的核苷酸序列 的多核苷酸編碼的多肽。
在第一個方面，所述親本木葡聚糖酶包含下述氨基酸序列，其與SEQ IDNO 3的成 熟多肽具有至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少 90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、甚至更優(yōu)選至少97%、最優(yōu)選至少98%、甚至最 優(yōu)選至少99%的同一性程度，且其具有木葡聚糖酶活性(在下文中稱為“同源多肽”)。在 一個方面，所述同源多肽具有下述氨基酸序列，其與SEQ ID NO :3的成熟多肽相差十個氨基 酸、優(yōu)選九個、更優(yōu)選八個、更優(yōu)選七個、更優(yōu)選六個、更優(yōu)選五個氨基酸、更優(yōu)選四個氨基 酸、甚至更優(yōu)選三個氨基酸、最優(yōu)選兩個氨基酸、甚至最優(yōu)選一個氨基酸。
基本上同源的親本木葡聚糖酶可具有一個或多個(幾個)氨基酸改變，如取代、缺 失和/或插入。這些變化優(yōu)選為對性質較不重要的(of a minor nature)，其為保守氨基酸 取代，或其他并不顯著影響所述蛋白質或多肽三維折疊或活性的氨基酸取代；小缺失，通常 為1到約9個氨基酸，優(yōu)選1到約15個氨基酸，且最優(yōu)選1到約30個氨基酸；以及小的氨 基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸殘基，多至約五到十個殘基、優(yōu)選10到15個殘基且最 優(yōu)選20到25個殘基的小接頭肽，或促進純化的小延伸(親和標簽)，如多組氨酸標簽或蛋 白質 A (NiIsson 等，1985，EMBO J. 4 :1075 ；Nilsson 等，1991，MethodsEnzymol. 198 :3.還可 參見，一般地，Ford 等，1991，Protein Expression andPurification 2:95-107。
盡管上述變化優(yōu)選為性質較不重要的，上述變化也可為對性質重要的(ofa substantive nature)，如作為氨基端或羧基端的延伸的多至300個或更多個氨基酸的較大 多肽的融合體。
保守取代的實例為在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨 酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈 氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和甲硫氨酸)組內的取代。通常不改變比活的氨基酸取代在本領域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常 發(fā)生的交換為 Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/^er、Ala/Gly、Ala/Thr、kr/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。
在本發(fā)明的木葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸(essential amino acid)可根 據本領域已知方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanningmutagenesis) (Cunningham 和 Wells，Science 244:1081-1085,1989)。對于后一技術，將單一丙氨酸突 變引入分子中的每個殘基，并就生物學活性(即，木葡聚糖酶活性)測試所得到的突變分子 以鑒定對所述分子的活性至關重要的氨基酸殘基。亦參見Hilton等，J. Biol. Chem. 271 4699-4708,1996。所述酶或其他生物學相互作用的活性部位還可通過對結構的物理分析 來確定，如由下述技術確定核磁共振、晶體學(crystallography)、電子衍射或光親和標記，連同對推定的接觸位點(contract site)氨基酸進行突變。參見，例如，de Vos等， Science 255 :306-312,1992 ；Smith 等，J. Mol. Biol. 224 :899-904,1992 ；Wlodaver 等，FEBS Lett. 309 :59-64,1992。必需氨基酸的身份還可以從與本發(fā)明多肽相關的多肽的同源性分 析推出。屬于家族44糖苷水解酶的酶的晶體結構由Kitago等，J. Biol. Chem. Vol. 282 35703-35711,2007所公開?；谠摻Y構，用計算機模擬(in silico)生成所述親本木葡聚 糖酶(SEQ ID NO 3)的三維結構是可能的?；谂c公開的結構相比較，SEQ ID N0:3中下述 殘基被鑒定為對酶功能是至關重要的E187 (催化-酸/堿)、E358 (催化-親核)、E56 (羧 基基團對Ca2+配位)和D154(羧基基團對Ca2+配位)。因此，這些位置在親本酶中優(yōu)選不 突變。
親本木葡聚糖酶優(yōu)選包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列或其等位變體；或其具有木 葡聚糖酶活性的片段。在一個方面，所述親本木葡聚糖酶包含SEQID NO :2的氨基酸序列。 在另一個方面，所述親本木葡聚糖酶包含SEQ IDNO :2的成熟多肽。在另一個方面，所述親 本木葡聚糖酶由SEQ ID NO 3的氨基酸序列或其等位變體組成；或其具有木葡聚糖酶活性 的片段。在另一個方面，所述親本木葡聚糖酶包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列，或其等位 變體；或其具有木葡聚糖酶活性的片段。在另一個方面，所述親本木葡聚糖酶包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有木葡聚糖酶活性的片段。在另一個方面，所述 親本木葡聚糖酶包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5至少65%、更優(yōu)選至 少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至 少95%相同的氨基酸序列。SEQ ID NO :3的成熟多肽的片段是從該氨基酸序列的氨基和/ 或羧基端缺失一個或多個(幾個)氨基酸，并仍舊保持木葡聚糖酶活性的多肽。
在第二個方面，所述親本木葡聚糖酶由在非常低嚴格條件、優(yōu)選低嚴格條件、更優(yōu) 選中等嚴格條件、更優(yōu)選中-高嚴格條件、甚至更優(yōu)選高嚴格條件，且最優(yōu)選非常高嚴格條 件下與下述序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的 成熟多肽編碼序列、(ii)包含SEQ IDNO :1或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的成熟多肽編 碼序列的基因組DNA序列、(iii)⑴或( )的亞序列，或(iv) (i)、(ii)或(iii)的全長互 補鏈(J. Sambrook, E. F. Fritsch 禾口 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2dedition, Cold Spring Harbor, New York)。所述亞序列可編碼具有木葡聚糖酶 活性的多肽片段。在一個方面，所述互補鏈是SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0: 6的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。
SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的成熟多肽編碼序列的亞序列，或 其同源物，是從5’ -和/或3’ -端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列，其中由 所述亞序列編碼的多肽具有木葡聚糖酶活性。
親本酶還可為具有木葡聚糖酶活性的多肽的等位變體。
SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的多核苷酸；或其亞序列；以及SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 7的氨基酸序列；或其片段；可用于根據本領域公 知方法設計核酸探針以從不同屬或種的株鑒定并克隆編碼親本木葡聚糖酶的DNA。具體而 言，上述探針可用于遵循標準Southern印跡法，與目標屬或種的基因組或cDNA雜交，從而 鑒定并分離其中相應的基因。上述探針可顯著地短于整個序列，但應為至少14個、優(yōu)選至 少25個、更優(yōu)選至少35個且最優(yōu)選至少70個核苷酸的長度。然而，優(yōu)選所述核酸探針為至的長度。舉例而言，所述核酸探針可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個 核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸的長度。可使用甚至更長的 探針，例如優(yōu)選至少600個核苷酸、更優(yōu)選至少700個核苷酸、甚至更優(yōu)選至少800個核苷 酸、優(yōu)選至少900個核苷酸的長度，優(yōu)選至少1000個核苷酸的長度、優(yōu)選至少1100個核苷 酸的長度、優(yōu)選至少1200個核苷酸的長度、優(yōu)選至少1300個核苷酸的長度、優(yōu)選至少1400 個核苷酸的長度、優(yōu)選至少1500個核苷酸的長度或最優(yōu)選至少1600個核苷酸的長度的核 酸探針。DNA探針和RNA探針兩者都可以使用。所述探針通常經標記以供檢測其相應的基 因(舉例而言，用^/咕、355、生物素或抗生物素蛋白標記)。本發(fā)明涵蓋上述探針。
可針對與上述探針雜交并編碼親本木葡聚糖酶的DNA，篩選從其他生物制備的基 因組DNA文庫。來自其他生物的基因組或其他DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或 其他分離技術來分離。來自文庫的DNA或經分離的DNA可轉移至并固定于硝酸纖維素或其 他合適的載體材料。為了鑒定與SEQ ID NO :1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體 材料用于Southern印跡。就本發(fā)明而言，雜交表明所述多核苷酸與標記的核苷酸探針在低 到非常高嚴格條件下雜交，所述探針對應于SEQ ID NO :1所示的多核苷酸、其互補鏈或其亞 序列。與探針雜交的分子可使用，例如，X射線片(X-rayfilm)或本領域已知的其他任何檢 測手段來檢測。
在一個方面，所述核酸探針是SEQ ID NO=I的成熟多肽編碼序列。在另一個方面， 所述核酸探針是SEQ ID NO :1的核苷酸82-1653，或SEQ ID NO :1的核苷酸97-1653。在另 一個方面，所述核酸探針是編碼SEQ ID NO :2的多肽或其亞序列的多核苷酸序列。在另一 個方面，所述核酸探針是SEQ ID NO :1。
對于至少100個核苷酸長度的長探針，非常低到非常高嚴格條件定義為在42°C在 5X SSPE，0. 3% SDS, 200毫克/ml經剪切和變性的鮭精DNA，以及(對于非常低和低嚴格條 件)25%甲酰胺、(對于中等和中-高嚴格條件)35%甲酰胺或(對于高和非常高嚴格條 件)50%甲酰胺下，遵循標準Southern印跡方法進行預雜交和雜交最佳12到M小時。
對于至少100個核苷酸長度的長探針，所述載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘， 使用2X SSC,0. 2% SDS，優(yōu)選在45°C (非常低嚴格條件)、更優(yōu)選在50°C (低嚴格條件)， 更優(yōu)選在55°C (中等嚴格條件)，更優(yōu)選在60°C (中-高嚴格條件)，且最優(yōu)選在70°C (非 常高嚴格條件)進行。
對于約15個核苷酸到70個核苷酸長度的短探針，嚴格條件定義為根據Bolton和 McCarthy(1962, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 48 :1390)在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5% NP-40, IX Denhardt' s 溶液，ImM焦 磷酸鈉，ImM磷酸二氫鈉，0. ImM ATP和0. 2mg每ml酵母RNA中，在比計算的Tm低約5°C到 約10°C遵循標準Southern印跡法進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12- 小時。
對于約15個核苷酸到70個核苷酸長度的短探針，所述載體材料在6XSSC加0. 1% SDS中洗滌一次15分鐘，并使用6X SSC在比計算的Tm低5°C到10°C洗滌兩次，每次15分 鐘。
在第三個方面，親本木葡聚糖酶由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO 1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更 優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、且甚至最優(yōu)選96%、97%、98(%或99(%的同一性程度的核苷酸序列，或由上述核苷酸序列組成，且所述 多核苷酸編碼活性多肽。在一個方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO :1的核苷酸 82-1653，或 SEQ ID NO 1 的核苷酸 97-1653。
所述親本木葡聚糖酶可從任何屬的微生物獲得。在一個方面，所述親本木葡聚糖 酶是胞外分泌的。
在另一個方面，所述親本木葡聚糖酶可為細菌木葡聚糖酶。舉例而言，所述木葡 聚糖酶可為革蘭氏陽性細菌多肽，如芽孢桿菌屬(Bacillus)，優(yōu)選來自芽孢桿菌/乳桿菌 (Lactobacillus)亞門，優(yōu)選來自類芽孢桿菌屬(Paenikicillus)，特別是多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)，例如，多粘類芽孢桿菌ATCC832，優(yōu)選所述木葡聚糖酶是家族 44木葡聚糖酶，例如，如WO 01/6四03所述的，更優(yōu)選SEQ ID NO :5的木葡聚糖酶，更優(yōu)選 SEQ IDNO 7的木葡聚糖酶，且最優(yōu)選SEQ ID NO 2的木葡聚糖酶或其成熟多肽。
變體的產生
親本木葡聚糖酶的變體可根據任何本領域已知的誘變方法來制備，如隨機 和/或定點誘變、合成基因構建(synthetic gene construction)、半合成基因構建 (semi-synthetic gene construction)、隨機誘變、改組等。
合成基因構建涉及在體外合成設計為編碼目標多肽分子的多核苷酸分子?；蚝?成可利用多種技術，如由Tian等(Tian等，Nature 432 =1050-1054)所述基于多重微芯片 的技術(multiplex microchip-based)和類似技術來進行，其中合成寡核苷酸并在光-可 編程的微流芯片(photo-programmablemicrofluidic chip)上組裝。
半合成基因構建通過組合合成基因構建，和/或定點誘變，和/或隨機誘變，和/ 或改組的方面(aspect)來達成。半合成構建的代表為利用合成的多核苷酸片段結合PCR 技術的方法。因而可從頭合成(synthesize de novo)基因的給定區(qū)，而其他區(qū)可使用定點 特異性突變引物來擴增，而還可對其他區(qū)進行易錯PCR或非易錯PCR擴增。然后可將多核 苷酸片段改組。
定點誘變是在編碼所述親本木葡聚糖酶的多核苷酸分子中給定位點創(chuàng)建一種或 幾種突變的技術。所述技術可在體外或體內進行。
定點誘變可在體外通過PCR達成，其涉及使用含有所需突變的寡核苷酸引物。定 點誘變也可在體外通過盒式誘變(cassette mutagenesis)來進行，其涉及由限制性酶在下 述質粒上的位點進行切割，所述質粒包含編碼所述親本木葡聚糖酶的多核苷酸，并隨后將 含有所述突變的寡核苷酸連接于(ligation)所述多核苷酸。通常對質粒和寡核苷酸進行 消化的限制性酶是同一個，從而使得所述質粒和插入物的粘性末端彼此連接。對于合適技 術的進一步描述，參見 Sambrook 等(1989), Molecular cloning :A laboratory manual, Cold SpringHarbor lab. , Cold Spring Harbor, NY ； Ausube 1, F. Μ.等(編)"Current protocolsin Molecular Biology " . John Wiley and Sons,1995 ；Harwood, C. R.,禾口 Cutting, S. M.(編)"Molecular Biological Methods for Bacillus" . John Wiley and Sons, 1990)以及 WO 96/34946 ;Scherer 和 Davis，1979，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955 ；以及 Barton 等，1990，Nucleic Acids Researchl8 :7349_4966。
在所述連接酶反應之后，連接混合物可用于轉化宿主細胞，就克隆而言，經常使用 大腸桿菌細胞，如Ausubel，F. M.等中所述。轉化的大腸桿菌細胞可在液體培養(yǎng)基或固體瓊脂糖平板上增殖，質?？蓮乃鲛D化細胞中回收，并用來轉化枯草芽孢桿菌(B. subtilis) 細胞?？扇鏦O 03/095658中所述進行轉化合適的感受態(tài)芽孢桿菌屬細胞，如MB1510，衍生 自168(例如，可從BGSC以登錄號lA1168trpC2得到)。供文庫構建的由大腸桿菌質粒攜帶 的整合盒可用于芽孢桿菌屬的轉化。所述方法詳細描述于WO 03/095658?；蛘撸墒褂皿w 外擴增的 PCR-SOE-產物(Melnikov 和 Youngman，Nucleic Acid Research 27，1056)。
定點誘變可在體內通過本領域已知方法來達成。參見，例如，美國專利公開號 2004/0171154 ；Storici2001,Nature Biotechnology 19 :773-776；Kren等，1998,Nat. Med. 4 :285-290 ；以及 Calissano 禾口 Macino，1996，Fungal Genet. Newslett. 43 :15—16。
任何定點誘變方法可用于本發(fā)明。存在許多可用于制備親本木葡聚糖酶變體的商 業(yè)試劑盒。
單一或多重氨基酸取代、缺失和/或插入可使用已知的誘變、重組和/或改組方 法，然后進行相關的篩選方法來制備并測試，所述篩選方法如Reidhaar-Olson和Sauer， 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 和 Sauer，1989，Proc. Natl. Acad. ki. USA86 :2152-2156 ； WO 95/17413或WO 95/2沈25所公開的。其他可使用的方法包括易錯PCR，噬菌體展示(例 如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美國專利號 5，223，409 ；WO 92/06204)和 區(qū)域定向的(region-directed)誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988， DNA 7 127)。
如上所述的誘變/改組方法可與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細 胞(例如，如上所述的芽孢桿菌屬)表達的克隆的、經誘變的多肽的活性。編碼具有木葡聚 糖酶活性的多肽的經誘變的DNA分子可從宿主細胞回收，并使用本領域的標準方法快速地 測序。
變體
在本發(fā)明中，親本木葡聚糖酶的分離的變體在選自下組位置編號的一個或多個 (幾個)位置包含改變68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、 331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、104、 111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、 4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、 278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、 380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、 418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347 和 507，其中所述具有木葡聚糖酶活性的變體包含與所述親本木葡聚糖酶的氨基酸序列具有 至少70 %、更優(yōu)選至少75 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少85 %、甚至更優(yōu)選至少90 %、更 優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少約97 %、最優(yōu)選至少98 %且甚至最更優(yōu)選至少99 %的同一性程 度的氨基酸序列。這些位置的編號是相對于SEQ ID NO :3的氨基酸序列的。優(yōu)選地，在上 述一個或多個經鑒定的位置包含改變的變體在洗滌劑中，優(yōu)選在液體洗滌劑中，與所述親 本木葡聚糖酶相比，具有增加的穩(wěn)定性。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述變體包含一個或多個(幾個)下述的改變組合
Vl*+V2*+H3* ；
VlQ+*laE+*lbV ；[0086]H3A ；
H3A+H436A ；
K8A, Q, S ；
T9D ；
T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T ；
I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+ V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473 G+T517A+S522*；
I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+ V272A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477 I ；
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+ N168K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421 I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E ；
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+ V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450 I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E ；
I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+ I222V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y +A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522*；
I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+ D249N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y +A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E ；
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+1222 V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N44 1D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*；
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N +N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A ；
I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T +I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A46 9E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
K13A+K129A ；
K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P ；
K13A, R ；
K18R ；
R20A ；
K21Q+K129A ；
K21Q, R, T ；
Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N+K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A ；
D33V+Q68H+N168H+V450I ；
L34F, I, Μ, V ；
L34I+K129A ；
D37G, N+K129A+R156Y ；
E38I, V ；
M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337 L+M356L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522*；0114]M40V ；0115]L45I ；0116]Q68H, M, N ；0117]Q68H+G200P+N331F ；0118]Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；0119]Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F ；0120]Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H ；0121]Q68H+K118R+R156F, Y ；0122]Q68H+K118R+R156Y+G200P ；0123]Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F ；0124]Q68H+K129A, T+R156K+G200P+N331F ；0125]Q68H+R156F, V, Y+G200P+N331F ；0126]Q68H+R156Y ；0127]Q68H+R156Y+H193T ；0128]Q68H+R156Y+H193T+D366H ；0129]Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V ；0130]Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；0131]Q68H+T92A,D，I，S，V, Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；0132]Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；0133]Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F ；0134]Q68H+T92V+G200P+M310V ；0135]Q68H+T92V+G200P+M310V+N33IF ；0136]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F ；0137]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；0138]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T ；0139]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ；0140]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K0141]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H, K,Q ；0142]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T ；0143]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ；0144]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V ；[0145]Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T ；
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N ；
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T ；
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+M310L ；
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
Q68H+T92V+K118A, R+R156Y, F ；
Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H ；
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C ；
Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V ；
Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V+N331F ；
Q68H+T92V+R156F, Y+H193T ；
Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+D366H ；
Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+G200P+M310V ；
Q68H+T92V+R156Y ；
S76E, I, K, M, R, Τ, V, W ；
S76W+G200P ；
S76W+G200P+A224P ；
G78A+K118A++K129A+R156Y ；
G78A+K118A+K129A+R156Y ；
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A ；
G78A, N, S ；
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ；
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ；
L80V ；
A83D，E，H，I，L，N，R，S，T，Y ；
K87Q ；
K87V+K129A+K169A ；
T92I, V ；
T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
T92V+K118A+K129A+R156Y ；
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F ；
T92V+K129A+R156Y ；
K101A+K129A ；
KlOlR ；
K101R+L102I ；[0184K129A+R156Y+E288Q ；
K129A+R156Y+G200P ；
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K ；
K129A+R156Y+H164N ；
K129A+R156Y+H436Y ；
K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E ；
K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A ；
K129A+R156Y+K176P, S ；
K129A+R156Y+K275T ；
K129A+R156Y+K322I+K454Q ；
K129A+R156Y+K406N+N415G ；
K129A+R156Y+K454Q ；
K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T ；
K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T ；
K129A+R156Y+N302K+D303L, S ；
K129A+R156Y+N331F ；
K129A+R156Y+P507A ；
K129A+R156Y+R267H ；
K129A+R156Y+R409L, T ；
K129A+R156Y+S443D+K445S+L4491+V4501+S455N+M456Y ；
K129A+R156Y+T244D ；
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y ；
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A ；
Q137D, E ；
N140F ；
K142A, Q, R ；
F146C+H164C ；
F146K, L ；
F146L+K322I ；
L148K+N168D ；
Q149E ；
R156A, D, E, F, I，K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；
R156Y+N331F ；
V159M ；
H164A, N ；
L166I ；
N168D ；
K169A, Q, R ；
K176P ；A177E, T ； K180R ；H193A, D, S, T ； R197A,L ； H199A ；G200A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；G200P+A224P ；K202N, Q, R ；S214E ；K217A ；A221K ；G225S ；V232A ；G237A, S, V ；K240A, Q, R ；K252A, Q, R ；G253A ；R267A ；L268I ；K275A, Q, R ；L278I ；F281L ；M290R ；R295A ；K306A,R ；K307Q ；M310I, L, V ；M310V+N399I ；R314A ；G316I ；K322A,R ；D324N ；N331A, C, D, E, F, G, H, I，K, L, M, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；S332M,P ；S332P+V397I ；R340A, N, T ；K342A ；V345I ；K347A, Q, R ；CN 102057042 A說明 書16/83頁[0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280 [0281 [0282 [0283 [0284 [0285 [0286 [0287 [0288 [0289 [0290 [0291 [0292 [0293 [0294 [0295 [0296 [0297 [0298 [0299 [0300
權利要求
1.一種親本木葡聚糖酶的分離的變體，所述變體在所述親本木葡聚糖酶一個或多個選 自下組位置編號的位置包含改變68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、 332、9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、 101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、 206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、 179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、 147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、 253、415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、 347和507，所述位置對應于氨基酸序列SEQ ID NO 3中的位置，且其中a)所述改變?yōu)閕)在占據所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，和/或 )缺失占據所述位置的氨基酸，和/或iii)用不同的氨基酸取代占據所述位置的氨基酸；b)所述親本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；和c)所述變體具有木葡聚糖酶活性。
2.權利要求
1的變體，其中所述親本木葡聚糖酶選自下組SEQIDNO :3、SEQ ID NO :5 和SEQ ID NO :7，或所述親本木葡聚糖酶選自與SEQ IDNO :3的氨基酸序列具有至少75%同 一性的木葡聚糖酶。
3.權利要求
1或2的變體，其中所述變體包含一種或多種下述的改變組合 Vl*+V2*+H3* ；VlQ+*laE+*lbV ； H3A ；H3A+H436A ； K8A, Q, S ； T9D ；T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T ；I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228 I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T51 7A+S522*；I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A +I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I ；I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168 K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S42 4H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228 I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A46 9E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I22 2V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522*；I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D24 9N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A4 69E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+1222V+V 228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+ D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*；I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N16 8K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A ；I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I22 2V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K4 70T+I473G+T517A+S522*； K13A+K129A ；K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P ； K13A,R； K18R ； R20A ；K21Q+K129A ； K21Q, R, T ；Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N +K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A ； D33V+Q68H+N168H+V450I ； L34F, I, Μ, V ； L34I+K129A ； D37G, N+K129A+R156Y ； E38I,V；M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337L+M3 56L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522*； M40V ； L45I ； Q68H, M, N ； Q68H+G200P+N331F ；Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F ； Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H ； Q68H+K118R+R156F, Y ； Q68H+K118R+R156Y+G200P ； Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F ； Q68H+K129A, T+R156K+G200P+N331F ；Q68H+R156F, V，Y+G200P+N331F ；Q68H+R156Y ；Q68H+R156Y+H193T ；Q68H+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V ；Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92A, D，I，S，V, Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92N+D97N+K118A+K 129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F ；Q68H+T92V+G200P+M310V ；Q68H+T92V+G200P+M310V+N33IF ；Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H, K,Q ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T ； Q68H+T92V+K118A+Q 137E+R156Y+G200P+D324N ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T ； Q68H+T92V+K118A+Q 137E+R156Y+G200P+M310L ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+T92V+K118A, R+R156Y, F ；Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C ；Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V ；Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V+N331F ；Q68H+T92V+R156F, Y+H193T ；Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+D366H ；Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+G200P+M310V ；Q68H+T92V+R156Y ；S76E, I，K, M, R, Τ, V, W ；S76W+G200P ；S76W+G200P+A224P ；G78A+K118A++K129A+R156Y ；G78A+K118A+K129A+R156Y ； G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A ； G78A, N, S ；G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ； G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ； L80V ；A83D, E, H, I，L, N, R, S, T, Y ； K87Q ；K87V+K129A+K169A ； T92I,V ；T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； T92V+K118A+K129A+R156Y ； T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F ； T92V+K129A+R156Y ； K101A+K129A ； KlOlR ； K101R+L102I ；T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y ； PlllQ ； K118A+K129A ；K118A+K129A+F146L+R156Y+G200P+N33IF ；K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；K118A+K129A+R156Y ；Kl18A+K129A+R156Y+A224P ；Kl18A+K129A+R156Y+G200P ；K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F ；K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I ；K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F ；Kl18A+K129A+R156Y+K470T ；K118A,R；K118A+R156Y ；K118A+R156Y+G200P ；D119L ；G120A ；S123P,T ；S123T+K129A+R156Y ；K129A, F, I，K, R, S, T ；K129A+K169A ；K129A+K176P ；K129A+K275Q ；K129A+K445S ；K129A+K470T ；K129A+Q137E+R156Y ；K129A+Q137E+R156Y+G200P ；K129A+Q137E+R156Y+K470T ；K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y ；K129A+R156Y ；K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S ； K129A+R156Y+A328G ； K129A+R156Y+D247G ； K129A+R156Y+D249G, N, S； K129A+R156Y+D303I, K, S, V ； K129A+R156Y+D324N ； K129A+R156Y+D366H+T374A ； K129A+R156Y+D461N, Q, T； K129A+R156Y+E288Q ； K129A+R156Y+G200P ； K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K ； K129A+R156Y+H164N ； K129A+R156Y+H436Y ； K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E ； K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A ； K129A+R156Y+K176P, S ； K129A+R156Y+K275T ； K129A+R156Y+K322I+K454Q ； K129A+R156Y+K406N+N415G ； K129A+R156Y+K454Q ； K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T ； K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T ； K129A+R156Y+N302K+D303L, S ； K129A+R156Y+N331F ； K129A+R156Y+P507A ； K129A+R156Y+R267H ； K129A+R156Y+R409L,T ；K129A+R156Y+S443D+K445S+L449I+V450I+S455N+M456Y ；K129A+R156Y+T244D ；K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y ；K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A ；Q137D, E ；N140F ；K142A, Q, R ；F146C+H164C ；F146K,L ；F146L+K322I ；L148K+N168D ；Q149E ；R156A, D, E, F, I，K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；R156Y+N331F ；V159M ；H164A,N ；L166I ；N168D ；K169A, Q, R ；K176P ；A177E, T ；K180R ；H193A, D, S, T ； R197A,L ； H199A ；G200A, C, D, E, F, H, I，K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；G200P+A224P ；K202N, Q, R ；S214E ；K217A ；A221K ；G225S ；V232A ；G237A, S, V ；K240A, Q, R ；K252A, Q, R ；G253A ；R267A ；L268I ；K275A, Q, R ； L278I ； F281L ； M290R ； R295A ； K306A,R； K307Q ； M310I, L, V ；M310V+N399I ； R314A ； G316I ； K322A,R ； D324N ；N331A, C, D, E, F, G, H, I，K, S332M,P ； S332P+V397I ；L，M，P，Q，R, S, Τ, V, W, Y ；R340A, N, T ； Κ342Α ； V345I ； Κ347Α, Q, R ； D348G ； K353Q,R ； D366H ； M373Q ； Τ374Α ； L380F ； Κ382Α ； Ν383Υ ；Ν389Α, F, N, V ； W391V ； K392G, Q ； D395G ； G396P ； V397S ； Ν399Ι ； Κ406Ν ； G413A, S ； Κ414Α ； N415S ；T417K ； F418I ； V431E ； H436A ；N441G+A442E+S443D ； S443E, K, Q ； K445A, R, S ； K445C+K470C ； H448A ； K454R ；S467R+G468S+A469T ； G468S, Y ； K470P, R, T ； I473T ； K476Q ； K482A, Q, R ； K488A, Q, R, T ； A490R ； G498A, D, S ； R500A, Τ, V ； H512A ；T517A+G518D ；或 G518D。
4.權利要求
1或2的變體，在對應于68位、或123位、或156位、或118位、或200位、 或1 位、或137位、或193位、或92位、或76位、或331位的一個或多個位置包含改變，所 述位置對應于氨基酸序列SEQ IDNO 3中的位置。
5.權利要求
1或2的變體，其中所述變體在68位包含取代，并在一個或多個其他位 置包含一個或多個取代，所述其他位置選自下組的位置編號123、156、118、200、129、137、 193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395 和 366。
6.權利要求
1或2的變體，其中所述變體在位置156包含取代，并在一個或多個其他位 置包含一個或多個取代，所述其他位置選自下組的位置編號10、13、14、19、37、68、78、92、 118、123、129、137、139、140、147、159、164、165、169、176、177、179、183、200、204、211、222、 224、244、247、249、259、267、268、269、275、288、299、301、302、303、310、324、328、331、366、 380、383、384、389、406、409、415、436、443、445、449、450、454、455、456、461、470 和 507。
7.權利要求
6的變體，其中所述變體在1 位和156位包含取代。
8.權利要求
1-7任一項所述的變體，其中所述變體包含選自下組的一個或多個取代 Q68H, N, L ；S123P, T ；R156Y, F, V, I, K, W, L, M ；K118A, R ；G200P, E, S, D ；K129T, A, S ；Q137E ； H193T, S, D ；T92V, I，A, S ；A83E ；Q149E ；L34F, I，V ；R340T, N ；S332P ；T9D ；S76W, V, I，K, R, T ；N331F, C ；M310I, V, L ；D324N ；G498A, D ；D395G 和 D366H。
9.權利要求
8的變體，其中所述變體包含選自下組的一個或多個取代Q68H；S123P ； R156Y, F ；K118A ；G200P, E ；K129T, A ；Q137E ；H193T ；T92V 和 N331F。
10.權利要求
1-4任一項所述的變體，其中所述變體包含一個或多個下述的取代組合 Q68H ；S123P ；R156Y ；Q68H+R156Y ；K129A+R156Y ；S123T+K129A+R156Y ；K129A+R156Y+G200P ；Q68H+K118R+R156F ；Q68H+R156Y+H193T ；Q68H+R156F+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+R156Y ；K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ；Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F ；K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F ；T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ；Q68H+T92V+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F ；Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N33IF ；Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；或Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F。
11.權利要求
1-10任一項所述的變體，其中所述變體中改變的總數為二，優(yōu)選三，甚至 更優(yōu)選四，甚至更優(yōu)選五，甚至更優(yōu)選六，甚至更優(yōu)選七，甚至更優(yōu)選八，甚至更優(yōu)選九，且 最優(yōu)選十。
12.權利要求
1-11任一項所述的變體，其中所述變體包含與SEQIDNO :3的親本木葡 聚糖酶的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。
13.權利要求
1-12任一項所述的變體，其中所述變體與所述親本木葡聚糖酶相比具有 改善的化學穩(wěn)定性。
14.權利要求
13的變體，其中所述改善的化學穩(wěn)定性導致改善的洗滌劑穩(wěn)定性。
15.一種分離的多核苷酸序列，其編碼權利要求
1-12任一項所述的變體。
16.權利要求
15的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列通過誘變對應于SEQID NO 1的親本多核苷酸序列，或通過誘變與SEQ ID NO 1的多核苷酸序列具有至少75%同一性 的多核苷酸序列來制備。
17.一種包含表達載體的重組宿主細胞，所述表達載體包含權利要求
15或16的多核苷 酸序列。
18.—種產生親本木葡聚糖酶變體的方法，其中所述變體具有木葡聚糖酶活性，所述方 法包括a)在適于所述變體表達的條件下培養(yǎng)權利要求
17的宿主細胞；和b)從培養(yǎng)基回收所述變體。
19.一種改善木葡聚糖酶的洗滌劑穩(wěn)定性的方法，其包括改變一個或多個選自下組 位置的位置68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、 324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、104、111、306、 117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、 224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、 288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、 382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、418、40、443、 445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347 和 507，所述位置 對應于氨基酸序列SEQ ID NO 3中的位置，且其中a)所述改變?yōu)閕)在占據所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，和/或 )缺失占據所述位置的氨基酸，和/或iii)用不同的氨基酸取代占據所述位置的氨基酸；b)所述親本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；和c)所述變體具有木葡聚糖酶活性。
20.權利要求
19的方法，其中所述親本木葡聚糖酶選自下組SEQIDNO 3, SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :7，或所述親本木葡聚糖酶選自與SEQ IDNO :3的氨基酸序列具有至少75% 同一性的木葡聚糖酶。
21.權利要求
19或20的方法，其中所述變體包含一種或多種下述的改變組合 Vl*+V2*+H3* ；VlQ+*laE+*lbV ； H3A ；H3A+H436A ； K8A, Q, S ； T9D ；T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T ；I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228 I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*；I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A +I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I ；I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168 K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S42 4H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228 I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A46 9E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I22 2V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A4 69E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522*；I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D24 9N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A4 69E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E ；I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+I222V+V 228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+ D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*；I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N16 8K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A ；I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+122 2V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K4 70T+I473G+T517A+S522*； K13A+K129A ；K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P ； K13A,R； K18R ； R20A ；K21Q+K129A ； K21Q, R, T ；Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N +K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A ； D33V+Q68H+N168H+V450I ； L34F, I, Μ, V ； L34I+K129A ； D37G, N+K129A+R156Y ； E38I,V ；M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337L+M3 56L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522*；M40V ； L45I ； Q68H, M, N ； Q68H+G200P+N331F ；Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F ；Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+K118R+R156F, Y ；Q68H+K118R+R156Y+G200P ；Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F ；Q68H+K129A, T+R156K+G200P+N331F ；Q68H+R156F, V，Y+G200P+N331F ；Q68H+R156Y ；Q68H+R156Y+H193T ；Q68H+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V ；Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92A, D，I，S，V, Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F ；Q68H+T92V+G200P+M310V ；Q68H+T92V+G200P+M310V+N33IF ；Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K ； Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H, K,Q ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ； Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T ； Q68H+T92V+K118A+Q 137E+R156Y+G200P+M310L ； Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+T92V+K118A, R+R156Y, F ；Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H ；Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C ； Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V ； Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V+N331F ； Q68H+T92V+R156F, Y+H193T ； Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+D366H ； Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+G200P+M310V ； Q68H+T92V+R156Y ； S76E, I，K, M, R, Τ, V, W ； S76W+G200P ； S76W+G200P+A224P ； G78A+K118A++K129A+R156Y ； G78A+K118A+K129A+R156Y ； G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A ； G78A, N, S ；G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ； G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ； L80V ；A83D, E, H, I，L, N, R, S, T, Y ； K87Q ；K87V+K129A+K169A ； T92I,V ；T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； T92V+K118A+K129A+R156Y ； T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ； T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F ； T92V+K129A+R156Y ； K101A+K129A ； KlOlR ； K101R+L102I ；T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y ； PlllQ ； K118A+K129A ；K118A+K129A+F146L+R156Y+G200P+N33IF ； K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ； K118A+K129A+R156Y ； Kl18A+K129A+R156Y+A224P ； Kl18A+K129A+R156Y+G200P ；K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F ；K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I ；K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F ；Kl18A+K129A+R156Y+K470T ；K118A,R；K118A+R156Y ；K118A+R156Y+G200P ；D119L ；G120A ；S123P,T ；S123T+K129A+R156Y ；K129A, F, I，K, R, S, T ；K129A+K169A ；K129A+K176P ；K129A+K275Q ；K129A+K445S ；K129A+K470T ；K129A+Q137E+R156Y ；K129A+Q137E+R156Y+G200P ；K129A+Q137E+R156Y+K470T ；K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y ；K129A+R156Y ；K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S ； K129A+R156Y+A328G ； K129A+R156Y+D247G ； K129A+R156Y+D249G, N, S； K129A+R156Y+D303I, K, S, V ； K129A+R156Y+D324N ； K129A+R156Y+D366H+T374A ； K129A+R156Y+D461N, Q, T； K129A+R156Y+E288Q ； K129A+R156Y+G200P ； K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K ； K129A+R156Y+H164N ； K129A+R156Y+H436Y ； K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E ； K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A ； K129A+R156Y+K176P, S ；K129A+R156Y+K275T ； K129A+R156Y+K322I+K454Q ； K129A+R156Y+K406N+N415G ； K129A+R156Y+K454Q ； K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T ； K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T ； K129A+R156Y+N302K+D303L, S ； K129A+R156Y+N331F ； K129A+R156Y+P507A ； K129A+R156Y+R267H ； K129A+R156Y+R409L, T ；K129A+R156Y+S443D+K445S+L4491+V450I+S455N+M456Y ；K129A+R156Y+T244D ；K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y ；K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A ；Q137D, E ；N140F ；K142A, Q, R ；F146C+H164C ；F146K,L ；F146L+K322I ；L148K+N168D ；Q149E ；R156A, D, E, F, I，K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；R156Y+N331F ；V159M ；H164A,N；L166I ；N168D ；K169A, Q, R ；K176P ；A177E, T ；K180R ；H 193A, D, S, T ； R197A,L ； H199A ；G200A, C, D, E, F, H, I，K, L, M, N, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ； G200P+A224P ； K202N, Q, R ；S214E ； K217A ； A221K ； G225S ； V232A ； G237A, S, V ； K240A, Q, R ； K252A, Q, R ； G253A ； R267A ； L268I ； K275A, Q, R ； L278I ； F281L ； M290R ； R295A ； K306A,R； K307Q ； M310I, L, V ； M310V+N399I ； R314A ； G316I ； K322A,R ； D324N ；N331A, C, D, E, F, G, H, I，K, L, M, P, Q, R, S, Τ, V, W, Y ；S332M,P ；S332P+V397I ；R340A, N, T ；K342A ；V345I ；K347A, Q, R ；D348G ；K353Q,R ；D366H ；M373Q ；T374A ；L380F ；K382A ；N383Y ；N389A, F, N, V ； W391V ； K392G,Q ； D395G ； G396P ； V397S ； N399I ； K406N ； G413A, S ； K414A ； N415S ； T417K ； F418I ； V431E ； H436A ；N441G+A442E+S443D ； S443E, K, Q ； K445A, R, S ； K445C+K470C ； H448A ； K454R ；S467R+G468S+A469T ； G468S, Y ； K470P, R, T ； I473T ； K476Q ； K482A, Q, R ； K488A, Q, R, T ； A490R ； G498A, D, S ； R500A, Τ, V ； H512A ；T517A+G518D ；或 G518D。
22.一種配制物，其包含權利要求
1-14任一項所述的變體。
23.權利要求
⑵的配制物，其中所述配制物是液體配制物。
專利摘要
本發(fā)明涉及親本木葡聚糖酶的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述變體木葡聚糖酶的多核苷酸，和包含所述多核苷酸的構建體、載體和宿主細胞。
文檔編號C12N1/15GKCN102057042SQ200980121086
公開日2011年5月11日 申請日期2009年6月4日
發(fā)明者基思·吉布森, 弗蘭克·W·拉斯馬森, 沃納·貝森馬特, 艾斯本·P·弗里伊斯, 邁克爾·斯克喬特 申請人:諾維信公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan