專利名稱：來自畸枝霉屬的堿性木葡聚糖酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及內源于屬于畸枝霉屬(Malbranchea)的菌株的木葡聚糖酶(xyloglucanase)，特別是pH在4-11的范圍內呈現(xiàn)木葡聚糖酶活性的酶；本發(fā)明還涉及這些酶的生產(chǎn)方法；和這些酶在紡織品、洗滌劑和纖維素纖維加工工業(yè)中的用途。
茄科植物產(chǎn)生的木葡聚糖比較特殊，因為通常其中只有40％的β-1，4-鍵連接的葡萄糖殘基在0-6位上帶有糖基側鏈。此外，高達60％的木糖殘基在0-2位被α-L-阿拉伯糖基取代，一些茄科植物，諸如馬鈴薯之類，也有在一些木糖殘基的0-2位存在β-D-半乳糖取代基的木葡聚糖(York等人(1996))。
木葡聚糖據(jù)信通過交聯(lián)纖維素細絲形成纖維素-木葡聚糖網(wǎng)而在植物初生壁中起作用。該網(wǎng)狀結構被認為是初生細胞壁的結構完整性所必需的(Carpita等人，1993)。木葡聚糖的另一重要功能是作為木葡聚糖亞基寡糖的貯藏器，它是植物細胞生長的生理活性調節(jié)劑。木葡聚糖亞基也可調節(jié)木葡聚糖內切轉糖苷酶(XET)的作用，XET是一種推測在植物細胞壁延伸中起作用的細胞壁相關酶。因此木葡聚糖可能在壁松弛及由此產(chǎn)生的細胞膨脹中起重要作用(Fry等人，1992)。
許多雙子葉品種的種子包含木葡聚糖作為主要的多糖貯藏后備。這種類型的木葡聚糖位于種子子葉細胞壁內側的巨大增厚部分中，它主要由葡萄糖、木糖和半乳糖組成(Rose等人，1996)。
在1943年，當樹膠被發(fā)現(xiàn)可用作紙和紡織品漿料時，羅望子樹酸豆(Tamarindus indica)的種子就成為樹膠的商業(yè)來源。由于樹膠的低成本及其優(yōu)良特性，在亞洲已廣泛使用羅望子木葡聚糖來對黃麻和棉進行上漿。羅望子木葡聚糖的食品應用包括用于糖果、果醬和果子凍，并可作為冰淇淋和蛋黃醬中的穩(wěn)定劑(Whistler等人，1993)。
木葡聚糖酶活性不包括在酶命名法提供的酶分類中(1992)。迄今為止，這一酶活性只被簡單地歸于葡萄糖酶活性類，并常被認為與纖維素分解活性(EC 3.2.1.4)，即水解纖維素或纖維素衍生底物中β-1，4-糖苷鍵的活性相同，或者至少是具有纖維素分解活性的酶的一種次要活性。然而，真正的木葡聚糖酶是真正具有木葡聚糖專一性的酶，它能夠催化木葡聚糖至木葡聚糖寡糖的水解作用，但無實質性的纖維素分解活性，例如，水解常規(guī)使用的纖維素樣底物CMC(羧甲基纖維素)、HE纖維素和Avicel(微晶纖維素)的活性。木葡聚糖酶裂解木葡聚糖主鏈中的β-1，4-糖苷鍵。
Vincken等人描述了木葡聚糖酶活性(1997)，他從綠色木霉(與T.reesei相似)中鑒定出了三種不同內切葡聚糖酶，這三種酶都具有水解纖維素或CMC的高活性，并表明EndoI(真正屬于糖基水解酶家族5，參見Henrissat，B.等人(1991，1993))基本上無(即很少有)水解木葡聚糖的活性，而EndoV(屬于糖基水解酶家族7)和EndoIV(屬于糖基水解酶家族12)均分別具有水解木葡聚糖和CMC的活性，并且活性水平相當。
國際專利申請WO 94/14953公開了克隆自真菌棘孢曲霉的木葡聚糖酶(EG II)。
國際專利公開WO 98/38288公開了分別來自Tiarosporellaphaseolina和Dichotomocladium hesseltinei的木葡聚糖酶的氨基酸序列。
國際專利公開WO 98/50513公開了含木葡聚糖酶的洗衣和清潔組合物。
國際專利公開WO 99/02663公開了克隆自地衣形芽胞桿菌和Bacillus agaradhaerens的木葡聚糖酶。
由于許多重要的工藝，工業(yè)工藝和使用工業(yè)生產(chǎn)的試劑的家庭工藝，都是在堿性高pH條件下操作的。因此，需要一種在堿性pH下具有高木葡聚糖酶活性的真正木葡聚糖酶。
因此，本發(fā)明涉及一種分離或純化的木葡聚糖酶，它是從屬于畸枝霉屬的菌株中獲得的，優(yōu)選屬于選自以下種的菌株Malbrancheacinnamomea(和這三個同義詞Malbranchea sulfurea、Malbrancheapulchella var.sulfurea和Thermoidium sulfureum)、Malbrancheagraminicola、Malbranchea pulchella、Malbranchea filamentosa、Malbranchea gypsea、Malbranchea albolutea、Malbranchea arcuata、Malbranchea aurantiaca、Malbranchea bolognesii-chiurcoi、Malbranchea chrysosporioidea、Malbranchea circinata、Malbrancheaflava、Malbranchea flavorosea、Malbranchea flocciformis、Malbranchea fulva、Malbranchea kambayashii、Malbrancheamulticolor、Malbranchea sclerotica、Malbranchea setosa和Malbranchea dendritica，該酶呈現(xiàn)木葡聚糖酶活性并且對纖維素或纖維素衍生底物沒有活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，木葡聚糖酶的表觀分子量為25±10kDa，pI在3-5之間并且pH在4-1l時在50℃下測得具有木葡聚糖酶活性。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種克隆自屬于畸枝霉屬的菌株的木葡聚糖酶，即選自以下之一的木葡聚糖酶(a)含有由SEQ ID NO1的141-806位置的DNA序列編碼的片段的多肽；(b)在表達所述DNA序列的條件下通過培養(yǎng)含SEQ ID NO1的序列的細胞產(chǎn)生的多肽；和(c)當同源性是通過10.0版本的GCG程序包中提供的GAP且使用GAP產(chǎn)生罰分(creation penalty)為8且GAP延伸罰分(extension penalty)為2測定時，序列與SEQ ID NO1的1-222位具有至少80％同源性的木葡聚糖酶。
另一方面，本發(fā)明提供了一種具有木葡聚糖酶活性的分離或純化的多肽，它是從畸枝霉屬的菌株獲得的并具有i)pH為4-11時在50℃下測定的木葡聚糖酶活性；ii)通過SDS-PAGE測定的分子量為25±10kDa；iii)等電點(pI)在3-5；和/或iv)N-端序列Ala-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Ser-Glu-Gln-Ser-Gly-Pro-Tyr-I le-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu。
本發(fā)明還提供了一種分離的木葡聚糖酶，它(i)無同源雜質，及(ii)是通過培養(yǎng)含有SEQ ID NO1的141-806位的DNA序列的細胞產(chǎn)生的。
本發(fā)明的新型酶可用于處理纖維素材料，尤其是含纖維素的纖維、紗線、機織或非機織織物。可在將纖維素材料加工成可備用于服裝制造或織物制造的材料的過程中進行上述處理，例如，在脫漿或沖洗步驟中；或者在這種織物或服裝的工業(yè)或家庭洗衣過程中進行處理。
因此，更進一步，本發(fā)明涉及一種含有在堿性pH范圍內具有顯著活性的木葡聚糖酶的洗滌劑組合物，該酶內源于屬于真菌畸枝霉屬的菌株，特別是屬于真菌菌種Malbranchea cinnomomea；本發(fā)明還涉及本發(fā)明的酶在含纖維素的纖維、紗線、機織或非機織織物的處理中的用途。
本發(fā)明現(xiàn)在已使將真正的酶促洗滌過程用于纖維素材料的制備中成為可能，例如使得在隨后的染色操作中有適當反應。進一步地，預計含該新型酶的洗滌劑組合物能去除或漂白洗衣中出現(xiàn)的某些污物或色斑，特別是由含木葡聚糖食品、植物等產(chǎn)生的污跡或斑點。預計用含該新型酶的洗滌劑組合物進行處理能阻止某些污物與殘留在纖維素物質上的木葡聚糖結合。
附圖在附圖中

圖1顯示了pCaHj527的構建過程；圖2顯示了源自菌株UAMH2485的級分(fraction)在595nm下的相對木葡聚糖酶和CMC-酶活性；圖3顯示了源自CBS343.55的級分在595nm下的相對木葡聚糖酶和CMC-酶活性；和圖4顯示了源自CBS960.72的級分在595nm下的相對木葡聚糖酶和CMC-酶活性。
發(fā)明詳述在糖基水解酶10多個不同家族中均發(fā)現(xiàn)了纖維素酶。一些纖維素酶也呈現(xiàn)木葡聚糖酶活性。今天，這些纖維素酶已發(fā)現(xiàn)可歸類于家族5、7和12。而底物專一性卻不與家族直接相關在一家族內主要的酶活性可以是纖維素酶或甘露聚糖酶(家族5)，或地衣多糖酶(lichinase)、β-1，3-葡聚糖酶或木葡聚糖轉移酶活性(家族16)。迄今為止僅僅非常少的酶被公開其大部分或主要酶活性是對木葡聚糖的活性。如上所述，該活性還未收入正式的酶命名法中。
在本發(fā)明上下文中，術語“酶制劑”表示或者是來自單個微生物菌種的常規(guī)酶發(fā)酵產(chǎn)品，可能已分離和純化，這些制劑常含有許多不同的酶活性；或者是單組分酶的混合物，優(yōu)選使用常規(guī)重組技術而得自細菌或真菌菌種的酶，這些酶已被發(fā)酵并且可能已分別分離和純化，且它們可來源于不同的菌種，優(yōu)選真菌或細菌的菌種；或者是作為表達重組木葡聚糖酶之宿主細胞的微生物的發(fā)酵產(chǎn)品，但該微生物同時還產(chǎn)生其它酶，如木葡聚糖酶、蛋白酶或纖維素酶，它們是該微生物的天然存在的發(fā)酵產(chǎn)物，即由相應的天然存在的微生物常規(guī)產(chǎn)生的酶復合物。
在一優(yōu)選實施方式中，與最佳pH時的活性相比，本發(fā)明的木葡聚糖酶在pH9.5的相對活性為至少50％，優(yōu)選至少55％，更優(yōu)選至少60％，特別是至少65％更特別是70％。
在另一優(yōu)選實施方式中，與最佳pH時的活性相比，本發(fā)明的木葡聚糖酶在pH10時的相對活性為至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少55％，特別是至少60％。
在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的木葡聚糖酶在20℃-70℃的溫度下有活性。與最佳溫度下的活性相比，本發(fā)明的木葡聚糖酶在40-60℃的溫度范圍內的相對活性優(yōu)選為至少40％，更優(yōu)選至少50％，特別是至少55％，尤其是至少60％。
本發(fā)明的木葡聚糖酶對纖維素或纖維素衍生底物沒有活性。測定纖維素酶活性(內切-β-1，4-葡聚糖酶活性，即EC3.2.1.4)的常規(guī)底物是羧甲基纖維素(CMC)。測定纖維素酶或纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)的另一常規(guī)底物是Avicel，它是本領域技術人員公知的微晶纖維素。
本發(fā)明還涉及含有本文所述的木葡聚糖酶的酶制劑，任選還含有一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶(內切-β-1，4-葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶(內切-β-1，3(4)-葡聚糖酶)、脂酶、角質酶、過氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質素酶(ligninase)、支鏈淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纖維素酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetyl esterase)、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonase)、果膠分解酶、果膠酸酯分解酶(pectate lyase)、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉谷氨酰胺酶、或它們的混合物。在一個優(yōu)選實施方式中，制劑中的一種或多種或所有酶是利用重組技術制備的，即該(諸)酶是單組分酶，它(它們)與其它酶混合以形成具有所需酶混合的酶制劑。
另一方面，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明木葡聚糖酶或木葡聚糖酶制劑的方法，該方法包括培養(yǎng)一微生物，例如真菌畸枝霉屬的菌株，優(yōu)選屬于以下菌種的菌株Malbranchea cinnamomea(和這三個同義詞Malbranchea sulfurea、Malbranchea pulchella var.sulfurea和Thermoidium sulfureum)、Malbranchea graminicola、Malbrancheapulchella、Malbranchea filamentosa、Malbranchea gypsea、Malbranchea albolutea、Malbranchea arcuata、Malbrancheaaurantiaca、Malbranchea bolognesii-chiurcoi、Malbrancheachrysosporioidea、Malbranchea circinata、Malbranchea flava、Malbranchea flavorosea、Malbranchea flocciformis、Malbrancheafulva、Malbranchea kambayashii、Malbranchea multicolor、Malbranchea sclerotica、Malbranchea setosa和Malbrancheadendritica，例如選自以下的菌株Malbranchea cinnamomea、CBS115.68、MUCL11291、CBS343.55、MUCL9500、UAMH3827、CBS423.54、CBS960.72和UAMH2485，所述微生物在允許產(chǎn)生木葡聚糖酶的條件下能夠產(chǎn)生該酶，并從培養(yǎng)物中回收此酶?？衫贸Ｒ?guī)發(fā)酵技術進行培養(yǎng)，如在搖瓶或帶攪拌的發(fā)酵罐中培養(yǎng)以確保在誘導木葡聚糖酶產(chǎn)生的生長培養(yǎng)基中有足夠的通氣量。生長培養(yǎng)基中可包括諸如蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白氨基酸之類的常規(guī)N-源，少量的諸如葡萄糖或蔗糖之類的常規(guī)C-源，還有如木葡聚糖或谷糠(如小麥麩或米殼)之類復合植物底物的誘導劑?？捎贸Ｒ?guī)技術進行回收。如用離心或過濾方法分離生物質和上清液，回收上清液、或如果感興趣的酶在胞內就裂解細胞，可能還要如EP 0 406 314所述的進行純化或如WO 97/15660所述進行結晶。
在本發(fā)明上下文中，術語“表達載體”指含目的多肽編碼片段及與其可操作相連提供其轉錄的附加片段的線性或環(huán)狀DNA分子。這些附加片段可能包括啟動子和終止子序列，并可選擇性地包括一個或多個復制起點、一個或多個選擇標記、增強子、聚腺苷酸化信號，等等。表達載體通常來源于質?；虿《綝NA，或可包括二者的元件在內。本發(fā)明的表達載體可以是任何便于進行重組DNA操作的表達載體，載體的選擇常取決于它將引入的宿主細胞。因而，該載體可為自主復制型載體，即作為一染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體的復制，如質粒。或者，載體可以是這樣一種形式，當將其引入宿主細胞時，可以整合入宿主細胞基因組并與其整合入的染色體一起復制。
本文有關多肽或蛋白質表達時所用的術語“重組體表達”或“重組表達”是按照本領域的標準定義限定的。蛋白質的重組表達通常是利用上文剛提到的表達載體進行的。
當用于多核苷酸分子時，術語“分離的”表示已脫離天然的遺傳環(huán)境因而無其它外源或不希望有的編碼序列的多核苷酸，它為適用于基因工程蛋白質生產(chǎn)系統(tǒng)的形式。這些分離的分子是那些分離自其天然環(huán)境的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含通常與它們相關的其它基因，但可以包括諸如啟動子和終止子之類的天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)。相關區(qū)域的鑒定對本領域常規(guī)技術人員將是顯而易見的(參見例如Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。術語“分離的多核苷酸”或者可稱為“克隆的多核苷酸”。
當用于蛋白質/多肽時，術語“分離的”表明該蛋白質是在非其天然環(huán)境的條件下發(fā)現(xiàn)的。在一優(yōu)選形式中，該分離的蛋白質基本上不含其它蛋白質，尤其是物其它同源蛋白質(即“同源雜質”(見下文))。優(yōu)選提供純度高于40％的蛋白質，更優(yōu)選提供純度超過60％的蛋白質。
甚至更優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質，即通過SDS-PAGE測定，純度高于80％，更優(yōu)選純度高于95％，還更優(yōu)選純度高于99％。
術語“分離的蛋白質/多肽”或者可稱為“純化的蛋白質/多肽”。
術語“同源雜質”意指源自最初得到本發(fā)明多肽的同源細胞的任何雜質(如除本發(fā)明多肽之外的其它多肽)。
本文所用與特定微生物來源相關的術語“獲自”指由該特定來源產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽，或已插入此來源的基因的細胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。
當指DNA片段時，術語“可操作連接”表示該片段被連接在一起以便它們所起作用與它們原預期目的一致，如轉錄起始于啟動子并通過編碼片段直到終止子。
術語“多核苷酸”表示從5’到3’末端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可分離自天然來源、體外合成或制備自天然和合成分子的聯(lián)合體。
術語“多核苷酸分子的互補物”是指與對比序列相比具有互補堿基序列并反向定向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’與5’CCCGTGCAT 3’互補。
術語“簡并核苷酸序列”是指包括一個或多個簡并密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼Asp)。
術語“啟動子”表示含有一部分基因的DNA序列，所述DNA序列用于結合RNA聚合酶并起始轉錄。啟動子序列通常，但并非總是，存在于基因的5’非編碼區(qū)。
術語“分泌信號序列”表示編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，該多肽作為更大多肽的一個組分，介導該更大的多肽穿過合成它的細胞的分泌路徑。在通過分泌路徑的時候，該更大的肽通常被裂解去除了該分泌肽。多核苷酸在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的分離多核苷酸在至少是中度嚴格條件下可與SEQ ID NO1的相似大小區(qū)域或其互補序列雜交。
具體地說，本發(fā)明的多核苷酸在至少是中度嚴格的條件下，優(yōu)選如下詳述的高度嚴格條件下可與下述變性雙鏈DNA探針雜交包含SEQ IDNO1中所示的全長序列或包含SEQ ID NO1的141-806位中所示的序列的探針，或者含SEQ ID NO1且長度至少為約100個堿基對的亞序列的任何探針。測定中度或高度嚴格條件下核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間雜交的合適實驗條件包括將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜預浸泡于5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鉀，Sambrook等，1989)中10分鐘，并于5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理鮭精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預雜交該濾膜，然后在含濃度為10ng/ml的隨機引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化學(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP-標記的(比活性高于1×109cpm/μg)探針的相同溶液中約45℃下雜交12小時。濾膜隨后在2×SSC、0.5％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘，洗滌溫度為至少60℃(中度嚴格條件)，更優(yōu)選至少65℃(中/高度嚴格條件)，還更優(yōu)選至少70℃(高度嚴格條件)，更優(yōu)選至少75℃(極高嚴格條件)。
用X-射線膠片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交上的分子。
如前面所提到的，這些分離多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法在本領域是眾所周知的。可用本領域已知的方法從基因庫或DNA文庫中克隆編碼目的基因的DNA和RNA。
隨后用例如雜交或PCR方法鑒定和分離編碼具有木葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進一步提供了來自不同真菌菌株的多肽和多核苷酸對應物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。
將由本發(fā)明的畸枝霉屬木葡聚糖酶的克隆提供的信息和組合物與常規(guī)克隆技術相結合可克隆具有木葡聚糖酶活性的多肽的種同系物。例如，DNA序列可用來自表達該蛋白質的細胞類型獲得的染色體DNA進行克隆?？捎冒创颂幑_畸枝霉屬木葡聚糖酶DNA和多肽序列設計的探針通過探測RNA印跡鑒定DNA的合適來源。隨后從陽性細胞系的染色體DNA制備文庫。編碼具有木葡聚糖酶活性的多肽的DNA序列可隨后用各種方法分離，諸如用按上述序列設計的探針進行探測，或用基于這些序列的一套或多套簡并探針進行探測。DNA序列也可采用聚合酶鏈反應或PCR(Mullis，US4,683,202)，用設計自上述序列的引物進行克隆。在另外的方法中，可用DNA文庫轉化或轉染宿主細胞，并用針對木葡聚糖酶的抗體(單克隆或多克隆抗體)檢測感興趣的DNA的表達，該木葡聚糖酶克隆自Malbranchea cinnamomea、CBS115.68、MUCL 11291、CBS343.55、MUCL 9500、UAMH 3827、CBS 423.54、CBS 960.72或UAMH 2485，經(jīng)過表達和純化；或者可通過涉及有木葡聚糖酶活性的多肽的活性測定檢測感興趣的DNA的表達。多肽SEQ ID NO2中氨基酸第29-250位的氨基酸序列被認為是成熟木葡聚糖酶，所述N-端序列從SEQ ID NO2的第29位開始。
本發(fā)明還提供了與SEQ ID NO2中第1-250位或第29-250位氨基酸的多肽及其種同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的木葡聚糖酶多肽。此處所用的術語“基本同源”表示多肽與SEQ ID NO2中第1-250位或第29-250位氨基酸或其直向同系物或共生同系物中所示序列序列同源性達70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，并且還更優(yōu)選至少90％。這些多肽將更優(yōu)選與SEQ ID NO2中第1-250位或第29-250位氨基酸或其直向同系物或共生同系物中所示序列的同源性達至少95％，或者最優(yōu)選98％或更多。
序列相同性百分率是用常規(guī)方法，通過本領域已知的計算機程序進行測定的，諸如GCG程序包(Wisconsin程序包程序指南Program Manualfor the Wisconsin Package)，版本10.0，遺傳學計算機組(GeneticsComputer Group)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，GAP與以下設置一起用于多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分為8并且GAP延伸罰分為2。
來自Malbranchea cinnamomea(SEQ ID NO2)的XYG1011-編碼的家族12木葡聚糖酶前體的推測氨基酸序列與7個真菌家族12酶的選擇顯示49.1-66.2％的序列相似性，和43.9-61.2％序列相同性。這些序列采用缺口產(chǎn)生罰分為8且缺口延伸罰分為2的GCG Wisconsin軟件包，第10.0版，遺傳學計算機組(Genetics Computer Group)(GCG)，Madison，Wisconsin的GAP程序進行對比
基本同源的蛋白質和多肽的特征在于具有一個或多個氨基酸的取代、缺失或插入。這些改變優(yōu)選為影響較小的改變，即保守氨基酸的取代(見表2)及其它不會嚴重影響蛋白質或多肽的折疊或活性的取代；小的缺失，通常是1-約30個氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基，長達約20-25個殘基的小連接肽，或便于純化的小延伸(親和標記)，如聚組氨酸序列段、蛋白A(Nilsson等，EMBOJ.41075，1985；Nilsson等，酶學方法(Methods Enzvmol.)1983，1991。通常參見，F(xiàn)ord等人，蛋白質的表達和純化(Protein Expressionand Purification)295-107，1991，在此引用作為參考。編碼親和標記的DNA可從產(chǎn)品供應商處購買到(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。
然而，即便上述優(yōu)選的變化是影響較小的改變，這些改變也可以是影響較大的變化如將長達300個氨基酸或更多的較長多肽作為氨基或羧基端延伸融合到具有木葡聚糖酶活性的本發(fā)明多肽上。表1保守氨基酸的取代堿性氨基酸 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性氨基酸 谷氨酸天冬氨酸極性氨基酸 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性氨基酸亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了這20種標準氨基酸之外，也可用非標準氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)取代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。也可用有限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”已在蛋白質合成后被修飾，和/或在它們的側鏈上有不同于標準氨基酸側鏈的化學結構。非天然氨基酸可以化學合成，或優(yōu)選地購買獲得，包括六氫吡啶羧酸、四氫噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。
本發(fā)明的木葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按照本領域已知步驟進行鑒定，如定位誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(Science)2441081-1085，1989)。在后一技術中，在分子中的每個殘基位置處引入單個丙氨酸突變，并檢測所產(chǎn)生的突變分子的生物活性(即木葡聚糖酶活性)以鑒定對分子活性起關鍵作用的氨基酸殘基。也可參閱，Hilton等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2714699-4708，1996。酶的活性位點或其它生物學相互作用也可通過對用諸如核磁共振、結晶學、電子衍射或光親和標記之類技術測定的結構的物理分析連同假定接觸位點氨基酸的突變進行測定。參閱，例如，de Vos等人，科學(Science)255306-312，1992；Smith等人，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等人，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。必需氨基酸的位置也可從與涉及本發(fā)明多肽的多肽的同源性分析中推斷。
可用已知的誘變、重組和/或重排方法及隨后的相關篩選步驟進行多個氨基酸取代和檢測，這些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科學(Science)24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美國國立科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)862152-2156，1989)、WO 95/17413或WO 95/22625所公開的技術。簡要地說，這些作者公開了用于使多肽中兩個或多個位置同時隨機化，或進行不同突變的重組/改組(WO95/17413、WO 95/22625)，隨后從功能上選擇多肽，然后將誘變多肽測序以測定每個位置可允許取代的范圍的方法。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學(Biochem.)3010832-10837，1991；Ladner等，美國專利US 5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和定位誘變(Derbyshire等，基因(Gene)46145，1986；Ner等，DNA7127，1988)。
上面公開的誘變/改組方法可與大容量、自動篩選方法結合，以檢測宿主細胞中克隆的誘變多肽的活性。編碼活性多肽的誘變DNA分子可從宿主細胞中回收，并用現(xiàn)代設備迅速測序。這些方法可快速測定感興趣的多肽中各個氨基酸殘基的重要性，并可用于未知結構的多肽。
利用上述方法，本領域普通技術人員能鑒定和/或制備與本發(fā)明畸枝霉屬木葡聚糖酶的氨基酸序列基本同源并保留野生型蛋白質的木葡聚糖酶活性的各種多肽。
除含催化結構域的酶核心之外，本發(fā)明的木葡聚糖酶還可以包含纖維素結合結構域(CBD)，該酶的纖維素結合結構域和酶核心(催化活性結構域)可操作連接。纖維素結合結構域(CBD)可作為所編碼之酶的內在部分存在，或者可將另一來源的CBD引入木葡聚糖酶中，從而產(chǎn)生酶雜合體。在本文中，術語“纖維素結合結構域”應按Peter Tomme等人的″可溶性碳水化合物的酶降解(Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates)″中的″纖維素-結合結構域分類和性質(Cellulose-Binding DomainsClassification and Properties)″，John N.Saddler和Michael H.Penner(編輯)，ACS專題論叢(ACSSymposium Series)，No.618，1996的定義理解。這一定義將120種以上的纖維素結合結構域歸為10個家族(I-X)，并證實在諸如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和殼多糖酶之類的多種酶中有CBD。在藻類如紅藻Porphyra purpurea中也已找到了作為非水解性多糖結合蛋白質的CBD，參閱Tomme等人，出處同前。然而，大部分CBD是來自纖維素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白質的N和C末端或在其內部。參閱如WO 90/00609和WO 95/16782，本領域已知有酶雜合體的形式，通過將含有纖維素結合結構域的的編碼DNA至少一個片段、及通過或不通過連接子與之相連的木葡聚糖酶編碼DNA序列的DNA構建體轉化到宿主細胞中，并培養(yǎng)此宿主細胞以表達融合基因，可制備酶雜合體。酶雜合體可用以下公式描述CBD-MR-X其中CBD是相應于至少為纖維素結合結構域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)域；MR是中間區(qū)域(連接子)，可以是一個鍵，或一個短的連接基團，優(yōu)選約2-約100個碳原子長的，更優(yōu)選2-40個碳原子長的；或者優(yōu)選約2-約100氨基酸長的，更優(yōu)選2-40個氨基酸長的；而X是本發(fā)明多核苷酸分子所編碼多肽的N-末端或C-末端區(qū)域。木葡聚糖底物除了上述關于木葡聚糖的說明之外，還應提到來自Megazyme，愛爾蘭提供的羅望子樹種子的木葡聚糖具有復雜的分支結構，含比率為45∶36∶16∶3的葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖。因此，可以肯定地認為對這一木葡聚糖顯示催化活性的酶對不同來源(被子植物或裸子植物)的其它木葡聚糖結構也有催化活性。洗滌工業(yè)中的用途在洗滌和穿著過程中，染色織物或服裝上的染料通常會從織物上溢出，這使得織物看起來比較陳舊和褪色。除去織物表面上的纖維可部分恢復織物的原色和外觀。本文所用的術語“顏色澄清”是指通過多次洗滌循環(huán)而部分恢復織物或服裝的原色。
術語“去小球”是指除去織物表面上的小球。
術語“浸泡液”是指可在進行常規(guī)洗滌過程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗滌或洗衣過程中常規(guī)使用的一種或多種成分。
術語“洗滌液”是指在其中洗滌衣物的水溶液，即，這種衣物洗滌通常是手工進行或在洗衣機中進行的化學和機械的混合作用。洗滌液通常是粉狀或液態(tài)洗滌劑組合物的水溶液。
術語“漂洗液”是指習慣上在衣物洗滌之后立即泡入或在其中處理以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗滌劑溶液)的水溶液。漂洗液中可含有織物調理或軟化組合物。
可用本發(fā)明方法處理的衣物可以是常規(guī)的可洗滌的衣物。優(yōu)選衣物的主要部分是由棉花、棉混紡紗或者天然或人工纖維素(如來源于含木聚糖的纖維素纖維，如來自紙漿)或其混合物制成的已縫制或未縫制的織物，包括針織物、機織物、粗斜紋布、紗線和毛巾布。混合物的例子是棉或人造絲/粘膠絲與一種或多種配對材料的混合物，所述配對材料例如是羊毛、合成纖維(如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚偏二氯乙烯纖維、聚氨酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)，和含纖維素的纖維(如人造絲/粘膠絲、苧麻、大麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、lyocell)。洗滌劑的公開內容和實施例表面活性劑體系本發(fā)明的洗滌劑組合物中含有表面活性劑體系，其中表面活性劑可以選自非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑和/或半極性表面活性劑。
表面活性劑一般以0.1％-60％(重量)的量存在。
優(yōu)選將表面活性劑配制成與組合物中存在的酶組分相容。在液體或凝膠組合物中，最優(yōu)選以這樣的方式配制表面活性劑，致使它促進或至少是不降低這些組合物中的任何酶的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選體系包括本文中所述的作為表面活性劑的一種或多種非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑，聚氧乙烯縮合物是優(yōu)選的。這些化合物包括具有含約6-約14個碳原子，優(yōu)選約8-約14個碳原子直鏈或支鏈構型之烷基的烷基酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方案中，環(huán)氧乙烷存在的量等于每摩爾烷基酚約2-約25摩爾，更優(yōu)選約3-約15摩爾。這類市售的非離子表面活性劑包括由GAF Corporation銷售的IgepalTMCO-630；和均由Rohm & Haas Company銷售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑通常被稱之為烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈的、伯或仲的，并且通常含有約8-約22個碳原子。優(yōu)選的是具有含約8-約20個碳原子，更優(yōu)選約10-約18個碳原子烷基的醇與每摩爾醇約2-約10摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。所述的縮合產(chǎn)物中每摩爾醇有約2-約7摩爾的環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選2-5摩爾的環(huán)氧乙烷?？蓮氖袌錾腺彽玫倪@類非離子表面活性劑的例子包括由Union Carbide Corporation銷售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)和TergitolTM24-L-6 NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)；和由Shell Chemical Company銷售的NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；由Procter & Gamble Company銷售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；和由Hoechst銷售的GenapolLA050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物的HLB的優(yōu)選范圍是8-11，最優(yōu)選8-10。
也可用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是在US4,565,647中公開的烷基多糖，具有含約6-約30，優(yōu)選約10-約16個碳原子的疏水基團，和含約1.3-約10，優(yōu)選約1.3-約3，最優(yōu)選約1.3-約2.7糖單元的親水基團的多糖，如多糖苷?？梢允褂萌魏魏?或6個碳原子的還原糖，如葡萄糖、半乳糖并且可以將半乳糖基部分用葡萄糖基部分代替(任選地，在2-、3-、4-等位連接疏水基團從而得到對應于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。該糖間鍵可以在，例如附加糖單元的1位和前一糖單元的2-、3-、4-，和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基多糖苷具有下式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基、及其混合物，其中烷基含有約10-約18，優(yōu)選約12-約14個碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0-約10，優(yōu)選0；x是約1.3-約10，優(yōu)選約1.3-約3，最優(yōu)選約1.3-約2.7。該糖基優(yōu)選是從葡萄糖衍生的。為了制備這些化合物，先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應，從而形成葡糖苷(在1-位連接)。然后另外的糖基單元在其1-位置與前面的糖基單元2-、3-、4-，和/或6-位置，優(yōu)選主要在2-位之間連接。
環(huán)氧乙烷與通過環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的疏水基之間的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的附加非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分的分子量優(yōu)選為約1500-約1800并顯示出水不溶性。將聚氧乙烯部分加成到該疏水部分會增加整個分子的水溶性，在聚氧乙烯含量為該縮合產(chǎn)物總重量的約50％(相當于與多達約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合)時，仍能保持該產(chǎn)品的液體性質。這類化合物的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的PluronicTM表面活性劑。
也適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與從環(huán)氧丙烷和乙二胺反應得到的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應產(chǎn)物組成，并且分子量一般是約2500-約3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合，縮合程度為該縮合產(chǎn)物含有約40％-約80％重量的聚氧乙烯并且分子量為約5,000-約11,000。這類非離子表面活性劑的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的TetronicTM化合物。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖、及其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧基化物、和其混合物。
非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑 其中R1是H、或R1是C1-4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基或其混合物，R2是C5-31烴基，Z是具有直鏈烴基、至少3個羥基直接連接到該鏈上的多羥基烴基，或其烷氧基化的衍生物。優(yōu)選地，R1是甲基，R2是直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈，例如椰油烷基、或其混合物，Z是在還原性胺化反應中從還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖衍生的。
非常優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽表面活性劑。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基。更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，一般為約0.5-約6，更優(yōu)選約0.5-約3，并且M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代銨陽離子。本文也涵蓋烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。舉例說明的表面活性劑是C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸鹽(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸鹽(C12-C18E(2.25)M)、和C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸鹽(C12-C18E(3.0)M)、和C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸鹽(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地選自鈉和鉀。
適用的陰離子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society″，52(1975)，pp.323-329”用氣態(tài)SO3磺化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯。合適的原料包括從牛脂、棕櫚油等衍生的天然脂類物質。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑(尤其是用于洗衣用途的)包括下面結構式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑 其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，M是與烷基酯磺酸鹽形成水溶性鹽的陽離子。合適的成鹽陽離子包括金屬陽離子(如鈉、鉀和鋰)和取代或未取代的銨陽離子(例如單乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。優(yōu)選地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或異丙基。特別優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3是C10-C16烷基。
其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，它們是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24烴基，優(yōu)選具有C10-C20烷基部分的烷基或烴基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或烴基烷基，M是H或陽離子，例如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰)、或銨或取代銨(例如甲基、二甲基和三甲基銨陽離子，和季銨陽離子例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和從烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合物衍生的季銨陽離子，等等)。一般地，對于較低的洗滌溫度(例如低于約50℃)，C12-C16烷基鏈是優(yōu)選的，而對于較高的洗滌溫度(例如高于約50℃)，C16-C18烷基鏈是優(yōu)選的。
其它對洗滌目的有用的陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。它們可以包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸(例如，如在英國專利GB1,082,179說明書中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚硫酸鹽(含有多達10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂肪酰基甘油磺酸鹽、脂肪油基甘油硫酸鹽、烷基酚氧乙烯醚硫酸鹽、石蠟烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽如?；u乙磺酸鹽、N-?；；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸的單酯(特別是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸的二酯(特別是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽如烷基多葡糖苷(下面所述的非離子型非硫酸化的化合物)的硫酸鹽、支鏈伯烷基硫酸鹽、和烷基多乙氧基羧酸鹽例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的鹽，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整數(shù)，并且M是形成水溶性鹽的陽離子。樹脂酸及氫化的樹脂酸也是合適的，例如松香酸、氫化松香酸，以及存在于或衍生于松漿油的樹脂酸和氫化樹脂酸。
烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中該烷基優(yōu)選含有10-18個碳原子。
其它例子描述于“表面活性劑和洗滌劑(Surface Active Agents andDetergents)”(Vol.I和II，Schwartz、Perrry和Berch)中。各種這樣的表面活性劑也一般性地公開在US3,929,678中(第23欄58行-第29欄23行，該文獻引入本文作為參考)。
當包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約1％-約40％，優(yōu)選約3％-約20％(重量)的上述陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物也可以含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性表面活性劑，以及上文中未敘及的非離子和/或陰離子表面活性劑。
適用于本發(fā)明洗衣洗滌劑組合物中的陽離子洗滌表面活性劑是具有一個長鏈烴基的那些表面活性劑。這樣的陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑例如烷基三甲基銨鹵化物，和具有下式的那些表面活性劑[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X其中R2是在烷基鏈中具有約8-約18個碳原子的烷基或烷基芐基，每個R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-、和其混合物；每個R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、由兩個R4基團連接在一起形成的芐基環(huán)結構、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于約1000的己糖聚合物，并且當y不是0時是氫)；R5與R4所述相同或是烷基鏈，其中R2+R5的總碳原子數(shù)不大于約18；每個y是0-約10，且該y值的和是0至約15；X是任何相容的陰離子。
非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是具有下式的、在本發(fā)明組合物中有用的水溶性季銨鹽化合物R1R2R3R4N+X-(i)其中R1是C8-C16烷基，每個R2、R3和R4各自獨立地是C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)xH(其中x的值是2-5)，X是陰離子。R2、R3或R4中不多于1個是芐基。
R1的優(yōu)選烷基鏈長度是C12-C15，當該烷基是從椰油或棕櫚仁脂衍生的鏈長度的混合物，或是通過烯烴合成或OXO醇合成而合成衍生的時，尤為如此。
用于R2、R3和R4的優(yōu)選基團是甲基和羥基乙基，陰離子X可以選自鹵素離子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根離子。
用于本文中的合適的式(I)季銨化合物的例子是氯化或溴化椰油基三甲基銨；氯化或溴化椰油基二羥基乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化C12-15二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化椰油基二甲基羥基乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐基銨；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4銨；膽堿酯(式(i)的化合物，其中R1是 烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的陽離子表面活性劑也描述于US4,228,044和EP000 224中。
當包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約0.2％-約25％，優(yōu)選約1％-約8％重量的上述陽離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團可以是直鏈或支鏈的。其中1個脂族取代基含有至少約8個碳原子，一般約8-約18個碳原子，并且至少一個脂族取代基含有陰離子型水增溶性基團，例如羧基、磺酸根、硫酸根。見US3,929,678(第19欄18-35行)的兩性表面活性劑的例子。
當包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有0.2％-約15％，優(yōu)選約1％-約10％重量的上述兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適用于洗衣洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的脂族衍生物，雜環(huán)仲或叔胺的脂族衍生物，或者季銨、季鏻或叔锍化合物的衍生物。參見US 3,929,678(第19欄38行-22欄48行)的兩性離子表面活性劑的例子。
當包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有0.2％-約15％，優(yōu)選約1％-約10％重量的上述兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑是一特殊類型的非離子表面活性劑，它們包括含有1個約10-約18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基和羥基烷基的2個部分的水溶性氧化胺；含有1個約10-約18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的2個部分的水溶性氧化膦；和含有1個約10-約18個碳原子的烷基部分和1個選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的部分的水溶性亞砜。
半極性非離子表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑 其中R3是含有約8-約22個碳原子的烷基、羥基烷基、或烷基苯基，或其混合物；R4是含有約2-約3個碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合物；x是0-約3；并且每個R5是含有約1-約3個碳原子的烷基或羥基烷基，或含有約1-約3個氧乙烯基團的多氧乙烯基。R5基團可以彼此連接，例如通過氧或氮原子，從而形成環(huán)結構。
特別地，這些氧化胺表面活性劑包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和氧化C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺。
當包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有0.2％-約15％，優(yōu)選約1％-約10％重量的上述半極性非離子表面活性劑。
助洗劑體系本發(fā)明的組合物還可以含有助洗劑體系。任何常規(guī)助洗劑體系都適用于本文中，其包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸鹽，特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。盡管由于明顯的環(huán)境原因并不優(yōu)選，但本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無機離子交換材料，通常是無機水合硅鋁酸鹽材料，更具體地說是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
另一種合適的無機助洗劑材料是層狀硅酸鹽，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結晶層狀硅酸鹽。
合適的含有1個羧基的多羧酸鹽包括乳酸、乙醇酸和其醚衍生物，如在比利時專利831,368、821,369和821,370中所公開的。含有2個羧基的多羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及在德國專利2,446,686和2,446,487以及US 3,935,257中所述的醚羧酸鹽，和在比利時專利840,623中所述的亞硫酰基羧酸鹽。含有3個羧基的多羧酸鹽具體地包括水溶性檸檬酸鹽、烏頭酸鹽(aconitrate)和檸康酸鹽以及琥珀酸鹽衍生物，例如，在英國專利GB 1,379,241中所述的羧基甲氧基琥珀酸鹽，在荷蘭申請7205873中所述的乳羥琥珀酸鹽(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸鹽材料例如在英國專利1,387,447中所述的2-氧雜-1，1，3-丙三羧酸鹽。
含有4個羧基的多羧酸鹽包括在英國專利1,261,829中公開的氧聯(lián)二琥珀酸鹽、含有磺基取代基的1，1，2，2-乙四羧酸鹽、1，1，3，3-丙四羧酸鹽包括在英國專利1,398,421和1,398,422以及US3,936,448中公開的磺基琥珀酸鹽衍生物、和在英國專利1,082,179中所述的磺化的熱解檸檬酸鹽，而英國專利1,439,000中公開了含有膦基取代基的多羧酸鹽。
脂環(huán)和雜環(huán)多羧酸鹽包括烷戊烷-順，順-順-四羧酸鹽、環(huán)戊二烯戊羧酸鹽(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氫-呋喃-順，順，順-四羧酸鹽、2，5-四氫-呋喃-順，二羧酸鹽、2，2，5，5-四氫呋喃-四羧酸鹽、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸鹽和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸鹽包括苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和在英國專利1,425,343中公開的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸鹽中，優(yōu)選的多羧酸鹽是每分子含有最多達3個羧基的羥基羧酸鹽，更具體地是檸檬酸鹽。
用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A或層狀硅酸鹽(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸鹽螯合劑如檸檬酸。
包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的合適的螯合劑包括乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨鹽，或其混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式的和其鈉或鎂鹽。這樣的優(yōu)選EDDS鈉鹽的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。這樣的優(yōu)選EDDS鎂鹽的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽是最優(yōu)選包括在本發(fā)明組合物中的。
優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A和水溶性羧酸鹽螯合劑如檸檬酸的混合物。
可以形成用于粒狀組合物的助洗劑體系中一部分的其它助洗劑材料包括無機材料例如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機材料如有機膦酸鹽、氨基多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽。
其它合適的水溶性有機鹽是均聚和共聚的酸或其鹽，其中該聚羧酸包括兩兩之間被不多于2個碳原子分開的至少兩個羧基。
這類聚合物公開于GB-A-1,596,756中。這樣的鹽的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸鹽和其與馬來酸酐的共聚物，這樣的共聚物具有20,000-70,000，特別是約40,000的分子量。
洗滌助洗劑鹽的含量通常為組合物重量的5％-80％。用于液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選含量是5％-30％。酶除了本發(fā)明的酶制劑外，優(yōu)選洗滌劑組合物還含有提供清洗性能和/或織物護理益處的其它酶。
這樣的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶可以使用任何適用于堿性溶液的蛋白酶。合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學或基因改性突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是從芽孢桿菌衍生的那些酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于WO 89/06270中的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的市售蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase銷售的那些酶，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP銷售的那些酶，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase銷售的那些酶。按組合物重量計，可以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將蛋白酶摻入到本發(fā)明的組合物中。
脂肪酶可以使用任何適用于堿性溶液的脂肪酶。合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些酶。包括化學或基因工程改性的突變體。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP 258 068和EP 305 216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP 238 023中的，假絲酵母屬脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP 214 761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假單胞菌屬脂肪酶例如描述于EP 218 272中的產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331 376中的洋蔥假單胞菌脂肪酶、例如公開于GB1,372,034中的司徒茨氏假單胞菌脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶、芽孢桿菌脂肪酶例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica etBiophysica acta 1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO 91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等(1991)在“基因(Gene)”103，61-67中描述的沙門氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化學雜志(J.Biochem.)，106，383-388)，和各種根霉屬脂肪酶例如德列馬根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，基因(Gene)，109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科學、生物技術、生物化學(Biosci.Biotech.Biochem.)，56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它類型的脂類分解酶，如角質酶也是有用的，例如WO 88/09367中所述來自門多薩假單胞菌的角質酶，來自Fusarium solani pisi的角質酶(如WO 90/09446所述)。
特別合適的脂肪酶是下面這些脂肪酶例如M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)、LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)，和Lipase P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
按組合物重量計，一般以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將脂肪酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
淀粉酶可以使用適用于堿性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合適的淀粉酶包括細菌和真菌來源的那些酶。包括化學或基因工程改性的突變體。淀粉酶包括例如，在GB1,296,839中詳細描述的從地衣芽孢桿菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(從Novo Nordisk A/S得到)和RapidaseTM和MaxamylPTM(從Genencor得到)。
按組合物重量計，一般以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將淀粉酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
纖維素酶可以使用適用于堿性溶液的任何纖維素酶。合適的纖維素酶包括細菌和真菌來源的那些酶。包括化學或基因工程改性的突變體。合適的纖維素酶公開于US4,435,307(其中公開了從Humicola insolens生產(chǎn)的真菌纖維素酶)，WO 96/34108和WO 96/34092(其中公開了來自芽孢桿菌的細菌嗜堿性纖維素酶(BCE103))，WO 94/21801、US 5,475,101和US 5,419,778(其中公開了木霉的EG III纖維素酶)中。特別合適的纖維素酶是具有顏色護理益處的纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于歐洲專利申請0 495 257中的纖維素酶。市售的纖維素酶包括從一株Humicola insolens生產(chǎn)的CelluzymeTM和CarezymeTM(Novo NordiskA/S)、KAC-500(B)TM(Kao Corporation)，以及PuradaxTM(GenencorInternational)。
按組合物重量計，一般以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將纖維素酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)一起使用。氧化酶與氧一起使用。兩種類型的酶均用于“溶液漂白”，即在洗滌液中一起洗滌，優(yōu)選與例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增強劑一起洗滌所述織物時，防止紡織品染料從染色織物轉移到另一織物上。合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些酶。包括化學或基因工程改性的突變體。
按組合物重量計，一般以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將過氧化物酶和/或氧化酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶的混合物。
按組合物重量計，一般以0.00001％-2％，優(yōu)選0.0001％-1％，更優(yōu)選0.001％-0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％酶蛋白的量將本發(fā)明的酶或摻入到洗滌劑組合物中其它任何酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。漂白劑可以包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的附加的任選洗滌劑組分包括漂白劑，例如粒徑為400-800微米的PBl、PB4和過碳酸鹽。這些漂白劑組分可以包括一種或多種氧漂白劑，并且根據(jù)所選的漂白劑，可包括一種或多種漂白活化劑。當存在氧時，漂白化合物其存在量一般是約1％-約25％。通常，在非液體配方例如粒狀洗滌劑中，漂白化合物是任選加入的組分。
用于本文中的漂白劑組分可以是任何在洗滌劑組合物中有用的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領域已知的其它漂白劑。
適合于本發(fā)明的漂白劑可以是活化的或未活化的漂白劑。
一類可以使用的氧漂白劑包括過羧酸漂白劑及其鹽。這類試劑的合適的例子包括單過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物、間氯過苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和雙過氧十二烷雙酸的鎂鹽。主要的漂白劑公開于US4,483,781、US 740,446、EP 0 133 354和US 4,412,934中。非常優(yōu)選的漂白劑也包括如在US4,634,551所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
另一類可以使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。例如，次鹵酸鹽漂白劑的例子包括三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，和N-氯代和N-溴代烷烴磺胺。這樣的材料通常以最終產(chǎn)品重量的0.5-10％、優(yōu)選1-5％的量加入。
可以將過氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙?；叶?TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS，描述于US4,412,934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸鹽(ISONOBS，描述于EP 120591中)或五乙?；咸烟?PAG)；將它們過水解后能形成過氧酸作為活性漂白物質，導致改進的漂白作用。另外，非常合適的是這些漂白活化劑C8(6-辛酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽、C9(6-壬酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽和C10(6-癸酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽或其混合物。還合適的活化劑是酰化的檸檬酸酯，例如在歐洲專利申請91870207.7所公開的。
可用于本發(fā)明清洗組合物中的有用的漂白劑，包括過氧酸和含有漂白活化劑和過氧漂白化合物的漂白體系描述于專利申請USSN08/136,626中。
通過在洗滌和/或漂洗過程的開始或期間加入能夠生成過氧化氫的酶體系(即酶及其底物)，也可以產(chǎn)生過氧化氫。這樣的酶體系公開于歐洲專利申請EP 0 537 381中。
除了氧漂白劑以外的漂白劑也是本領域已知的，并且可以在本文中使用。特別感興趣的一類非氧漂白劑包括光活化漂白劑，例如磺化的鋅和/或鋁酞菁。這些材料可以在洗滌期間沉積在被洗物上。當存在氧時用光照射，例如通過將衣服掛出在日光中干燥時，該磺化的鋅酞菁被活化，結果該被洗物被漂白。優(yōu)選的鋅酞菁和光活化漂白方法描述于US4,033,718中。洗滌劑組合物一般含有約0.025％-約1.25％重量的磺化鋅酞菁。
漂白劑也可以包括錳催化劑。錳催化劑可以是例如在″有效用于低溫漂白的錳催化劑(Efficient manganese catalysts for low-temperaturebleaching)″，自然(Nature)369,1994，pp.637-639中所述的一種化合物。抑泡劑另一任選的組分是抑泡劑，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通?？梢杂猛榛酃柩跬椴牧蟻肀硎荆枋话阋约毞稚⑿问绞褂?，例如二氧化硅氣凝膠和干凝膠和各種類型的疏水二氧化硅。這些材料可以作為顆粒加入，其中抑泡劑有利地是可釋放地摻入到水溶性或水分散性的、基本上無表面活性的洗滌劑不可滲透的載體中。另外，可以將抑泡劑溶解或分散在液體載體中并通過噴霧在一種或多種其它組分上來使用。
優(yōu)選的硅氧烷抑泡劑公開于US3,933,672中。其它特別有用的抑泡劑是德國專利申請DTOS2,646,126中所述的自乳化硅氧烷抑泡劑。這樣的化合物的例子是可從Dow Corning購得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特別優(yōu)選的泡沫控制劑是含有硅油和2-烷基-鏈烷醇混合物的抑泡劑體系。合適的2-烷基-鏈烷醇是以商品名Isofol 12R購得的2-丁基-辛醇。
這樣的抑泡劑體系公開于歐洲專利申請EP 0 593 841中。
特別優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑描述于歐洲專利申請92201649.8中。所述的組合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的無孔硅石例如AerosilR。
按組合物重量計，通常以0.001％-2％，優(yōu)選0.01％-1％的量使用上述抑泡劑。其它組分可以在洗滌劑組合物中使用的其它組分有例如污垢懸浮劑、污垢除去劑、熒光漂白劑、磨料、殺菌劑、變色抑制劑、著色劑和/或包封或未包封的香料。
特別合適的包封材料是由多糖基質和多羥基化合物組成的水溶性膠囊，如GB1,464,616中所述的。
其它合適的水溶性包封材料包括從取代的二羧酸的未凝膠化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3,455,838中所述的。這些酸酯糊精優(yōu)選是從諸如糯性玉米、糯性高粱、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉制備的。所述的包封材料的合適例子包括由National Starch制造的N-Lok。該N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖組成。該淀粉是通過加上單官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
適合于本文中的防再沉淀劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，和均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這類聚合物包括上述作為助洗劑提到的聚丙烯酸鹽和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中馬來酸酐至少構成共聚物的20％摩爾。按組合物重量計，這些材料通常以組合物重量的0.5％-10％，更優(yōu)選0.75％-8％，最優(yōu)選1％-6％的量使用。
優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子性的，其例子是4，4’-雙-(2-雙乙醇氨基-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-22’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基-二苯乙烯-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2，4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-22’-二磺酸二鈉、4’，4”-雙-(2，4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸一鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉、2(二苯乙烯基-4”-(萘并-1’，2’4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸鈉和4，4’-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯鈉。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特別是分子量為1000-10000，更具體是2000-8000和最優(yōu)選是約4000的那些聚乙二醇。以0.20％-5％重量，更優(yōu)選0.25％-2.5％重量的量使用這些聚合物材料。這些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸鹽對于存在過渡金屬雜質時改進白度維持性、織物灰分沉積和對粘土、蛋白質性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。
在本發(fā)明組合物中有用的污垢除去劑是對苯二甲酸與乙二醇和/或丙二醇單元以各種形式排列的常規(guī)共聚物或三元共聚物。這樣的聚合物的例子公開于US 4,116,885和4,711,730以及EP 0 272 033中。根據(jù)EP 0 272 033特別優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
還非常有用的是作為二甲基對苯二甲酸酯、二甲基磺基間苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇無規(guī)共聚物的改性聚酯，該端基主要由磺基苯甲酸酯組成，還有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯。目的是“主要”得到在兩端由磺基苯甲酸基團封端的聚合物，本文中大多數(shù)的所述共聚物是由磺基苯甲酸基團封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯組成，其“次要”由這種物質組成。
本文中選擇的聚酯含有約46％重量的二甲基對苯二甲酸，約16％重量的1，2-丙二醇、約10％重量的乙二醇，約13％重量的二甲基磺基苯甲酸和約15％重量的磺基間苯二酸，并且其分子量為約3000。該聚酯和其制備方法詳述于EP 311 342中。柔軟劑可以將織物柔軟劑加入到本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些試劑在類型上可以是無機或有機的。無機柔軟劑的例子是在GB-A-1400898和US5,019,292中公開的綠土粘土。有機的織物柔軟劑包括如在GB-A-1514276和EP0011340中公開的水不溶性叔胺，其與單C12-C14季銨鹽的混合物(公開于EP-B-0026528中)，和如在EP0242919中所公開的二長鏈酰胺。織物柔軟劑體系的其它有用的有機組分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP0299575和0313146中所公開的。
綠土粘土的含量一般在5％-15％重量的范圍，更優(yōu)選8％-12％重量，作為干混合組分材料加入到配方的其余部分中。以0.5％-5％重量，一般以1％-3％重量的量加入有機織物柔軟劑，例如水不溶性叔胺或二長鏈酰胺材料，而以0.1％-2％重量，一般以0.15％-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性陽離子材料。盡管在某些情況下作為干混顆粒加入它們可能更方便，但是一般將這些材料加到該組合物的噴霧干燥組分上，或者作為熔融液體將它們噴霧到組合物的其它固體組分上。聚合染料轉移抑制劑本發(fā)明的洗滌劑組合物還包括0.001％-10％，優(yōu)選0.01％-2％，更優(yōu)選0.05％-1％重量的聚合染料轉移抑制劑。一般將所述的聚合染料轉移抑制劑加入到洗滌劑組合物中以便抑制染料從有色織物轉移到與其一起洗滌的織物上。在染料于洗滌中附著到其它物品上之前，這些聚合物會絡合或吸附從染色織物洗滌下來的褪色染料。
特別合適的聚合染料轉移抑制劑是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入這樣的聚合物也增強了本發(fā)明酶的性能。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式。
可以按例如US4,106,991和4,661,452(兩者均是Novo IndustriA/S的專利)中所公開的方法生產(chǎn)無塵的顆粒，并且該顆粒可以任選地用本領域已知的方法涂層。蠟質涂層材料的例子是平均分子量為1000-20000的聚(氧乙烯)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中該醇含有12-20個碳原子并且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-和三-甘油酯。在GB1483591中給出了適合于流化床技術涂敷的成膜涂層材料的例子。
本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“致密形式”的，即它們具有比常規(guī)的粒狀洗滌劑相對高的密度，即550-950g/l；在這種情況下，本發(fā)明的粒狀洗滌劑組合物將含有比常規(guī)顆粒洗滌劑更少量的“無機填料鹽”；一般的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，一般是硫酸鈉；“致密”的洗滌劑一般包括不多于10％的填料鹽。本發(fā)明的液體組合物也可以是“濃縮形式”的，在這種情況下，本發(fā)明的液體洗滌劑組合物將比常規(guī)的液體洗滌劑含有較低量的水。按組合物重量計，濃縮的液體洗滌劑的水含量一般低于30％，更優(yōu)選低于20％，最優(yōu)選低于10％。
例如，可以將本發(fā)明的組合物配制為手洗或機洗洗衣洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于臟織物預處理的組合物，加入織物柔軟劑的漂洗組合物，和用于普通家庭硬表面清洗操作和洗碗碟操作的組合物。
下面的實例旨在舉例說明本發(fā)明的組合物，而不對本發(fā)明范圍作任何限制。
在洗滌劑組合物中，縮寫組分符號具有下面的意義LAS 直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS 牛脂烷基硫酸鈉XYAS C1X-C1Y烷基硫酸鈉SS 式2-丁基辛酸的仲皂表面活性劑25EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS 每摩爾與平均Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子 由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404銷售的、平均乙氧基化程度為3.8和平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽 無定形硅酸鈉(SiO2∶Na2O比＝2.0)NaSKS-6 式d-Na2Si2O5的結晶層狀硅酸鹽碳酸鹽 無水碳酸鈉磷酸鹽 三磷酸鈉MA/AA 1∶4的馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約80,000聚丙烯酸酯 BASF GmbH以商品名PA30銷售的平均分子量為約8,000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅鋁酸鈉，主要粒徑為1-10微米檸檬酸鹽 檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸 檸檬酸過硼酸鹽 無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗式為NaBO2.H2O2PB4 無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽 經(jīng)驗式為2Na2CO3.3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑TAED 四乙?；叶稢MC 羧甲基纖維素鈉DETPMP 由Monsanto以商品名Dequest2060銷售的二乙三胺五(亞甲基膦酸)PVP 聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 鈉鹽形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]異構體抑泡劑 25％熔點為50℃的石蠟，17％的疏水性二氧化硅，58％的石蠟油顆粒抑泡劑 顆粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬脂醇，70％的淀粉硫酸鹽 無水硫酸鈉HMWPEO 高分子量聚氧乙烯TAE 25 牛脂醇乙氧基化物(25)洗滌劑實施例I可以按如下所示制備本發(fā)明粒狀織物清洗組合物線性C12烷基苯磺酸鈉6.5硫酸鈉 15.0沸石A 26.0次氨基三醋酸鈉 5.0本發(fā)明的酶 0.1PVP 0.5TAED3.0硼酸4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要組分 至100洗滌劑實施例II可以按如下所示制備本發(fā)明的致密粒狀織物清洗組合物(密度800g/l)45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA2.5沸石A 17.0NaSKS-612.0檸檬酸 3.0碳酸鹽 7.0MA/AA 5.0CMC 0.4本發(fā)明的酶 0.1TAED6.0過碳酸鹽 22.0EDDS0.3粒狀抑泡劑 3.5水/次要組分 至100％洗滌劑實施例III按如下所示制備在洗滌彩色織物中特別有用的本發(fā)明粒狀織物清洗組合物LAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S - 3.068E111.8 -25E5 - 8.0檸檬酸鹽15.0 7.0碳酸鹽 -10檸檬酸 2.5 3.0沸石A 32.1 25.0NaSKS-6 - 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本發(fā)明的酶0.10 0.05硅酸鹽 2.5-硫酸鹽 5.2 3.0PVP0.5-聚(4-乙烯基吡 -0.2啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽 1.0 -苯酚磺酸鹽0.2 -水/次要組分 至100％洗滌劑實施例IV可以按照如下所示制備本發(fā)明具有“通過洗滌進行軟化”的能力的粒狀織物清洗組合物45AS - 10.0LAS 7.6-68AS1.3-45E74.0-25E3 - 5.0氯化椰油烷基二甲1.4 1.0基羥乙基銨檸檬酸鹽5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4過硼酸鹽15.0 -過碳酸鹽 -15.0TAED 5.0 5.0綠土粘土10.010.0HMWPEO - 0.1本發(fā)明的酶 0.100.05硅酸鹽 3.0 5.0碳酸鹽 10.010.0粒狀抑泡劑 1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要組分至100％洗滌劑實施例V可以按照如下制備本發(fā)明的重垢液體織物清洗組合物I II酸形式的LAS - 25.0檸檬酸 5.0 2.0酸形式的25AS8.0 -酸形式的25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸- 1.0乙醇4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本發(fā)明的酶 0.10 0.05氯化椰油烷基二甲- 3.0基羥乙基銨綠土粘土 - 5.0PVP 2.0 -水/次要組分 至100％在紡織業(yè)和纖維素纖維加工業(yè)中的用途本文中，術語“纖維素材料”意旨由棉花、棉混紡紗或者天然或人工纖維素(如來源于含木聚糖之纖維素纖維，如來自木漿)或其混合物制成的纖維、已縫制或未縫制的織物，包括針織物、機織物、粗斜紋布、紗線和毛巾布?；旌衔锏睦邮蔷d或人造絲/粘膠絲與一種或多種配對材料的混合物，所述配對材料例如是羊毛、合成纖維(如聚酰胺纖維，丙烯酸纖維、聚酯纖維，聚乙烯醇纖維，聚氯乙烯纖維，聚偏二氯乙烯纖維，聚氨酯纖維，聚脲纖維，芳族聚酰胺纖維)，和含纖維素的纖維(如人造絲/粘膠絲，苧麻，大麻，亞麻/亞麻布，黃麻，醋酸纖維素纖維，lyocell)。
本發(fā)明的制備可用于纖維素纖維加工業(yè)中，以預處理或浸解處理大麻、亞麻或亞麻布的纖維。
紡織業(yè)中，將纖維素材料例如棉纖維處理成適于制衣的材料的方法包括幾個步驟將纖維紡成紗線，將紗線編織成機織織物或針織織物以及后續(xù)的準備、染色和整理操作。機織織物是通過在一系列經(jīng)線之間編織緯線來構造的；紗線可以是兩種不同的類型。針織織物是由一根連續(xù)長的紗線形成連鎖線圈網(wǎng)而構造的。纖維素纖維也可用于非機織織物。
準備工序使紡織品在染色操作中能夠產(chǎn)生合適的反應。準備工序中的各小步驟包括脫漿(對于機織產(chǎn)品)、精煉和漂白。工業(yè)上也采用精煉/漂白合并的一步加工法。盡管準備工序通常是在織物水平進行的；然而，也可以在纖維或紗線階段進行精煉、漂白和染色操作。
對于平幅或繩狀的形式，處理過程可以通過處理液流間歇或連續(xù)地同織物接觸。連續(xù)操作通常使用飽和器，在這里，以每份重量的織物大約等量的化學品，將化學品施加到織物上，接著是通過發(fā)生化學反應的加熱了的停留室。然后洗滌區(qū)為織物在下面的處理步驟做準備。間歇操作通常在一個處理浴中進行，在這里織物與大約相當于其重量8-15倍的化學品浴進行接觸。經(jīng)過一段時間的反應后，排出化學品，水洗織物并施加下一種化學品。不連續(xù)的浸軋-堆放處理工序包括一個飽和器，在此處，以每份重量的織物大約等重量的化學品浴，對織物進行處理，接著停留一段時間，其中對于冷浸軋-堆放處理工序，該停留時間可以進行一天或多天。
機織產(chǎn)品是紡織織物結構的主要形式。機織過程需要對經(jīng)線“上漿”以使其免受摩擦。由于可靠性和成本，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纖維素、蠟和丙烯酸的粘合劑是使用的上漿化學物的典型實例。漿料必需在機織過程之后作為制備機織產(chǎn)品的第一步除掉。將上了漿的繩狀或平幅形式的織物同含有退漿劑的處理液體接觸。使用的退漿劑取決于要除掉的漿料的類型。對于PVA漿料，常常采用熱水或者氧化型處理方法。對棉織物最通用的上漿劑是基于淀粉的上漿劑。因此最經(jīng)常的是，機織棉織物通過熱水、水解淀粉的α-淀粉酶和潤濕劑或表面活性劑的混合物退漿。使纖維素材料在退漿化學品中保持足夠長的“持續(xù)階段”以完成退漿。持續(xù)階段取決于處理方案的類型和溫度，可以在15分鐘到2小時，或者有時候可達數(shù)日。通常，在飽和器浴中使用退漿化學物，該飽和器浴通常大約15℃-55℃。然后將織物放置在例如能提供足夠熱量、通常為大約55℃-約100℃的J型箱之類設備中，以提高退漿劑的活性。在持續(xù)階段結束之后，將化學品、包括除下來的漿料從織物上洗掉。
為了確保有高白度或良好的可濕性以及染色性，漿料化學物和使用的其它化學物必需完全去掉。通常認為，有效的退漿對于下面的準備工序-精煉和漂白是至關重要的。
精煉工序將棉中天然存在的大量非纖維素化合物去掉。除了天然的非纖維素雜質之外，精煉可以去掉污垢、污漬以及制備過程中引入的殘留物，例如紡絲、絡筒或漿紗潤滑劑。精煉工序使用氫氧化鈉或相關的苛性劑，例如碳酸鈉、氫氧化鉀或它們的混合物。通常，該工序中加入一種堿性穩(wěn)定的表面活性劑，以提高疏水性化合物的溶解性，和/或防止它們再沉積到織物上。該工序通常在80-100℃的高溫下，使用精煉劑的強堿性溶液例如pH13-14。由于化學品處理的非特異性性能，化學品不但處理雜質而且處理纖維素本身，導致織物強度或其它理想織物性能受到損害。纖維素織物的柔軟性是殘留的天然棉蠟的函數(shù)。高溫強堿性精煉方法的非特異性性能不能區(qū)別所需的天然棉潤滑劑和制備中加入的潤滑劑。并且，由于來自于這些方法的高堿性廢水，常規(guī)的精煉方法會產(chǎn)生環(huán)境問題。精煉階段為織物在漂白中能達到最佳響應做準備。不恰當?shù)鼐珶挼目椢飳⒃诤罄m(xù)的漂白階段中需要更高含量的漂白化學品。
漂白工序將天然棉色素脫色，并且去掉在軋花、梳棉或精煉中沒有完全去掉的任何殘留天然木質棉雜質組分。目前使用的主要方法是堿性過氧化氫漂白。許多情況下，尤其是不需要非常高的白度時，可以將漂白與精煉結合起來。
預計可以將本發(fā)明的木葡聚糖酶或者木葡聚糖酶制劑與其它一些酶活性結合起來，在大約50-80℃的溫度，大約pH7-11的環(huán)境中，進行精煉處理步驟，這樣可代替或者補充高苛化劑的作用。材料和方法菌株Malbranchea cinnamomea，CBS960.72Malbranchea cinnamomea，CBS343.55Malbranchea cinnamomea，UAMH2485這些菌株都是公眾從以下公認的培養(yǎng)物保藏中心可以獲得的菌株CBS-Centraalbureau voor SchimmelculturesOosterstraat 1Postbus 273NL-3740 AG Baarn荷蘭UAMH-
University of Alberta Microfungus Collection&
HerbariumDevonian Botanic GardenEdmonton，AB，加拿大T6G 2E1培養(yǎng)基YG酵母-葡萄糖瓊脂5.0g Difco粉末化酵母浸膏，10.0g葡萄糖，20.0g瓊脂，1000ml自來水。121℃下高壓滅菌15-20分鐘。
培養(yǎng)基A/瓶30g小麥麩皮，45ml的以下溶液4g酵母浸膏、1g KH2PO4、0.5g MgSO4.7H2O、15g葡萄糖，1000ml自來水。121℃下高壓滅菌30分鐘。
培養(yǎng)基B(50ml/瓶)30g大豆粉、15g麥芽糖、5g蛋白胨、1000ml H2O、1g橄欖油(2滴/瓶)。每500ml帶2擋板的錐形瓶中分裝50ml。121℃下高壓滅菌30分鐘。發(fā)酵步驟在45℃下在暗處將這些真菌菌株于YG瓊脂平皿(4.5cm直徑)上培養(yǎng)3天并用于接種搖瓶。將具有完全生長的培養(yǎng)物的這些平皿在4℃下貯藏直到使用。
為了產(chǎn)生酶，將帶有與上面平皿上的完全生長的真菌培養(yǎng)物的4-6塊瓊脂塊用于接種一具有培養(yǎng)基B的搖瓶并在45℃、160rpm下生長12-24小時，將其用于接種具有培養(yǎng)基A的搖瓶以獲得足夠的培養(yǎng)液。
將約1ml上面培養(yǎng)的培養(yǎng)液用于接種具有培養(yǎng)基A的每一燒瓶。這些接種的燒瓶在45℃和靜止條件下培養(yǎng)4天。酶活性測定和純化用的樣品制備向培養(yǎng)基A中具有麩皮和完全生長的培養(yǎng)物的每一燒瓶中加入150ml自來水并用無菌玻璃棒均質。通過將燒瓶在4℃下靜置2小時萃取酶萃取液。所述培養(yǎng)液然后在8000rpm和4℃下離心30分鐘并收集上清液，測定其纖維素酶、β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶活性。酶活性測定瓊脂糖平皿測定瓊脂糖平皿分別含有1％瓊脂糖的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液pH3、pH7和pH10，0.1％AZCL-木葡聚糖，0.1％AZCL-HE-纖維素和0.1％AZCL-β-葡聚糖(Megazyme，澳大利亞)；將20μl樣品加到瓊脂糖平皿中的d＝4mm的孔中，在45℃下培養(yǎng)12-16小時。通過藍孔環(huán)鑒定酶活性。微量滴定板試驗將0.2％該藍色底物AZCL-底物(AZCL-木葡聚糖、AZCL-HE-纖維素、AZCL-β-葡聚糖)的溶液通過攪拌懸浮于0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH3-6)或Borax/NaH2PO4緩沖液(pH7-9)或甘氨酸緩沖液(pH9-11)中。溶液在攪拌狀態(tài)下分裝至微量滴定板(每個孔中加80μl)，加入20μm酶樣品，并在Eppendorf Thermomixer中于50℃和800rpm下將它們培養(yǎng)1小時。將變性的酶樣品(100℃下沸騰20分鐘)用作空白。培養(yǎng)之后在4℃下通過3000rpm離心5分鐘將有色溶液從固體中分離出來。將60μl上清液轉移到微量滴定板中并在595nm下通過BioRad MicroplateReader測定其吸光度。Eppendorf管測定將0.2％該藍色底物AZCL-底物(AZCL-木葡聚糖、AZCL-HE-纖維素、AZCL-β-葡聚糖)的溶液通過攪拌懸浮于0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH3-6)或Borax/NaH2PO4緩沖液(pH7-9)或甘氨酸緩沖液(pH9-11)中。溶液在攪拌狀態(tài)下分裝至1.5ml Eppendorf管(每個中加900μl)，加入100μm酶樣品，并在水浴中于50℃下將它們溫育10-60分鐘。將變性的酶樣品(100℃下沸騰20分鐘)用作空白。培養(yǎng)之后在4℃下通過5000rpm離心10分鐘將有色溶液從固體中分離出來。將200μl上清液轉移到微量滴定板中并在595nm下通過BioRad Microplate Reader測定其吸光度。等電聚焦等電聚焦是按照制造商的說明書在pH3.5-9.5的預制安福靈(Ampholine)PAG板(Pharmacia，瑞典)中進行的。樣品使用三份，并在電泳之后將膠分成三半。將緩沖液pH9中含1％瓊脂糖和0.4％AZCL-木葡聚糖、或0.4％AZCL-HE-纖維素、或0.4％AZCL-β-1，4-葡聚糖的覆蓋層倒到每一塊膠上，在45℃下溫育12-16小時。通過藍色帶鑒定酶活性和酶蛋白質的pI。普通分子生物學方法除非另有說明，所有DNA操作和轉化都是使用分子生物學的標準方法完成的(Sambrook等人(1989)分子克隆(Molecular cloning)實驗室手冊(A laboratory manual)，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor lab.)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)″分子生物學的流行協(xié)議(Current protocols in Molecular Biology)″.JohnWiley和Sons，1995。按照制造商的說明書使用供DNA操作的酶(如限制性內切核酸酶、連接酶等可從New England Biolabs，Inc.獲得)。質粒pYES 2.0(Invitrogen，USA)pMT2188表達質粒pMT 2188的構建米曲霉表達質粒pCaHj 483(WO98/00529)由一表達盒組成，該盒基于黑曲霉中性淀粉酶II啟動子以及與該啟動子融合的構巢曲霉三糖磷酸酯異構酶未翻譯的前導序列(Pna2/tpi)和該黑曲霉淀粉糖苷酶終止子(Tamg)。在該質粒上還有來自能夠在乙酰胺作為唯一氮源上生長的構巢曲霉的曲霉屬選擇標記amdS。將這些元件克隆到大腸桿菌載體pUC19中。按照以下方式將在大腸桿菌中能夠選擇該質粒的氨芐青霉素抗性標記用能夠補充大腸桿菌中的pyrF突變的釀酒酵母的URA3標記替換該pUC19的復制起始點用以下引物從pCaHj483經(jīng)PCR擴增142779TTG AAT TGA AAA TAG ATT GAT TTA AAA CTT C142780TTG CAT GCG TAA TCA TGG TCA TAG C引物142780在PCR片段中引入了Bbu I位點。
按照制造商的說明書將膨脹PCR體系(Roche MolecularBiochemicals，Basel，Switserland)用于擴增，接著進行PCR擴增。
使用以下引物將URA3基因由常規(guī)啤酒糖酵母克隆載體pYES2(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca，USA)擴增140288TTG AAT TCA TGG GTA ATA ACT GAT AT142778AAA TCA ATC TAT TTT CAA TTC AAT TCA TCA TT引物140288在PCR片段中引入EcoRI位點。
通過將這兩個PCR片段混合并用引物142780和140288利用其剪接通過重疊法(Horton等人(1989)基因(Gene)，77，6168)擴增來將它們融合。
所得片段用EcoRI和BbuI消化并連接到用相同酶消化的pCaHj483的最大片段上。連接混合物用于轉化pyrF大腸桿菌菌株DB6507(ATCC35673)，該大腸桿菌菌株是通過Mandel和Higa的方法(Mandel，M.和A.Higa(1970)分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)45，154)使之感受態(tài)的。轉化體在補充有1g/l酪蛋氨基酸、500μg/l硫胺和10mg/l卡那霉素的固體M9培養(yǎng)基(Sambrook等人(1989)分子可隆(Molecular cloning)，實驗室手冊(a laboratory manual)，第二版，冷泉港實驗室出版社)上進行選擇。
來自這種轉化體的質粒被稱為pCaHj527。該質粒的構建描繪在圖xxx中。存在于pCaHj527上的Pna2/tpi啟動子通過一簡單的PCR方案經(jīng)受定點誘變。使用誘變引物141223將核苷酸134-144從GTACTAAAACC改變?yōu)镃CGTTAAATTT141223GGA TGC TGT TGA CTC CGG AAA TTT AAC GGT TTG GTC TTGCAT CCC使用誘變引物141222將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT改變?yōu)镃GGCAATTTAACGG141222GGT ATT GTC CTG CAG ACG GCA ATT TAA CGG CTT CTG CGAATC GC所得質粒被稱為pMT 2188。生長條件將Malbranchea cinnamomea菌株在500ml搖瓶中在含30g小麥麩皮和45ml以下溶液的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4g酵母浸膏、1gKH2PO4、0.5gMgSO4.7H2O、15g葡萄糖、1000ml自來水(12l℃下高壓滅菌30分鐘)，并在生長3天后收獲真菌菌絲體。收獲的菌絲體立即在液氮中冷凍并在-80℃貯藏。由Malbranchea cinnamomea構建EcoRI/NotI-定向的cDNA文庫通過用硫氰酸胍萃取然后通過5.7M CsCl墊層(Chirgwin等人，1979，生物化學(Biochemistry)185294-5299)超速離心通過以下改變制備總RNA。將冷凍的菌絲體在液氮中用研缽和搗棒粉碎成細粉，接著在預冷的咖啡磨中進行粉碎，并且立即懸浮于5體積的RNA萃取緩沖液(4M硫氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸鈉，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.1Mβ-巰基乙醇)中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘并離心分離(10000rpm下20分鐘，Beckman)，從而使細胞碎片沉淀。收集上清液，小心地在5.7M CsCl墊層(5.7M CsCl，10mM EDTA，pH7.5，0.1％DEPC；使用前經(jīng)過高壓滅菌)上鋪層，每12.0ml CsCl墊層使用26.5ml上清液，并且離心分離得到總RNA(Beckman，SW28轉子，25000rpm，室溫，24小時)。離心之后小心地除去上清液并將含RNA沉淀物的管底切去并用70％乙醇沖洗。將該總RNA沉淀物轉移到一Eppendorf管中，懸浮于500μl的TE中，pH7.6(如果困難的話，不時地在65℃下加熱5分鐘)，萃取苯酚，并用乙醇在-20℃下沉淀12小時(2.5體積的乙醇，0.1體積的3M醋酸鈉pH5.2)。該RNA通過離心分離收集，在70％乙醇中洗滌，并懸浮于最小體積的DEPC中。通過測定OD260/280確定該RNA濃度。
通過低聚(dT)-纖維素親和層析分離該聚(A)+RNA(Aviv & Leder，1972，美國國立科學院學報(Proceedings of the National Academy ofScience USA)691408-1412)。將總共0.2g的低聚(dT)纖維素(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)在10ml的lx的柱加樣緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.5M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)中預膨脹，加載到一DEPC-處理過的填塞的塑料柱(Poly PrepChromatography Column，BioRad，Hercules，CA)上，并用20ml的lx加樣緩沖液平衡。該總RNA(1-2mg)在65℃下加熱8分鐘，在冰上驟冷5分鐘，并且在RNA樣品中加入1體積的2x柱加樣緩沖液之后將該RNA樣品加樣到柱上。收集洗脫液并通過每次加樣之前如上所述加熱樣品并在冰上驟冷后再加樣2-3次。該低聚(dT)柱用10體積的lx加樣緩沖液沖洗，然后用3體積的介質鹽緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)沖洗，接著用3體積預熱到65℃的洗脫緩沖液(10mM Tris-Cl，pH7.6，1mM EDTA，0.05％SDS)洗脫該聚(A)+RNA，收集500μl分部收集液。讀取每一分部收集液的OD260，并將含該mRNA的分部收集液匯集并在-20℃下經(jīng)乙醇沉淀12小時。離心收集該聚(A)+RNA，再懸浮于DEPC-DIW中并以5-10μg等分液貯藏在-80℃下。
由5μg的Malbranchea cinnamomea聚(A)+RNA通過RNase H法(Gubler和Hoffman 1983，出處同上；Sambrook等人，1989，出處同上)利用發(fā)夾修飾合成雙鏈cDNA。將該聚(A)+RNA(5μg于5μl的DEPC-處理過的水中)在預硅烷化的、無RNase的Eppendorf管中于70℃下加熱8分鐘，在冰上驟冷，并以最終體積50μl與逆轉錄酶緩沖液(50mM Tris-ClpH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT)混合，該逆轉錄酶緩沖液含有1mM的dATP、dGTP和dTTP，和0.5mM的5-甲基-dCTP，40個單位的人胎盤核糖核酸酶抑制劑，4.81μg的低聚(dT)18-NotI引物(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)和1000個單位的SuperScript II逆轉錄酶(Gibco-BRL，美國)。
通過在45℃下將該反應混合物溫育1小時合成第一鏈cDNA。合成之后，按照制造商的說明書將該mRNAcDNA雜合體混合物通過PharmaciaMicroSpin S-400HR旋轉柱凝膠過濾。
凝膠過濾之后，將該雜合體稀釋于250μl第二鏈緩沖液(20mMTris-Cl pH 7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.16mMβNAD+)中，該緩沖液含有200μM的每一dNTP、60個單位的大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、5.25個單位的RNase H和15個單位的大腸桿菌DNA連接酶。通過在16℃下將反應管溫育2小時并在25℃下再溫育15分鐘進行第二鏈cDNA的合成。加入EDTA至最終濃度20mM使反應停止接著通過氯仿萃取。
通過加入2體積的96％乙醇和0.2體積的10M醋酸銨將該雙鏈cDNA在-20℃下經(jīng)過乙醇沉淀，離心回收，在70％乙醇中洗滌，干燥(SpeedVac)，并再次懸浮于30μl的綠豆核酸酶緩沖液(30mM醋酸鈉pH4.6，300mMNaCl，1mM ZnSO4，0.35mM二硫蘇糖醇，2％甘油)中，該緩沖液含有25個單位的綠豆核酸酶。該單鏈發(fā)夾DNA通過以下步驟進行修剪將反應物在30℃下溫育30分鐘，接著加入70μl的10mM Tris-Cl，pH7.5、1mM EDTA，苯酚萃取，和用2體積的96％乙醇以及0.1體積3M醋酸鈉pH5.2冰浴30分鐘進行乙醇沉淀。
通過離心(20,000rpm，30分鐘)回收這些雙鏈cDNA，并用T4DNA聚合酶于30μl的T4DNA聚合酶緩沖液(20mM Tris-乙酸鹽，pH7.9，10mM乙酸鎂，50mM乙酸鉀，1mM二硫蘇糖醇)中通過在+16℃下將反應混合物溫育1小時將其平端化，該緩沖液含有0.5mM的每一dNTP和5個單位的T4DNA聚合酶。通過加入EDTA至最終濃度為20mM來終止反應，接著苯酚和氯仿萃取并通過加入2體積的96％乙醇和0.1體積的3M醋酸鈉pH5.2在-20℃下經(jīng)乙醇沉淀12小時。
補平反應之后，如上所述離心回收這些cDNA，在70％乙醇中洗滌并將該DNA沉淀在SpeedVac中干燥。通過將該反應混合物在16℃下溫育12小時將該cDNA沉淀再次懸浮于25μl的連接緩沖液(30mMTris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，0.5mM ATP)中，該緩沖液含2μgEcoRI銜接子(0.2μg/μl，Pharmacia，Uppsala，瑞典)和20個單位的T4連接酶。通過在65℃下加熱20分鐘，然后在冰上放置5分鐘將反應停止。適應的cDNA用NotI通過加入20μl高壓滅菌水、5μl的10x NotI限制酶緩沖液和50個單位的NotI進行消化，接著在37℃下溫育3小時。通過在65℃下加熱15分鐘來將反應停止。這些cDNA在lx TBE(在高壓滅菌水中)中通過瓊脂糖凝膠電泳被按大小分離在0.8％SeaPlaque GTG低熔融溫度的瓊脂糖凝膠(FMC，Rockland，ME)上，從而將未連接的銜接子和小cDNA分離。將該凝膠在15V下跑膠12小時，并通過切斷較低部分的瓊脂糖凝膠以0.7kb為一個截斷將該cDNA按大小選擇。然后將一1.5％瓊脂糖凝膠倒在含該cDNA的凝膠的前面，并通過向后跑膠直到在凝膠上出現(xiàn)壓縮的帶來將雙鏈cDNA濃縮。將含cDNA的凝膠塊從凝膠處切下并用GFX膠帶純化試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL)按照如下方法從凝膠萃取cDNA。將經(jīng)過修剪的凝膠片在2ml Biopure Eppendorf管中稱重，然后每10mg凝膠片加入10ml捕獲緩沖液(Capture Buffer)，通過在60℃下溫育10分鐘將該凝膠片溶解，直到瓊脂糖完全溶解，管底樣品通過簡單離心。將熔融的樣品轉移到放置在收集管中的GFX旋轉柱中，25℃下溫育1分鐘，然后在微量離心機中全速旋轉30秒鐘。排放掉溢流物，柱用500μl洗滌緩沖液沖洗，接著全速離心30秒鐘。取出收集管，并將該柱放在一1.5ml Eppendorf管中，接著向柱中心加入50μl的TEpH7.5以洗脫cDNA，在25℃下溫育1分鐘，最后以最大速度離心1分鐘。洗脫的cDNA在-20℃下貯藏直到文庫構建。
用于制備含EcoRI-NotI插入物的pYES2.0cDNA克隆的質粒DNA，通過使用QIAGEN Tip-100按照制造商的說明書來進行純化(QIAGEN，Valencia，CA)。總共10μg純化的質粒DNA用NotI和EcoRI在總體積60μl中通過加入6μlEcoRI用的10x NEBuffer(New England Biolabs，Beverly，MA)、40個單位的NotI和20個單位的EcoRI，接著在37℃下溫育6小時消化至完全。通過在65℃下加熱樣品20分鐘使反應停止。消化的質粒DNA用苯酚-氯仿萃取一次，然后用氯仿萃取一次，接著在-20℃下通過加入2體積的96％乙醇和0.1體積的3M醋酸鈉pH5.2經(jīng)過乙醇沉淀。沉淀的DNA再次懸浮于25μl的lxTEpH7.5中，加載到lxTBE中的0.8％SeaKem瓊脂糖凝膠上，并以60V在該凝膠上跑膠3小時。消化的載體從凝膠上切下來，用GFX膠帶純化試劑盒(Amersham-PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)按照制造商的說明書從凝膠中萃取DNA。通過OD260/280測定DNA濃度之后，將洗脫的載體在-20℃下貯藏直到文庫構建。
為了建立cDNA文庫的最佳連接條件，在10μl連接緩沖液(30mMTris-Cl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中進行4個測試連接反應，所述緩沖液含7μl雙鏈cDNA(大致相當于1/10的cDNA樣品的總體積)、2個單位的T4連接酶和分別為25ng、50ng和75ng的EcoRI-NotI裂解的pYES2.0載體(Invitrogen)。所述載體背景對照連接反應含有75ng的EcoRI-NotI裂解的pYES.0載體，沒有cDNA。這些連接反應是通過在16℃下溫育12小時，在65℃下加熱20分鐘進行的，然后向每只管中加入10μl高壓滅菌水。將1μl的連接混合物電穿孔(200W，2.5kV，25mF)至40μl電感受態(tài)大腸桿菌DH10B細胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中。加入1ml SOC到每一轉化混合物中之后，將這些細胞在37℃下培養(yǎng)1小時，將來自每一電穿孔的50μl和5μl平鋪在補充有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上并在37℃下培養(yǎng)12小時。使用這些最佳條件，在大腸桿菌中構建含有2×107獨立菌落形成單元的Malbranchea cinnamomea cDNA文庫，載體背景約為1％。將該cDNA文庫以(1)個體庫(25,000 c.f.u./庫)于20％甘油中在-80℃下貯藏；(2)相同庫的細胞沉淀在-20℃下貯藏；(3)個體庫的Qiagen純化質粒DNA在-20℃下貯藏(Qiagen Tip 100)；和(4)定向的雙鏈cDNA在-20℃下貯藏。使用聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)生家族12木葡聚糖酶的cDNA探針使用200pmol的含簡并脫氧肌苷的低聚核苷酸有義引物(相當于純木葡聚糖酶的NH2-端的肽(5’-GA(C/T)TT(C/T)TG(C/T)GGI CA(A/G)TGGGA-3’))和200pmol的反義引物(相當于從純木葡聚糖酶測定的內部氨基酸序列的肽(5’-TGI(C/G)(A/T)(C/T)TG(A/G)TCC ATI CC(C/T)TG(C/T)TC-3’))、PTC-200 Peltier Thermal cycler(MJ Research，USA)和2.5個單位的AmpliTaq Gold聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，將約20納克的來自Malbranchea cinnamomea的定向雙鏈cDNA進行PCR擴增。通過以下步驟進行聚合酶鏈反應在94℃下通過10分鐘的變性步驟始動該PCR，然后采用以下循環(huán)方式進行40次循環(huán)的PCR94℃下變性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分鐘。擴增產(chǎn)物通過在2％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分析，接著使用GFX膠帶純化試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)按照制造商的說明書從凝膠中萃取一約0.6kb PCR片段。純化的PCR片段使用300ng GFX-純化模板、Taq脫氧末端環(huán)狀測序試劑盒(Perkin Elmer，USA)、熒光標記的終止子和5pmol含簡并脫氧肌苷的低聚核苷酸引物(5’-ACI GA(C/T)ATI CA(A/G)AA(C/T)GA(A/G)GA(A/G)(C/T)TI TGG-3’)直接通過雙脫氧鏈終止法測序(Sanger，F(xiàn).、Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)美國國立科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)74，5463-5467)。根據(jù)Devereux等人，1984(Devereux，J.、Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)核酸反應(NucleicAcids Res.)12，387-395)分析這些序列數(shù)據(jù)。篩選cDNA文庫將30000個來自在pYES 2.0中構建的Malbranchea cinnamomea cDNA文庫的菌落形成單元在大腸桿菌中使用隨機引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化學(Anal.Biochem.)132，6-13)32P-標記的(＞1×109cpm/μg)木葡聚糖用的PCR產(chǎn)物作為探針通過菌落雜交法進行篩選(Sambrook等人(1989)分子克隆(Molecular cloning)實驗手冊(A laboratory manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)。在以下條件下進行該雜交在2×SSC(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)、5×Denhardt溶液(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml變性鮭精DNA中于65℃下保持20小時，接著在5×SSC中于25℃下洗滌(2×15分鐘)，在2×SSC、0.5％SDS中于65℃下洗滌(30分鐘)、在0.2×SSC、0.5％SDS中于65℃下洗滌(30分鐘)并最終在5×SSC中于25℃下洗滌(2×15分鐘)。篩選該Malbrancheacinnamomea cDNA文庫獲得4個強雜交的克隆，經(jīng)過以下步驟進一步分析用pYES正向和反向多接頭引物對cDNA末端測序(Invitrogen，USA)，并測定兩條鏈的最長木葡聚糖酶cDNA的核苷酸序列(命名為pClXYG1011)。核苷酸序列分析使用500ng Qiagen純化模板(Qiagen，USA)、Taq脫氧端循環(huán)測序試劑盒(Perkin-Elmer，USA)、熒光標記的終止子和5pmol或者pYES2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)或者合成低聚核苷酸引物，從兩條鏈通過雙脫氧鏈終止法測定全長Malbranchea cinnamomea木葡聚糖酶cDNA克隆pClXYG1011的核苷酸序列(Sanger，F(xiàn).、Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)美國國立科學院學報74，5463-5467)，獲得所附的序列SEQ IDNO1和所附的SEQ ID NO2所示的家族12木葡聚糖酶前體的推測氨基酸序列。按照Devereux等人，1984分析這些序列數(shù)據(jù)(Devereux，J.、Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)核酸反應(Nucleic Acids Res.)12，387-395)。在米曲霉中的異源表達米曲霉的轉化如Christensen等人(1988)，生物技術(Biotechnology)6，1419-1422所述轉化米曲霉。構建曲霉屬表達用的木葡聚糖酶表達盒使用標準步驟從Malbranchea cinnamomea cDNA克隆pClXYG1011中分離質粒DNA并通過限制酶分析進行分析。該XYGl011cDNA插入片段是使用50ng pClXYGl011質粒DNA作為模板，100pmol有義引物(5’-CGGGATCCGATAGAGTCGAG-ATGAAGG-3’)，混合有100pmol反義引物(5’-CCGCTCGAGCCAA-AGAGCTAAAAAAGTTG-3’)，PTC-200 Peltier Thermalcycler(MJ Research，USA)和高保真度擴增PCR系統(tǒng)(Expand HighFidelity PCR System)(Roche Molecular Biochemicals，德國)按照制造商的說明書進行PCR擴增的。使用以下循環(huán)方式進行30次PCR循環(huán)94℃下變性30秒，60℃下退火30秒，72℃下延伸2分鐘。通過在1％瓊脂糖凝膠中電泳分析這些擴增產(chǎn)物，接著使用GFX膠帶純化試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)按照制造商的說明書從該凝膠中萃取約1.0kb XYG1011 PCR片段。這些純化的PCR片段和曲霉屬表達載體pMT2188都用BamHI和XhoI進行雙消化。接著按照制造商說明書將該載體用蝦堿性磷酸酶(Roche，Mannheim，Germany)脫磷酸化。通過苯酚和氯仿萃取除去限制酶和磷酸酶，并使用標準步驟將PCR片段與載體連接(Sambrook等人1989)。大腸桿菌菌株DB6507(F，pyrF74Tn5，supE44，lacYl，aral4，galK2，xyl5，mtl1，leuB6，proA2，hsdS20，recAl3，rpsL20，thi-1，？)用連接混合物轉化，并且通過菌落PCR篩選轉化體以檢測在pMT2188中在存在PCR插入片段。使用標準PCR方法用10？1體積未裂解的大腸桿菌細胞提供模板，退火溫度55℃和具有以下序列的引物進行菌落PCR反應(Saiki等人，1988，科學(Science)239487-491)引物1GTTTCCAACTCAATTTACCTC引物2TTGCCCTCATCCCCATCCTTT
由此鑒定的表達克隆被命名為pMStr43，并且測定克隆的PCR片段的序列，以確保在擴增期間不產(chǎn)生誤差。在849位從終止編碼子的下游發(fā)現(xiàn)了單個C被T取代。米曲霉的轉化常規(guī)步驟100ml的YPD(Sherman等人，酵母菌遺傳的方法(Methodsin Yeast Genetics)，冷泉港實驗室，1981)被接種上米曲霉孢子并在搖動下于37℃下培養(yǎng)約2天。通過miracloth過濾收獲菌絲體并用200ml的0.6M MgSO4洗滌。將該菌絲體懸浮于15ml的1.2M MgSO4和10mMNaH2PO4，pH5.8中，并加入1ml含120mg Novozym234的相同緩沖液，將該混合物在37℃下緩慢攪拌培養(yǎng)1.5-2.5小時，直到可以在用顯微鏡觀察的樣品中見到大量原生質體。懸液通過miracloth過濾，濾液轉移到無菌管中并覆蓋5ml 0.6M山梨糖醇、100mM Tris-HCl，pH7.0。以100g離心15分鐘并從MgSO4墊層的上面收集原生質體。將2體積的STC(1.2M山梨糖醇、10mM CaCl2、10mM tris-HCl，pH7.5)加入到該原生質體懸液中并在1000g下將該混合物離心5分鐘。將該原生質體沉淀再次懸浮于3ml STC并再次沉淀。重復此步驟。最后將這些原生質體再次懸浮于0.2-1ml的STC中。將100μl原生質體懸液于5μg懸浮于10μlSTC中的轉化DNA混合。將該混合物在室溫下靜置25分鐘。加入1ml 60％PEG 4000的10mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH7.5并緩慢混合?；旌衔镌谑覝叵聹赜?5分鐘，然后以2500g旋轉離心15分鐘。將沉淀的原生質體再懸浮于1ml的STC中并平鋪于含1.0M蔗糖用于滲透支撐這些原生質體的選擇性培養(yǎng)基上。就pMT2188而言，具有10mM乙酰胺和67mMCsCl的基本培養(yǎng)基提供對amdS標記的選擇性。轉化體在37℃下培養(yǎng)4-7天之后可以區(qū)別開來。產(chǎn)木葡聚糖酶米曲霉轉化體的鑒定和分離曲霉在轉化之后在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生的每一菌落通過將分生孢子轉移到調整至pH7.5并含1％葡萄糖和10mM NaNO3并且?guī)в邢嗤睾?.1％w/v底物AZCL-木葡聚糖的薄上層(Megazyme，Bray，Ireland)的固體基本培養(yǎng)基上測定產(chǎn)生的木葡聚糖酶。分生孢子在37℃下生長過夜之后通過可見擴散藍色天青蛋白染料檢測底物的水解。按照該試驗檢測的結果，一個轉化體產(chǎn)生木葡聚糖酶。
在含限制菌落大小的0.01％triton X-100的選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)稀釋劃線接種分生孢子來分離該轉化體。將4個由單個孢子產(chǎn)生的分離菌落在上述培養(yǎng)基上再次測定木葡聚糖酶活性，另外在30℃和200轉/分鐘下在10ml具有2％麥芽糖的YP培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天(Sherman等人，酵母菌遺傳方法(Methods in Yeast Genetics)，冷泉港實驗室，1981)。這些培養(yǎng)物的上清液采用12％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)SDS/PAGE分離(Novex，San Diego，CA，USA)并且按照制造商的說明書用考馬斯亮藍(Coumassie-blue)將蛋白質染色。將產(chǎn)生最大量木葡聚糖酶的曲霉分離物命名為MStrl25。測定木葡聚糖酶單位(XGU或XyloU)使用來自Megazyme，愛爾蘭的AZCL-木葡聚糖作為底物測定木葡聚糖酶活性。
將0.2％該藍色底物溶液攪拌懸浮于0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.5中。將該溶液攪拌分裝到1.5ml Eppendorf管(每支加入0.75ml)，加入50μl酶溶液并將它們在5436型Eppendorf Thermomixer中在40℃和1200rpm的混合下溫育20分鐘。培養(yǎng)之后將有色溶液通過14,000rpm下離心4分鐘與固體分開并在600nm下測定上清液的吸光度。一式兩份進行該測定并減去一式兩份進行的本底。用于計算催化活性的600nm下的讀數(shù)必需在0.2-1.5之間。
1個XyloU單位定義為在600nm下在1cm比色杯中產(chǎn)生0.24吸光度的酶的量。
以下實施例描述本發(fā)明。實施例1篩選產(chǎn)生堿性木葡聚糖酶的微生物將真菌微生物Malbranchea cinnamomea，CBS 960.72、Malbrancheacinnamomea，CBS343.55和Malbranchea cinnamomea，UAMH2485按照材料和方法部分所述方法培養(yǎng)。在瓊脂糖平皿測定中在三個不同pH(pH3、pH7、pH10)下測定培養(yǎng)液的木葡聚糖酶、β-葡聚糖酶和纖維素酶活性。
發(fā)現(xiàn)以下活性菌株號 木葡聚糖酶 纖維素酶β-葡聚糖酶pH3 pH7 pH10 pH3 pH7 pH10 pH pH7 pH10CBS960.72 - ++++ +++++++++++++CBS343.55 - ++++ +++++++++++++UAMH2485 - ++++ +++++++++++++
通過以下方法獲得約500ml每一真菌菌株的培養(yǎng)液在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)所述真菌，然后加入100ml無菌水萃取。將培養(yǎng)液過濾并用80％硫酸銨沉淀蛋白質。將沉淀的蛋白質沉淀物溶于約60ml pH6.0的25mMKH2PO4/NaOH緩沖液中。然后樣品在截留分子為5kDa的MilliporeBiomax-5纖維素酶抗性膜上進行超濾(用相同緩沖液洗滌過)，直到蛋白質的導電率低于1ms/cm。將10ml的該樣品施加于離子交換柱(Q-Sepharose Fast Flow，34ml)并用0.025M磷酸鹽緩沖液pH6.0平衡。木葡聚糖酶和CMC酶都吸附到柱上并用1N氯化鈉梯度洗脫液洗脫。將所有分部收集液收集起來并采用微量滴定板試驗用0.5％AZCL-底物分析木葡聚糖酶和纖維素酶活性。
在圖1-3中分別顯示了部分純化Malbranchea cinnamomea的三種菌株的不同分部收集液中的木葡聚糖酶和纖維素酶活性圖1顯示了來自菌株UAMH2485的分部收集液，圖2顯示了來自菌株CBS343.55的分部收集液，圖3顯示了來自菌株CBS960.72的分部收集液。從這些圖可以看出，兩個酶出現(xiàn)在不同的分部收集液中并因此輕易地將它們分離。1-3分部收集液含有最大的木葡聚糖酶活性并且它們在瓊脂糖平板CMC(1％)、AZCL-HE-纖維素(0.1％)(甚至在45℃下培養(yǎng)過夜之后)或液體試驗(0.5％AZCL-HE-纖維素，pH7和9，45℃，800rpm下持續(xù)2.5小時)都沒有纖維素酶活性。
合并具有木葡聚糖酶活性的分部收集液并使用具有截留分子量為10kDa的膜濃縮。濃縮的樣品用于測定pI的IEF試驗和測定分子量的SDS-PAGE。測出來自Malbranchea cinnamomea的所有三個菌株的木葡聚糖酶具有相同的pI(約pH3.5)和相同的分子量(約25kDa)。而且，電印跡蛋白質譜帶并測定其N-端序列部分是FCGQXDSEQSGPYIVYNNL，其中X可能是W(色氨酸)。
按材料和方法中所述方法測定三個木葡聚糖酶各自的木葡聚糖酶活性，結果如下菌株 XGU/mlCBS960.72 27.5CBS343.55 9.1UAMH2485 12.3B.純化如上所述將來自培養(yǎng)液的木葡聚糖酶部分純化。將具有木葡聚糖酶活性的分部收集液通過Hiprep 26/10柱脫鹽，平分入塑料管(每管15ml)中并冷凍干燥。冷凍干燥過的粉末溶于2ml去離子水中；將1ml用于鑒定并將1ml進一步純化。將該溶液稀釋于25mM Tris緩沖液pH7.0中，接著在具有截留分子量為5kDa的膜的Amicon室中濃縮用于降低電導率。當電導率低于3mSi時將溶液上樣到1ml用相同緩沖液平衡過的MonoQ柱上。木葡聚糖酶附著在柱上并用0.5M氯化鈉梯度洗脫液洗脫。分析所有分部收集液的木葡聚糖酶活性并且2個分部收集液都含有該活性。
在匯集的分部收集液的SDS-PAGE上可以鑒定MW為25kDa的清晰譜帶。將該蛋白質譜帶進行電印跡并測定部分N-端序列并獲得以下數(shù)據(jù)FCGQXDSEQSGPYIVYNNL。該部分N-端序列與國際專利公布WO98/38288中公開的Tiasporella phaseolina XET具有同源性(63％)。
在與材料和方法中所述的木葡聚糖酶測定相同條件下溫育2小時之后該具有木葡聚糖酶活性的分部收集液對AZCL HE纖維素未顯示活性。
8 0.760.83 0.839 0.740.81 0.8110 0.500.57 0.6611 0.430.51 0.61結果顯示，來自這些菌株的木葡聚糖酶具有幾乎相同的pH分布圖。與已知的木葡聚糖酶相比，它們具有更大的堿性活性甚至在pH10下有50-80％相對的木葡聚糖酶活性。溫度分布圖為了測定溫度分布圖，將70μl攪拌懸浮于0.1M甘氨酸緩沖液pH 9中的0.2％藍色底物AZCL-木葡聚糖溶液和30μl部分純化的木葡聚糖酶樣品混合于Eppendorf管中并在不同溫度(20、30、40、50、60和70℃)下于水浴中溫育40分鐘。將變性的酶樣品(100℃沸騰20分鐘)用作空白。溫育之后將有色溶液通過10000rpm、4℃下離心5分鐘從固體中分離出來。將60μl上清液轉移到微量滴定板中并通過BioRad MicroplateReader在595nm下測定其吸光度。
下面顯示了來自菌株Malbranchea cinnamomea UAMH 2485、CBS343.55和CBS960.72的木葡聚糖酶的溫度分布圖(按照相對的木葡聚糖酶活性)溫度(℃) UAMH2485 CBS343.55 CBS960.7220 0.12 0.200.1530 0.22 0.300.2640 0.54 0.620.5650 1 1 160 0.30 0.380.3070 0.16 0.160.16來自這三個Malbranchea cinnamomea菌株的木葡聚糖酶具有非常相似的溫度分布圖，它們在20-70℃有活性并在約50℃的溫度下具有最佳活性。熱穩(wěn)定性為了進行熱穩(wěn)定性試驗，將來自實施例2的部分純化的酶樣品在40℃水浴中溫育并在不同溫育時間(0、0.5、1、2、3、4、5和6小時)取樣，然后通過攪拌混合70μl懸浮于0.1M甘氨酸緩沖液pH9的0.2％藍色底物AZCL-木葡聚糖溶液和30μl樣品于微量滴定板上并在50℃、800rpm下于Eppendorf thermomixer中溫育40分鐘通過微量滴定板試驗測定來自這些樣品的木葡聚糖酶活性。將變性的酶樣品(100℃下沸騰20分鐘)用作空白。溫育之后將有色溶液通過10000rpm、4℃下離心5分鐘從固體中分離出來。將60μl上清液轉移到微量滴定板中并通過BioRadMicroplate Reader在595nm下測定其吸光度。
下面顯示了熱穩(wěn)定性試驗的結果(按照相對的木葡聚糖酶活性)培養(yǎng)時間(小 UAMH2485CBS343.55 CBA960.72時)01 1 10.5 0.951 0.9510.880.98 1.0821 1.30.9830.950.99 0.9540.860.96 0.9650.891 0.986n.a.1 1.01可以看出，來自這三個Malbranchea cinnamomea菌株的酶在測定條件下非常穩(wěn)定。甚至在40℃下溫育6小時幾乎看不出任何活性損失。底物特異性使用不同底物，包括木葡聚糖酶用的AZCL-木葡聚糖(羅望子)、木聚糖酶用的AZCL-木聚糖(oat spelts)、阿拉伯聚糖酶用的AZCL-脫支化-阿拉伯聚糖、甘露聚糖酶用的AZCL-半乳甘露聚糖(角豆)、纖維素酶用的AZCL-HE-纖維素、內切-1，6-α-葡聚糖酶用的AZCL-葡聚糖、內切-1，4-β-半乳聚糖酶用的AZCL-半乳聚糖(馬鈴薯)，測定來自這三個Malbrancheacinnamomea菌株UAMH2485、CBS343.55和CBS960.72的部分純化的木葡聚糖酶的底物特異性。
發(fā)現(xiàn)來自這三個Malbranchea cinnamomea菌株的部分純化的木葡聚糖酶僅呈現(xiàn)木葡聚糖酶活性并未呈現(xiàn)其它酶活性?？梢缘贸龅慕Y論是來自這些Malbranchea cinnamomea菌株的木葡聚糖酶是木葡聚糖特異性酶。洗滌劑相容性在5個不同的歐洲和中國商用洗滌劑組合物中以2個劑量(2g/l和4g/l)測定如實施例2A所述來自3個Malbranchea cinnamomea菌株UAMH2485、CBS343.55和CBS960.72的部分純化的木葡聚糖酶商標是Ariel和Omo的歐洲洗滌劑和商標是Ariel、Tideo和Whitecat的中國洗滌劑與緩沖液pH7中的木葡聚糖酶活性進行比較。
在以下洗滌劑組合物中在正常洗滌條件(40℃，20分鐘溫育)下也對實施例2B中所述的純化木葡聚糖酶進行測定ArielFuture液，6g/l，18顆粒硬度(Grain Hardness)；ArielFuture粉，6g/l，18顆粒硬度；US Tide液，2g/l，8顆粒硬度；US Tide粉，2g/l，8顆粒硬度；日本液體BonusTM，0.65g/l，8顆粒硬度；日本Ariel粉，0.65g/l，8顆粒硬度；所有都是在0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.5中的活性。
發(fā)現(xiàn)來自所有三個菌株的木葡聚糖酶在所有測定的商用洗滌劑和所有測定的劑量中都是全活性。
將該發(fā)酵培養(yǎng)液通過Whatmann玻璃過濾器GF/D過濾。并獲得總共4700ml，它具有515木單位(xylounit)/ml。
將該澄清發(fā)酵液濃縮并用一丙二醇配制用于性能評價。
使用0.1m醋酸鈉緩沖液pH6.0采用superdex75柱色譜法將小樣品純化至高度同質性。該純酶在SDS-PAGE中具有單一譜帶，表觀分子量為25kDa。采用DSC發(fā)現(xiàn)其熔融溫度為74℃。純酶的比活性為160木單位/mg蛋白質。
使用常規(guī)步驟在Danish實驗室DAKO使兔血清產(chǎn)生抗該純酶。
采用edman降解法發(fā)現(xiàn)成熟酶的N-端序列是ADFCGQXDSEQSGPYIVYNNLWN，X不能鑒定出，但是以基因序列為基礎時為W。
在pH為5.5-9.0且40℃下時酶活性大于50％并且在商用粉末洗滌劑中為全活性。在35℃下在液體洗滌劑中非常穩(wěn)定且半衰期大于30天。
該酶對CMC沒有活性，因此它不是纖維素酶。
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序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>來自畸枝霉屬的木葡聚糖酶<130>AMJ<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1109<212>DNA<213>Malbranchea cinnamomea<220><221>CDS<222>(57)..(809)<220><221>mat_肽<222>(141)..(806)<400>1gctcaatttc tcgcggcatc aactattagc ctcaacgacc caacgataga gtcgag atg 59Metaag gtc gct gtt gca tcc ctt ctc ctt gct tct gcc gtc cca ggc atc107Lys Val Ala Val Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ser Ala Val Pro Gly Ile-25 -20 -15ttt gcg cag ccc acc ggg agc ctt gag aaa cgg gcc gac ttt tgc ggg155Phe Ala Gln Pro Thr Gly Ser Leu Glu Lys Arg Ala Asp Phe Cys Gly-10 -5 -1 15caa tgg gac tcc gaa cag agc ggc ccg tat att gtc tac aat aat ctc203Gln Trp Asp Ser Glu Gln Ser Gly Pro Tyr Ile Val Tyr Asn Asn Leu10 15 20tgg aat atg ggc aca ggt acg ggc tcg cag tgc acg gga gtc gac ggc251Trp Asn Met Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gln Cys Thr Gly Val Asp Gly25 30 35att gat ggc tcg acg ctg gcg tgg cac acc agc tgg tcc tgg tcg gga299Ile Asp Gly Ser Thr Leu Ala Trp His Thr Ser Trp Ser Trp Ser Gly40 45 50ggg caa ggc caa gtc aag tcc tac gca aat gcc gtc ctt gca gac att347Gly Gln Gly Gln Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ala Val Leu Ala Asp Ile55 60 65gtc tcc aac cca cgc gcc atc tcc gac att aac agc atc ccc tcg acc395Val Ser Asn Pro Arg Ala Ile Ser Asp Ile Asn Ser Ile Pro Ser Thr70 75 8085tgg cgc tgg agc tac agc ggc agc tct ctc gtc gcc aac gtc gca tac443Trp Arg Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Leu Val Ala Asn Val Ala Tyr90 95 100gac ctc ttt acc tcc tcc agc ccc tcg ggc tcc gag gag tac gag gtg491Asp Leu Phe Thr Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ser Glu Glu Tyr Glu Val105 110 115atg atc tgg ctc gca gca ctg ggc ggc gcg ggc ccc atc tct gag aca539Met Ile Trp Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Glu Thr120 125 130gga tcg ccg att gcg aac ccc acg gtt gcg ggg gtc aat tgg aat ttg587Gly Ser Pro Ile Ala Asn Pro Thr Val Ala Gly Val Asn Trp Asn Leu135 140 145ttc gag ggg tac aac ggc aac atg cac gtg tac agc ttc gtg gct gcg635Phe Glu Gly Tyr Asn Gly Asn Met His Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala150 155 160 165ggt gga agt gtt gag aat ttc agt ggg gac ttg aag gat ttc ttg aac683Gly Gly Ser Val Glu Asn Phe Ser Gly Asp Leu Lys Asp Phe Leu Asn170 175 180tat ttg ggg agc gag cag ggg atg gac cag agc cag tat gtg atc aat731Tyr Leu Gly Ser Glu Gln Gly Met Asp Gln Ser Gln Tyr Val Ile Asn185 190 195att ggc gcg gga aca gag ccg ttt agt ggt aat aat gcc gtc ttc acc779Ile Gly Ala Gly Thr Glu Pro Phe Ser Gly Asn Asn Ala Val Phe Thr200 205 210act tct gcg tat agc gtc cag gtt caa tag agaccgttgc cgagggcaac 829Thr Ser Ala Tyr Ser Val Gln Val Gln215 220gggatctgaa gcgagtgacc acgaccggaa agattggatg agagtgagtt gtacgaaaga 889gttttgcgaa tgcagggaaa agatccgctc gtggagaacc cttctgcatt cattcagtgc 949acttcaaata tctgtcatga gatatgttgt aaatatcgat gtatcagtcc aggtcacacg 1009cttcatgtgc gcgagagcat cgttaatcaa cttttttagc tctttggctc gcccaaaaaa 1069aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1109<210>2<211>250<212>PRT<213>Malbranchea cinnamomea<400>2Met Lys Val Ala Val Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ser Ala Val Pro Gly15 10 15Ile Phe Ala Gln Pro Thr Gly Ser Leu Glu Lys Arg Ala Asp Phe Cys20 25 30Gly Gln Trp Asp Ser Glu Gln Ser Gly Pro Tyr Ile Val Tyr Asn Asn
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權利要求
1.一種具有木葡聚糖酶活性的分離或純化的多肽，它是從畸枝霉屬的菌株中獲得的并具有i)pH為4-11時在50℃下測定的木葡聚糖酶活性；ii)通過SDS-PAGE測定分子量為25±10kDa；iii)等電點(pI)在3-5范圍內；和/或iv)N-端序列Ala-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Ser-Glu-Gln-Ser-Gly-Pro-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu。
2.如權利要求1的分離或純化的木葡聚糖酶，其中所述木葡聚糖酶內源于畸枝霉屬的菌株。
3.如權利要求1或2的分離或純化的木葡聚糖酶，其中所述菌株屬于選自以下菌種的菌株Malbranchea cinnamomea(和這三個同義詞Malbranchea sulfurea、Malbranchea pulchella var.sulfurea和Thermoidium sulfureum)、Malbranchea graminicola、Malbrancheapulchella、Malbranchea filamentosa、Malbranchea gypsea、Malbranchea albolutea、Malbranchea arcuata、Malbrancheaaurantiaca、Malbranchea bolognesii-chiurcoi、Malbrancheachrysosporioidea、Malbranchea circinata、Malbranchea flava、Malbranchea flavorosea、Malbranchea flocciformis、Malbrancheafulva、Malbranchea kambayashii、Malbranchea multicolor、Malbranchea sclerotica、Malbranchea setosa和Malbrancheadendritica。
4.如權利要求3的分離或純化的木葡聚糖酶，其中所述菌株屬于菌種Malbranchea cinnamomea。
5.如權利要求4的分離或純化的木葡聚糖酶，其中所述菌株選自以下Malbranchea cinnamomea，CBS 115.68、Malbranchea cinnamomea，MUCL 11291、Malbranchea cinnamomea，CBS 343.55、Malbrancheacinnamomea，MUCL9500、Malbranchea cinnamomea，UAMH 3827、Malbranchea cinnamomea，CBS 423.54、Malbranchea cinnamomea，CBS960.72和Malbranchea cinnamomea，UAMH 2485。
6.如權利要求1-5任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶，其中與最佳pH時的活性相比，所述木葡聚糖酶在pH9.5時具有至少50％的相對木葡聚糖酶活性，在pH10時具有至少40％的相對木葡聚糖酶活性。
7.如權利要求1-6任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶，其中所述木葡聚糖酶屬于家族12的糖苷水解酶。
8.如權利要求1-7任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶，對羧甲基纖維素(CMC)、AZCL HE纖維素或微晶纖維素(Avicel)沒有活性。
9.一種制備如權利要求1-8任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶的方法，該方法包括在能夠產(chǎn)生木葡聚糖酶的條件下培養(yǎng)屬于畸枝霉屬的菌株，優(yōu)選屬于菌種Malbranchea cinnamomea的菌株，并從培養(yǎng)物中回收所述酶。
10.一種家族12木葡聚糖酶，選自以下之一(a)含有由SEQ ID NO1的141-806位的DNA序列編碼的片段的多肽；(b)在表達SEQ ID NO1的DNA序列的條件下通過培養(yǎng)含該序列的細胞產(chǎn)生的多肽；(c)當相同性是通過10.0版本的GCG程序包中提供的GAP并使用GAP產(chǎn)生罰分(creation penalty)為8且GAP延伸罰分(extension penalty)為2測定時，序列與SEQ ID NO1的1-222位具有至少80％同源性的木葡聚糖酶。
11.如權利要求10的木葡聚糖酶，它是由畸枝霉屬的菌株獲得或者可以由其獲得。
12.一種分離的木葡聚糖酶，它是(i)無同源雜質，及(ii)是通過培養(yǎng)含有SEQ ID NO1的141-806位的DNA序列的細胞產(chǎn)生的。
13.一種酶制劑，含有如權利要求1-12任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶。
14.如權利要求13的制劑，還含有一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶(內切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸酯分解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠分解酶、其它甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉谷氨酰胺酶、或它們的混合物。
15.一種洗滌劑組合物，含有權利要求13-14任意一項權利要求的酶制劑或權利要求1-12任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶。
16.一種機器處理織物的方法，所述方法包括在機洗過程的洗滌循環(huán)中用含有權利要求13-14任意一項權利要求的酶制劑或權利要求1-12任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶的洗滌液處理織物。
17.權利要求13-14任意一項權利要求的酶制劑或權利要求1-12任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶在紡織業(yè)中用于提高纖維素纖維、紗線、機織或非機織織物性能的用途。
18.如權利要求17的用途，其中將所述酶制劑或酶用于精煉步驟。
19.權利要求13-14任意一項權利要求的酶制劑或權利要求1-12任意一項權利要求的分離或純化的木葡聚糖酶在纖維素纖維加工業(yè)中用于浸解選自大麻、黃麻、亞麻或亞麻布的纖維的用途。
全文摘要
一種具有木葡聚糖酶活性的分離或純化的多肽,它是從畸枝霉屬的菌株中獲得的并具有:pH為4－11時在50℃下的木葡聚糖酶活性;和/或通過SDS－PAGE測定的25±10kDa的分子量;等電點(pI)3－5;和/或N－端序列Ala－Asp－Phe－Cys－Gly－Gln－Trp－Asp－Ser－Glu－Gln－Ser－Gly－Pro－Tyr－Ile－Val－Tyr－Asn－Asn－Leu。它可用于工業(yè)如洗衣洗滌劑組合物和用于處理織物。
文檔編號D06M16/00GK1369007SQ00811390
公開日2002年9月11日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權日1999年8月13日
發(fā)明者吳文平, M·舒雷恩, M·S·考平恩, M·A·斯特里格 申請人:諾沃奇梅茲有限公司