專利名稱：鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，編碼所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA，生產(chǎn)所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的方法，以及所說蛋白質(zhì)和DNA的應(yīng)用。
有許多生物活性物質(zhì)例如激素和神經(jīng)遞質(zhì)都通過存在于細(xì)胞表面上或細(xì)胞內(nèi)的受體蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)生物學(xué)功能。那些生物活性物質(zhì)(以下有時也稱之為配體，以與受體相對應(yīng))與受體蛋白質(zhì)的相互作用是很特異的，并從而決定了例如每種個別生物活性物質(zhì)的靶細(xì)胞或器官、藥理學(xué)作用、及其強(qiáng)度和作用時間。因此，與受體蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)是開發(fā)藥物的重要手段之一。具體地說，如果發(fā)現(xiàn)了作用于受體蛋白質(zhì)的新物質(zhì)，便可望其具有很獨(dú)特的藥理學(xué)活性。
在各種受體蛋白質(zhì)中，有一類蛋白質(zhì)通過激活鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(以下有時也將其簡稱為G蛋白)參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所說的這類蛋白質(zhì)被稱為G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。它們的結(jié)構(gòu)特征是，均具有七個推測可能穿越細(xì)胞膜的高度疏水區(qū)域(跨膜區(qū))并且彼此間在氨基酸序列上顯示有很高的相似性。因此，既使還不知道這些蛋白質(zhì)所結(jié)合的物質(zhì)是什么，但從結(jié)構(gòu)觀點(diǎn)看將這些蛋白質(zhì)命名為受體蛋白質(zhì)。因此，已例如利用G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)間的序列相似性，以聚合酶鏈反應(yīng)(以下簡稱為PCR)，或與已知受體cDNA雜交，或?qū)DNA進(jìn)行隨機(jī)測序等技術(shù)分離了許多編碼新的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA。一般說來，結(jié)構(gòu)上彼此接近的受體趨向于結(jié)合結(jié)構(gòu)上彼此相似的配體。從這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，就某些新的受體蛋白質(zhì)來說，迄今已鑒定了一些它們所結(jié)合的配體。然而，對于其他一些新的受體蛋白質(zhì)，盡管推測所說的蛋白質(zhì)應(yīng)在結(jié)構(gòu)上與已知配體相份的配體相結(jié)合，但對這樣的物質(zhì)仍有待進(jìn)一步確定。再者，就預(yù)計(jì)相關(guān)配體來說，有許多受體還缺少足夠的相似性，并因而將這些受體分類為孤獨(dú)受體。雖然它們所結(jié)合的配體仍是未知的，但可以通過原位雜交或Northern印跡技術(shù)確定這些孤獨(dú)受體的表達(dá)模式或定位。對于某些孤獨(dú)受體來說，鑒于已經(jīng)預(yù)計(jì)到它們參與的生理學(xué)功能，所以就應(yīng)更有理由確定它們所結(jié)合的配體。
已經(jīng)從用糖皮質(zhì)素和毛喉素處理的小鼠T淋巴細(xì)胞系WEH1-7TG中分離了這樣一種孤獨(dú)受體，即糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)的受體(GIR)[Harrigan，M.T.et al.，Molecular Endocrinology(分子內(nèi)分泌學(xué))，5，1331-1338(1991)]。已知用糖皮質(zhì)素處理T淋巴細(xì)胞可誘導(dǎo)破壞所說細(xì)胞的代謝系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此時，特異性基團(tuán)的表達(dá)即被誘導(dǎo)。GIR便是這樣一種基團(tuán)，并且被認(rèn)為是一種參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的受體。因此，尋找GIR的配體可能是對新的免疫調(diào)節(jié)劑的進(jìn)一步研制和開發(fā)。最近，本發(fā)明人用PCR方法從人腦杏仁核衍生的cDNA中獲得了一種與編碼所說受體的cDNA很接近的新的cDNA片段?；趯Σ糠址治鲋被嵝蛄械蔫b定，估計(jì)該受體是小鼠已知受體GIR的人對應(yīng)物。迄今有關(guān)GIR之人對應(yīng)物的結(jié)構(gòu)還所知很少。
根據(jù)目前的發(fā)現(xiàn)，也已知道了同時作用于免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的因子，例如白介素6。有鑒于此，預(yù)計(jì)所說的孤獨(dú)受體和它所連接的配體在控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些或其他功能中也起到重要作用。從藥物開發(fā)的角度考慮，可期望獲得受體蛋白質(zhì)的人對應(yīng)物并將其用于開發(fā)各個藥物材料。例如，從一種動物到另一種動物化合物會產(chǎn)生完全不同的效應(yīng)，并且這種由不同種的受體本身引起不同效應(yīng)的事實(shí)并不罕見。因此，在研究和開發(fā)人用藥物中，人對應(yīng)物受體基因是十分必要的。
本發(fā)明提供一種新的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，含有編碼所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA的DNA序列，生產(chǎn)所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的方法，以及所說蛋白質(zhì)和DNA的應(yīng)用。
雖然本發(fā)明人預(yù)先得到了編碼人杏仁核衍生的受體蛋白質(zhì)片段的cDNA序列并分析了其部分核苷酸序列，但仍有必要獲得具有全長度開放讀框的cDNA，以便能夠鑒定出結(jié)合于由所說的cDNA編碼之受體蛋白質(zhì)上的受體。
例如，使用具有這一全長度開放讀框的cDNA，有可能產(chǎn)生有良好效能的所說的受體蛋白質(zhì)。使用適當(dāng)?shù)墓ぞ弑磉_(dá)的所說的受體蛋白質(zhì)，便有可能用受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞內(nèi)第二信使檢測的結(jié)果作為指標(biāo)，從出現(xiàn)于體內(nèi)的化合物或其他天然或非天然化合物中篩選出所說受體蛋白質(zhì)的配體。此外，還將有可能篩選出能夠改變配體對受體蛋白質(zhì)結(jié)合活性的化合物。
更具體地說，為了揭示使用基于G蛋白偶聯(lián)蛋白質(zhì)的共有序列設(shè)計(jì)并制備的DNA引物，以PCR技術(shù)獲得的人杏仁核衍生之受體的完整一級結(jié)構(gòu)并在構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)后尋找與所研究的受體結(jié)合的配體，以RACE方法(cDNA末端快速擴(kuò)增法)分析所說受體之開放讀框5’和3’末端部分的核苷酸序列，并以PCR技術(shù)克隆全長度開放讀框。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個具有由SEQ ID NO2代表之核苷酸序列的cDNA并測定了由之編碼的全部氨基酸序列(SEQ ID NO1)。具體地說，本發(fā)明第一次制得了

圖16和17中所示的序列，即編碼第一位氨基酸殘基(Met)到第91位氨基酸殘基(Leu)的部分和編碼第301位氨基酸殘基(Phe)到翻譯終止密碼子的部分。就編碼第92位(Val)到第300位氨基酸殘基(Leu)的部分來說，已通過分析p63A2確定了其部分序列，但還沒有明確確定該區(qū)域的全部序列。本發(fā)明現(xiàn)已揭示了該部分的確切序列。將總氨基酸序列與小鼠受體GIR相比較，可看出兩者之間有高達(dá)85.8％的同一性，而序列中N末端和C末端部分所顯示的差異可能是由于種屬差異所致(圖19)。
因此所揭示的全長度開放讀框的結(jié)構(gòu)更強(qiáng)有力地提示，由之編碼的蛋白質(zhì)落入具有七個疏水氨基酸簇的所謂G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)這一大類之內(nèi)(圖18)。
再者，以PCR技術(shù)從人下丘腦cDNA文庫和人全腦poly(A)+RNA擴(kuò)增了編碼所說受體的cDNA這一事實(shí)有力地提示，所說的受體可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對廣泛的區(qū)域內(nèi)發(fā)揮功能。
當(dāng)使用具有全長度開放讀框的本發(fā)明cDNA時，可以產(chǎn)生受體蛋白質(zhì)。當(dāng)使用以適當(dāng)?shù)墓ぞ弑磉_(dá)的所說的受體蛋白質(zhì)時，便可以以受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞內(nèi)第二信使檢測的結(jié)果作為指標(biāo)從出現(xiàn)于體內(nèi)的化合物或其他天然或非天然化合物中篩選出與所說受體蛋白質(zhì)結(jié)合的配體。此外，也有可能篩選出能夠改變G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物，例如能夠抑制結(jié)合活性的化合物。
因此，本發(fā)明提供(1)包括由SEQ ID NO1物表示的氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)等同物的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，或其鹽；(2)如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽，或其鹽。例如，至少16個氨基酸的片段；(3)包括編碼(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或如(2)中所述的部分肽之核苷酸序列的DNA；(4)(3)中所述的包括由SEQ ID NO2表示之核苷酸序列的DNA；(5)包含(3)中所述DNA的重組載體；(6)攜帶(3)中所述DNA或(5)中所述重組載體的重組體；(7)生產(chǎn)(1)所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽的方法，其包括培養(yǎng)(6)中所述的重組體；(8)用于檢測(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之配體的方法，其包括使(i)如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或如(2)中所述的部分肽或其鹽與(ii)待檢樣品接觸；(9)用于篩選能夠改變(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽與配體之結(jié)合活性的化合物的方法，該方法包括就下列兩種情況進(jìn)行比較(i)所說的配體與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或(2)中所述的部分肽或其鹽接觸的至少一種情況，和(ii)所說的配體連同待檢樣品一起與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或(2)中所述的部分肽或其鹽相接觸的至少一種情況；(10)用于篩選能夠改變(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽與配體之結(jié)合活性的化合物的藥盒，該藥盒包含如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或如(2)中所述的部分肽或其鹽。
(11)按(9)中所述的篩選方法或使用(10)中所述的篩選藥盒得到的、能夠改變(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽；(12)抗(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或(2)中所述的部分肽或其鹽的抗體。
更具體地說，本發(fā)明進(jìn)一步提供(13)用于檢測(8)中所述配體的方法，其中配體是下列物質(zhì)之一血管緊張肽、鈴蟾肽、類大麻苷、縮膽囊肽、谷氨酰胺、血管緊張素、褪黑素、神經(jīng)肽Y、阿片樣肽、嘌呤、加壓素、催產(chǎn)素、VIPs(血管活性腸肽和相關(guān)肽)、促生長素抑制素、多巴胺、促胃動素、糊精、緩激肽、CGRP(降鈣素基因相關(guān)肽)、白三烯、胰抑制素、前列腺素樣激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、腎上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、內(nèi)皮肽、腸抑胃泌素、組胺、神經(jīng)降壓素、TRH、胰多肽和galanin；(14)篩選能夠改變(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在至少下述各種情況下檢測與所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合被標(biāo)記配體的量(i)被標(biāo)記配體與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或(2)中所述的部分肽或其鹽接觸時，以及(ii)被標(biāo)記配體連同待檢化合物與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或(2)中所述的部分肽或其鹽接觸時，并比較所檢測到的被標(biāo)記之配體的量；(15)篩選能夠改變(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在至少下述各種情況下檢測與含有所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合的被標(biāo)記配體的量(i)在被標(biāo)記配體與所說的細(xì)胞接觸的情況下，以及(ii)在標(biāo)記配體連同待檢化合物與所說的細(xì)胞接觸的情況下，并比較所測得的被標(biāo)記之配體的量；(16)篩選能夠改變(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在至少下述各種情況下檢測與含有所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之細(xì)胞的膜部分結(jié)合的被標(biāo)記配體的量(i)在被標(biāo)記配體與所說的膜部分接觸的情況下；(ii)在被標(biāo)記配體連同待檢化合物與膜部分接觸的情況下，并比較所檢測到的被標(biāo)記配體的量；(17)篩選能夠改變(1)中所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在下列至少各種情況下檢測與所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合的被標(biāo)記配體的量(i)在被標(biāo)記的配體與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸的情況下，但其中所說的受體蛋白質(zhì)是在培養(yǎng)(6)中所述轉(zhuǎn)化體后在所說轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜上表達(dá)的，和(ii)在被標(biāo)記配體連同待檢化合物一把與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸的情況下，但其中所說的受體蛋白質(zhì)是在培養(yǎng)(6)中所述轉(zhuǎn)化體后在該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜上表達(dá)的，并比較所測得的被標(biāo)記配體的量；(18)篩選能夠改變(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與其配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在至少下列各種情況下檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性(i)在能夠激活如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物與含有如(1)中所述之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的所說細(xì)胞相接觸的情況下，以及(ii)在能夠激活如(1)所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物連同待檢測化合物一起與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞相接觸的情況下，然后比較所測得的細(xì)胞刺激活性；(19)篩選能夠改變(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括在至少下列各種情況下檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性(i)在能夠激活如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸的情況下，其中所說的受體蛋白質(zhì)是在培養(yǎng)含有(3)中所述DNA的轉(zhuǎn)化體后在所說轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜上表達(dá)的，和(ii)在能夠激活(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物連同待檢化合物一起與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸的情況下，其中所說的受體蛋白質(zhì)是在培養(yǎng)含有(3)中所述DNA的轉(zhuǎn)化體后在所說轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜上表達(dá)的，然后比較所測得的細(xì)胞刺激活性；(20)如(18)或(19)中所述的篩選方法，其中能夠激活(1)中所述之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物是下列物質(zhì)之一血管緊張肽、鈴蟾肽、類大麻苷、縮膽囊肽、谷氨酰胺、血管緊張素、褪黑素、神經(jīng)肽Y、阿片樣肽、嘌呤、加壓素、催產(chǎn)素、VIPs(血管活性腸肽和相關(guān)肽)、促生長素抑制素、多巴胺、促胃動素、糊精、緩激肽、CGRP(降鈣素基因相關(guān)肽)、白三烯、胰抑制素、前列腺素樣激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、腎上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ GROr、NAP-2、ENA-78、PE4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、MANTES、等)、內(nèi)皮肽、腸抑胃泌素、組胺、神經(jīng)降壓素、TRH、胰多肽和galanin；(21)按(9)和(14)至(20)中所述篩選方法之一獲得的化合物或其鹽；(22)包含如(21)中所述之化合物或其鹽的藥物組合物；(23)如(10)中所述的藥盒，其包括含有如(1)中所G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞；(24)如(10)中所述的藥盒，其包括含有如(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞膜部分；(25)使用(10)、(23)或(24)中所述的藥盒獲得的化合物或其鹽；(26)包含(25)中所述化合物或其鹽的藥物組合物；以及(27)檢測如(1)中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或如(2)中所述部分肽或其鹽的方法，其包括使(12)中所述的抗體與(1)中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或(2)中所述的部分肽或其鹽接觸。
附圖的簡要說明圖1顯示以PCR擴(kuò)增技術(shù)從人杏仁核得到的新的受體蛋白質(zhì)cDNA克隆p63A2的5’側(cè)部分核苷酸序列，以及由其編碼的氨基酸序列。劃下線部分相當(dāng)于用于PCR擴(kuò)增的合成引物。
圖2顯示經(jīng)PCR擴(kuò)增從人杏仁核得到的新的受體蛋白質(zhì)cDNA克隆p63A2的3’側(cè)部分核苷酸序列，以及由其編碼的氨基酸序列。劃下線部分相當(dāng)于用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增的合成引物。
圖3顯示基于圖1所示氨基酸序列制作的疏水性曲線圖。根據(jù)該圖，揭示其中存在由1至3指示的疏水區(qū)域。
圖4顯示基于圖2所示氨基酸序列制作的疏水性曲線圖。根據(jù)該圖，提前其中存在由4至6指示的疏水區(qū)域。
圖5顯示經(jīng)分析p63A2編碼的新的受體蛋白質(zhì)cDNA所得到的部分氨基酸序列，并與由小鼠T細(xì)胞衍生的糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(P30731)的部分氨基酸序列相比較。涂暗部分指示相同的氨基酸殘基。
圖6顯示為了以RACE方法進(jìn)行克隆而制備的p63A2特異性引物，得自人下丘腦的新的受體蛋白質(zhì)cDNA的未知序列區(qū)域，以及引物的λgt11上的定位。
圖7顯示對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析所得到的結(jié)果，其中擴(kuò)增產(chǎn)物是使用圖6中所示引物的不同組合經(jīng)RACE制得的。
圖8顯示使用p63A2特異性序列作為探針對圖7中所示的多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行southern雜交所得到的結(jié)果。該圖提示存在如箭頭所指示的帶有p63A2特異性序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖9顯示在以RACE方法從人下丘腦得到之cDNA的5’末端區(qū)域核苷酸序列和由小鼠T細(xì)胞衍生之糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)GIR(P30731)的相應(yīng)核苷酸序列不同進(jìn)行同源性檢索的結(jié)果。方框內(nèi)包括的部分為各個可能作為轉(zhuǎn)譯起始密碼子的序列，橢圓內(nèi)包括的部分為各個可能作為轉(zhuǎn)譯終止密碼子的序列。劃雙下線的部分為用于擴(kuò)增整個開放讀框之引物序列。該圖還提示，在相當(dāng)于小鼠GIR起始密碼子之附近的部分中還存在一個可能作為以RACE方法擴(kuò)增的cDAN中的起始密碼子的序列。
圖10顯示對以RACE方法從人下丘腦得到之cDNA的3’末端區(qū)域核苷酸和小鼠GIR之相應(yīng)核苷酸序列間進(jìn)行同源性檢索所得到的結(jié)果。該圖所示結(jié)果提示，與小鼠GIR相比較，所得cDNA的3’末端區(qū)域沒有達(dá)到轉(zhuǎn)譯終止密碼子處。
圖11圖樣顯示如基于圖9和圖10中所示核苷酸序所估計(jì)的，從人下丘腦得到之cDNA的開放讀框的未知序列區(qū)域。
圖12顯示對用3’AmpliFINDER RACE方法從人腦cDNA得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果。
圖13顯示使用p63A2特異性序列作為探針為圖12中所示的多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交的結(jié)果。從該圖中看出，存在有如箭頭指示的具有p63A2特異性序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖14顯示在以3’AmpliFINDER RACE方法從總?cè)四Xpoly(A)+RNA得到之cDNA的3’末端區(qū)域核苷酸序列和小鼠GIR的相應(yīng)序列之間進(jìn)行同源性檢索的結(jié)果。橢圓內(nèi)所包括的部分指示可能作為轉(zhuǎn)譯終止密碼子的序列。劃雙下線的部分指示用于全長度開放讀框擴(kuò)增的引物序列。從該圖中看出，在小鼠GIR的終止密碼子付近存在可能作為cDNA中之終止密碼子的序列。
圖15顯示含有63A2full之全長度開放讀框的擴(kuò)增產(chǎn)物，所說的擴(kuò)增產(chǎn)物是使用基于用9中所示5’非翻譯區(qū)和圖14所示3’非翻譯區(qū)的核苷酸序列制備的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。
圖16和圖17顯示經(jīng)亞克隆圖15中所示的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所得到的p63A2 full編碼之受體蛋白質(zhì)cDNA的完整開放讀框的核苷酸序列，以及由所說的序列編碼的氨基酸序列。
圖18顯示基于圖16和17中所示氨基酸序列制得的疏水性曲線圖。根據(jù)該圖，提示存在由I到VII指示的七個疏水區(qū)域。
圖19顯示p63A2 full編碼的氨基酸序列與小鼠GIR編碼的氨基酸序列之間的比較。劃暗影部分指示相同的氨基酸殘基。
本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)可以是衍生于人和例如豚鼠、大鼠、小鼠、豬、羊、牛、猴等其他溫血動物的杏仁核、腦垂體、胰脫、腦、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、肺、消化道、血管、心臟、胸腺、脾、白細(xì)胞等各種組織或細(xì)胞的任何G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，并包括如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上的等同物。因此，本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)中除了包括有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)外，還包括與SEQ ID NO1的氨基酸序列有90％以上，較好有95％以上氨基酸序列同源性，并且與包含SEQ ID NO1之氨基酸序列的蛋白質(zhì)在至少一種生物學(xué)活性上有定性上實(shí)質(zhì)等同活性的那些蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)所具有的定性上實(shí)質(zhì)等同的活性可以包括配體結(jié)合活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。術(shù)語“實(shí)質(zhì)等同的”是指配體結(jié)合活性等性質(zhì)是等同的。因此，既使在例如配體結(jié)合活性的強(qiáng)度和受體蛋白質(zhì)的分子量等方面強(qiáng)度上有所差異也是允許的。
優(yōu)選地，G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)包括人杏仁核衍生的具有如SEQID NO1所示氨酸基酸序列的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)還包括突變體如其中從SEQ ID NO1的氨基酸序列中刪除了1-30個氨基酸殘基，較好1至10個氨基酸殘基，最好幾個氨基酸殘基的缺失蛋白質(zhì)，和其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列上加入1至30個氨基酸殘基，較好1至10個氨基酸殘基，最好幾個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，以及其中用一個或多個其他氨基酸殘基取代SEQ ID NO1的氨基酸序列中1至30個氨基酸殘基、較好1至10個氨基酸殘基，最好幾個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)和它們的組合。在一個實(shí)施方案中，刪除了跨膜區(qū)。
此外，G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)還包括其中N末端Met已用C1-6酰基例如甲?；蛞阴；缺Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)起來的蛋白質(zhì)、其中Glu的N末端側(cè)已在體內(nèi)被切割而形成焦谷氨酰胺的蛋白質(zhì)、其中任何相關(guān)結(jié)構(gòu)氨基酸的側(cè)鏈已被保護(hù)的蛋白質(zhì)，和連接擴(kuò)鏈后得到的復(fù)合蛋白質(zhì)如糖蛋白。
G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的鹽包括與生理上可接受的堿例如堿土金屬或酸例如有機(jī)或無機(jī)酸形成的鹽，并且較好是生理上可接受的酸加成鹽。這些鹽例如包括與鹽酸、磷酸、氫硼酸或硫酸等無機(jī)酸形成的鹽，以及與乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸或苯磺酸等有機(jī)酸形成的鹽。
可用本領(lǐng)域已知的純化技術(shù)，或如下文所述的培養(yǎng)攜帶有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA編碼序列的轉(zhuǎn)化體等方法，從人或其他溫血動物的組織或細(xì)胞中生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽。也可以按照下文所述的肽合成方法生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。
G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽可以包括例如含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部分，即暴露在細(xì)胞模外部位的片段。部分肽可以是含有一個如在對G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水圖形分析時見到的(如圖17中所示的)細(xì)胞外區(qū)域(親水區(qū))的片段，例如包括從第一位Met到第91位Leu之氨基酸序列的肽。此外，也可以使用部分地含有例如從SEQ ID NO1中第92位Val到第300位Leu，或者從SEQ ID NO1中第301位Phe到第423位Ser的片段。在一個實(shí)施方案中，也可使用含有各個區(qū)域的肽，另外，還可使用同時含有多個區(qū)域的肽。在一個實(shí)施方案中，人們可以使用除SEQ ID NO3(Val-Cys-His-Val-Ile-Phe-Lys-Asn-Gln-Arg-Met-His-Ser-Ala-Thr-Ser-Leu-Phe-Ile-Val-Asn-Leu-Ala-Thr-Pro-Phe-Thr-Leu-Val-Arg-Phe-Val-Asn-Ser-Thr-Trp-Ile-Phe-Gly-Lys-Gly-Met-Cys-His-Val-Ser-Arg-Phe-Ala-Glu-Tyr-Cys-Leu-His-Val-Ser-Ala-Leu-Thr)及其部分外的SEQ ID NO1的任何肽片段。人們也會使用cDNA區(qū)段SEQ ID NO5(274-483堿基)或其部分。優(yōu)選地人們不應(yīng)使用少于16個氨基酸殘基的230～300氨基酸殘基(SEQ ID NO4)的肽片段。同樣，在此區(qū)域(堿基688-900)(SEQID NO6)中，人們不應(yīng)使用少于48個堿基對的cDNA區(qū)段。
在另一實(shí)施方案中，當(dāng)與相應(yīng)的小鼠蛋白質(zhì)相比時，該肽片段應(yīng)含有人蛋白質(zhì)所獨(dú)有的氨基酸殘基。見圖19。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽片段的長度為至少16個氨基酸，優(yōu)選至少20個氨基酸，更優(yōu)選至少25個氨基酸。
G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽的鹽可以是與提到的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的鹽相同類型的鹽。
可以用本領(lǐng)域已知的肽合成方法或用以適當(dāng)?shù)碾拿盖懈頖蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的方法生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽。肽合成方法可以是固相合成法和/或液相合成法。因此，可以將部分肽或能夠構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸與其殘余部分相縮合來生產(chǎn)目的肽，并且當(dāng)產(chǎn)物帶有保護(hù)基因時可以從所需肽上除掉保護(hù)基團(tuán)。用于縮合和去保護(hù)的已知技術(shù)包括下列文獻(xiàn)(1)-(5)中所述的方法。
(1)M.Bodanszky and M.A.Ondetti，Peptide Synthesis(肽合成)，Interscience Publishers，New York，1996(2)Schroeder and Luebke，The Peptide(肽)，Academic Press，NewYork，1965(3)Nobuo Izumiya et al.，F(xiàn)undementals and Experiments inPeptide Synthesis(肽合成的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn))，Maruzen，1975(4)Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara，BiochemicalExperiment Series(生化學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng))1，Protein Chemistry(蛋白質(zhì)化學(xué))IV，205，1977(5)Haruaki Yajima(ed.)，Development of Drugs-Continued，14，Peptide Synthesis(肽合成)，Hirokawa Shoten反應(yīng)后，可聯(lián)合使用例如溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析和重結(jié)晶等常規(guī)的純化技術(shù)以純化和分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)。當(dāng)按上述方法分離的蛋白質(zhì)是游離化合物時，可用已知方法將其轉(zhuǎn)變成適當(dāng)?shù)柠}。而當(dāng)分離的產(chǎn)物是鹽時，則可以用已知方法將其轉(zhuǎn)變成游離肽。
編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA可以是編碼具有SEQID1所示氨基酸序列之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其實(shí)質(zhì)上的等同物的DNA。也可以是人基因組DNA、人基因組DNA文庫、人組織或細(xì)胞衍生的cDNA、人組織或細(xì)胞衍生的cDNA文庫及合成的DNA中的任何一種。這些文庫的載體可以包括噬菌體、質(zhì)粒、粘粒和噬菌粒。此外，可以使用從組織或細(xì)胞制備的mRNA組分，以RT-PCR方法進(jìn)行直接擴(kuò)增。
更具體地說，編碼包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人杏仁核衍生之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA可以是其中含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列或其部分核苷酸序列，例如SEQ ID NO2中第1至第273位，第274至第900位、或第901位至第1269位核苷酸序列的DNA。
此外，可以使用編碼上述部分蛋白質(zhì)如16個氨基酸的片段，突變體，單個或多個區(qū)域肽之DNA。
另外，可以使用能與所說的DNA雜交的DNA。雜交體DNA是編碼與SEQ ID NO1的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)有相似活性之蛋白質(zhì)的DNA。
可用多種方法克隆完全編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA，例如可以使用具有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之部分核苷酸序列的合成的DNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者使用插入到適當(dāng)載體中并標(biāo)記的DNA與含有人衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之部分或全部區(qū)域的DNA片段或合成的DNA進(jìn)行雜交。典型地可以按照Molecular Cloning[分子克隆](2nd，ed.，J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中所述的方法進(jìn)行雜交。在使用商品文庫時，可以按照其所附帶的手冊中的說明書進(jìn)行操作。
根據(jù)使用的目的不同，可以直接使用，或在用限制性酶消化后或加入接頭后使用克隆的編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA。該DNA在5’末端具有作為翻譯起始密碼子的ATG，并可在3’末端具有作為終止密碼子的TAA、TGA或TAG。可以借助適當(dāng)?shù)腄NA銜接頭加入翻譯起始和終止密碼子。
例如可以(a)從本發(fā)明編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA中切掉靶DNA片段，并且(b)將把DNA片段連接在適當(dāng)表達(dá)載體中啟動子的下游側(cè)。從而得到G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。
載體可以包括衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒，例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等；衍生于枯草芽胞桿菌的質(zhì)粒，例如pUB110、pTP5、pC194等；衍生于醇母的質(zhì)粒；例如pSH19、pSH15等；噬菌體例如入噬菌體，以及動物病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒如牛痘病毒或鳥痘病毒，皰疹病毒和桿狀病毒。
根據(jù)本發(fā)明，只要與用來表達(dá)基因的宿主細(xì)胞相容，任何啟動子均可使用。當(dāng)用于轉(zhuǎn)化的宿主是大腸桿菌時，啟動子較好是trp啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子等。當(dāng)用于轉(zhuǎn)化的宿主是芽胞桿菌時，啟動子較好是SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。當(dāng)宿主是酵母時，啟動子較好是PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。當(dāng)宿主是動物細(xì)胞時，所用的啟動子包括SV40衍生的啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMA)啟動子、SRα啟動子等。為表達(dá)目的產(chǎn)物，可有效地利用增強(qiáng)子。
再者，必要時可在G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的N端側(cè)加上宿主相容的信號序列。當(dāng)宿主是大腸桿菌時，可利用的信號序列包括堿性磷酸酶信號序列、OmpA信號序列等。當(dāng)宿主是芽胞桿菌時，可利用α-淀粉酶信號序列、枯草蛋白酶信號序列等。當(dāng)宿主是酵母時，可利用交配因子α信號序列、轉(zhuǎn)化酶信號序列等。當(dāng)宿主是動物細(xì)胞時，可利用胰島素信號序列、α干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
使用如此構(gòu)建的攜帶本發(fā)明編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA的載體來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染體。宿主例如可以是埃希氏桿菌屬微生物、芽胞桿菌屬微生物、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等。埃希氏桿菌屬和芽胞桿菌屬微生物包括大腸桿菌K12.DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.60，160(1981))、JA221(J.of Molecular Biology(分子生物學(xué)雜志)，Vol.120，517(1978))、HB101(J.of Molecular Biology(分子生物學(xué)雜志)，Vol，41，459(1969))、C600(Genetics(遺傳學(xué))，Vol.39，440(1954))等。芽胞桿菌屬微生物包括枯草芽胞桿菌MI114(Gene(遺傳)，Vol.24，255(1983))、207-21(J.of Biochemistry(生物化學(xué))，Vol.95，76(1984))等。
酵母可以是釀酒酵母AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。昆蟲可以是蠶(Bombyx mori幼蟲)(Maeda et al.，Mature，Vol.315，592(1985))等。宿主動物細(xì)胞可以是猴衍生的細(xì)胞系、COS-7、Vero、中國倉鼠卵細(xì)胞系(CHO細(xì)胞)、DHFR基因缺陷性中國倉鼠細(xì)胞系(dhfr-CHO細(xì)胞)、小鼠L細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞，人FL等。
根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞不同，可使用適合于這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，2110(1972)、Gene，Vol.17，107(1982)等文獻(xiàn)中公開的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌?？梢园凑绽鏜olecular&General Genetics，Vol.168，111(1979)等文獻(xiàn)中所述的方法轉(zhuǎn)化芽胞桿菌屬微生物?？梢园凑绽鏟roc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.75，1929(1978)等文獻(xiàn)中公開的方法轉(zhuǎn)化酵母?？梢园凑绽鏐io/Technology，6，47-55(1988)中描述的方法轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞。可以按照例如Virology，Vol.52，456(1973)等文獻(xiàn)中公開的方法轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞。按照上面提到的技術(shù)生產(chǎn)其中包藏有攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)編碼DNA之表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染子。
可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的埃希氏桿菌屬或芽胞桿菌屬微生物作為宿主的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)染體)。培養(yǎng)基可含有轉(zhuǎn)化體生長所必需的碳源、氦源、礦物質(zhì)等。碳源可以包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等、氮源可包括銨盤、硝酸鹽、玉米浸滄液的濃縮液、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、豆餅、馬鈴薯浸膏等有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)。也可以進(jìn)一步加入酵母，維生素、生長促進(jìn)因子等。希望培養(yǎng)基的pH值約在5至8之間。
埃希氏桿菌屬微生物的培養(yǎng)基較好是含有例如葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基(Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)。可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加例如3β-吲哚基為烯酸等藥物以改善啟動子的效率。在培養(yǎng)埃希氏桿菌的情況下，通常于大約15至40℃培養(yǎng)大約3至24小時。必要時進(jìn)行通氣和攪拌。在培養(yǎng)芽胞桿菌宿主時，通常于大約30至40℃培養(yǎng)大約6至24小時。必要時也可進(jìn)行通氣和攪拌。在培養(yǎng)以酵母為宿主的轉(zhuǎn)化體時，可使用Burkholder基本培養(yǎng)基(Bostian，K.L.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，4505(1980))、含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基(Bitter，G.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，5330(1984))等。培養(yǎng)基的pH較好調(diào)到大約5至8。通常于大約20至35℃培養(yǎng)大約24至72小時。必要時可進(jìn)行通氣和攪拌。在培養(yǎng)其中宿主為昆蟲的轉(zhuǎn)化體的情況下，所用的培養(yǎng)基可包括向Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.，Nature，195，788(1962))內(nèi)加入純化的(或固定化的)10％牛血清等適當(dāng)添加劑所得到的培養(yǎng)基。最好將培養(yǎng)基的pH調(diào)到大約6.2至6.4。培養(yǎng)通常于大約27℃下進(jìn)行大約3至5天。必要時可進(jìn)行通氣和攪拌。在培養(yǎng)其中宿主為動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體的情況下，所用的培養(yǎng)基可包括MEM培養(yǎng)基(Science，Vol.122，501(1952))、DMEM培養(yǎng)基(Virology，Vol.8，396(1959))、RPMI1640培養(yǎng)基(J.of the American Medical Association，Vol.199，519(1967))、199培養(yǎng)基(Proceedings of the Society of the BiologicalMedicine，Vol，73，1(1950))等，其中含有例如大約5-20％的胎牛血清。pH值最好是大約6至8。培養(yǎng)通常是在大約30至40℃下進(jìn)行約15到60小時。必要時可更換培養(yǎng)基、通氣和攪拌。
可以按照如下文所述的方法從上述培養(yǎng)物中分離并純化G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。
為了從培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞中提取G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，在培養(yǎng)后用已知方法收集微生物或細(xì)胞，將其懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中，用超聲波、溶菌酶和/或凍融法等破碎細(xì)胞，然后經(jīng)離心或過濾得到G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的提取物。也可以使用其他的常規(guī)提取或分離方法。緩沖液可含有尿素或鹽酸胍等蛋白變性劑，或Triton X-100(注冊商標(biāo)，以下常稱之為“TM”等表面活性劑)。
如果G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)是分泌到培養(yǎng)基中的，則在培養(yǎng)完成后從微生物或細(xì)胞中分離出上清液并用已知方法收集所得到的上清液。可通過已知的離析、分離和純化方法的適宜組合純化含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物上清液及提取物。已知的離析、分離和純化方法可包括利用溶解度的方法，例如鹽析法或溶劑沉降法，主要利用分子大小或重量差異的方法，例如透析、超濾、凝膠過濾或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用電荷差異的方法例如離子交換層析，利用特異親和性的方法例親和層析，利用疏水性質(zhì)之差異的方法例如反相高效液相層析，以及利用等電點(diǎn)差異的方法例如等電聚焦電泳等。
如果所得到的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)是游離形式的，可用已知方法或與之類似的方法將游離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成其鹽。反之，如果所得到的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)是鹽形式的，可用已知的方法或類似的方法將蛋白質(zhì)鹽轉(zhuǎn)變成游離蛋白質(zhì)或任何其他蛋白質(zhì)鹽。
可隨意地修飾由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，或者在純化前或純化后在適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)修飾酶的作用下從蛋白質(zhì)上去掉一部分多肽。蛋白質(zhì)修飾酶可包括胰蛋白酶、胰凝膠蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。可以通過試驗(yàn)與標(biāo)記之配體的偶聯(lián)(或結(jié)合)，或者使用特異性抗體以酶免疫檢測法(酶聯(lián)免疫檢測法)來檢測如此生成之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的活性。
以下描述生產(chǎn)本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(63A2full)的典型實(shí)例。
(1)構(gòu)建用于動物細(xì)胞中的表達(dá)載體，該載體含有作為插入片段的63A2 full編碼cDNA的全長度開放讀框。
用限制性酶Sa1I消化按下文實(shí)施例2中提到的方法制得的質(zhì)粒p63A2full，從而切下63A2full編碼cDNA的全長度開放讀框。將此序列與按同樣方式用sa1I消化并進(jìn)一步用BAP(細(xì)菌堿性磷酸酶)處理的防止自環(huán)化的用于動物細(xì)胞中的表達(dá)載體PAKKO-111或相似載體進(jìn)行連接。
連接反應(yīng)完成后，用一部分反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5或類似菌株。在所得到的轉(zhuǎn)化體中，借助限制性酶裂群進(jìn)行基因圖譜分析，或通過核苷酸序列測定來選擇一株攜帶有含63A2full編碼cDNA之重組載體的重組體菌株，并大量制備質(zhì)粒DNA，其中所說的cDNA就已預(yù)先摻入pAKKO-111中的啟動子例如SRα來說，它是以正向插入的。
(2)制備用來表達(dá)新的G蛋白偶聯(lián)受體63A2full的CHO細(xì)胞使用例如基于磷酸鈣方法或脂質(zhì)體方法將基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)的藥盒，將上文(1)中制備的表達(dá)載體DNA導(dǎo)入CHO dhfr-細(xì)胞中。盡管原始CHOdhfr-細(xì)胞不能在無核酸培養(yǎng)基上生長，但含有已在其中導(dǎo)入之表達(dá)載體的細(xì)胞則可以生長于無核酸培養(yǎng)基上?；谶@一特征，使用經(jīng)向無核酸培養(yǎng)基內(nèi)加入透析過的胎牛血清而制備的選擇性培養(yǎng)基，選擇已在其中導(dǎo)入了cDNA的細(xì)胞。然后，從基于其可在選擇性培養(yǎng)基上生長而選擇的細(xì)胞中制備poly(A)+RNA部分，然后再例如使用市售藥盒制備cDNA，并使用如實(shí)施例2中所示的引物進(jìn)行RT-PCR?？蓹z測由RT-PCR產(chǎn)生的特異性帶以證實(shí)63A2full在這些細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。在添加有10％經(jīng)透析之胎牛血清和適當(dāng)抗生素的α-MEM(無核酸)培養(yǎng)基中，于37℃和5％CO2加95％空氣的條件下培養(yǎng)所選擇的CHO細(xì)胞，從而在CHO細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生63A2full受體蛋白質(zhì)。
(3)制備新的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)63A2full受體蛋白質(zhì)。
使用能夠表達(dá)63A2full受體的CHO細(xì)胞或人或動物組織或培養(yǎng)的細(xì)胞作為材料，用已知的溶解和層析技術(shù)純化63A2full受體蛋白質(zhì)。在使用能夠與63A2full受體結(jié)合的配體或抗63A2full受體蛋白質(zhì)或其肽片段之抗體的情況下，能夠以良好的效率檢測到含在各個層析部分中的63A2full受體蛋白質(zhì)。
更具體地說，將用適當(dāng)?shù)墓ぞ邩?biāo)記的配體結(jié)合到63A2full受體上，然后用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ箖烧呓宦?lián)，并以標(biāo)記物作為鑒定指征來純化63A2full受體蛋白質(zhì)。另外，通過引起抗63A2full受體之抗體的結(jié)合來制備抗體柱并使用所說的柱進(jìn)行免疫親和層析，可以更為有效地獲得63A2full受體蛋白質(zhì)。再者，使用所說的抗體，可以借助例如EIA、RIA或Western印跡法量性地檢測出包含在各個層析部分的63A2full受體蛋白質(zhì)，并且可以用此定量結(jié)果作為純化的指標(biāo)，進(jìn)一步說，也有可能使結(jié)合63A2full受體蛋白質(zhì)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與信息傳遞系統(tǒng)的各種分子整合，以盡可能地保留之。換句話說，為了篩選出63A2full受體的激動劑或拮抗劑，不一定要得到絕對純的63A2full受體，而只得到膜組分、溶解產(chǎn)物或部分純化的產(chǎn)物即可。
G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、其部分肽和G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)編碼DNA可以用于1)檢測本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體，2)制備抗體和抗血清，3)構(gòu)建用于表達(dá)重組受體蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，4)使用上述開發(fā)系統(tǒng)建立受體結(jié)合試驗(yàn)系統(tǒng)并篩選藥物候選化合物，5)基于對具有相似或模擬結(jié)構(gòu)的配體和受體的比較設(shè)計(jì)藥物，6)制備用于分析基團(tuán)的探針及制備PCR引物，7)基團(tuán)操作治療。
具體地說，有可能借助受體結(jié)合試驗(yàn)系統(tǒng)(該系統(tǒng)則使用一個用于表達(dá)重組G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的系統(tǒng))來篩選對溫血動物例如人特異的G蛋白偶聯(lián)受體激動劑或拮抗劑。如此篩選或鑒定的激動劑或拮抗劑可適于各種應(yīng)用，其中包括預(yù)防和/或治療各種疾病。
以下描述的是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、其部分肽或G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)編碼DNA及其抗體的應(yīng)用。
(1)檢測本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、其部分肽或其鹽可用作研究所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的試劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供了檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽與待檢化合物接觸，并測定試驗(yàn)化合物與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽的結(jié)合量、細(xì)胞刺激活性等。
待檢化合物可包括但不只限于已知的配體，例如血管緊張肽、鈴蟾肽、類大麻苷、縮膽囊肽、谷氨酰胺、血管緊張素、褪黑素、神經(jīng)肽Y、阿片樣肽、嘌呤、加壓素、催產(chǎn)素、VIPs(血管活性腸肽和相關(guān)肽)、促生長素抑制素、多巴胺、促胃動素、糊精、緩激肽、CGRP(降鈣素基團(tuán)相關(guān)肽)、白三烯、胰抑制素、前列腺素樣激素，凝血烷、腺嘌呤核苷、腎上腺素、α和β超化因子(例如IL-8、GROα、GROβGROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、內(nèi)皮肽、腸抑胃泌素、組胺、神經(jīng)降壓素、TRH、胰多肽、galanin、其經(jīng)過修飾的衍生物、其類似物、其家族成員等，而且還包括人或例如小鼠、大鼠、豬、牛、羊和猴等溫血動物的組織提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液等。例如，將所說的組織提取物、所說的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液等加到G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)中以檢測細(xì)胞刺激活性等，并依賴檢測結(jié)果對單個配體進(jìn)行分級分離，最后確定并得到之。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，所說的檢測配體的方法包括檢測某樣品(包括某種化合物或其鹽)是否能夠刺激靶細(xì)胞的方法，該方法包括在G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、其部分肽或其鹽的存在下，或者在受體結(jié)合試驗(yàn)系統(tǒng)(其中構(gòu)建并使用重組受體蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng))中，使所說的化合物與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合；并檢測受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性等。可被檢測的細(xì)胞刺激活性的例子包括刺激或抑制，例如釋放花生四烯酸代謝產(chǎn)物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、激活c-fos、降低細(xì)胞外pH等生物學(xué)反應(yīng)。所說的能夠通過與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的結(jié)合刺激細(xì)胞的化合物或其鹽包括肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物等。
在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方案中，所說的篩選和鑒定配體的方法包括1)篩選G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使標(biāo)記的試驗(yàn)化合物與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或它的部分肽或其鹽接觸，并檢測與所說的蛋白質(zhì)或其鹽，或與所說的部分肽或其鹽結(jié)合的標(biāo)記之試驗(yàn)化合物的量；2)篩選G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使標(biāo)記的試驗(yàn)化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或所說細(xì)胞的膜部分接觸，并檢測與所說的細(xì)胞或所說的膜部分結(jié)合之標(biāo)記的試驗(yàn)化合物的量，在這樣的方法中，DNA可用于制備含有G蛋白或其片段的細(xì)胞或細(xì)胞膜；3)篩選G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使標(biāo)記的試驗(yàn)化合物與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞體而在其細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸，并檢測與所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之被標(biāo)記試驗(yàn)化合物的量；4)篩選G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使試驗(yàn)化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，并檢測細(xì)胞刺激活性，例如對通過G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、活化c-fos、降低細(xì)胞外pH等生物學(xué)反應(yīng)的促進(jìn)或抑制活性；以及5)篩選G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，該方法包括使試驗(yàn)化合物與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞而在細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸，并檢測至少一種細(xì)胞刺激活性，例如促進(jìn)或抑制通過G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化，活化c-fos、降低細(xì)胞外pH等生理學(xué)反應(yīng)的活性。
以下描述的是篩選和鑒定配體之方法的特定實(shí)例。
首先，用于檢測配體之方法的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)可以包括含有上述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)、其部分肽或其鹽的任何材料，但更可取的是在動物細(xì)胞中表達(dá)大量的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。
在大量生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)中，可以使用上文提到的方法并通過在哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)所說的蛋白質(zhì)編碼DNA來完成之。就編碼細(xì)胞外表位、細(xì)胞外區(qū)域等特殊區(qū)域的DNA片段來說可以使用互補(bǔ)DNA，但表達(dá)方法不只限于此。例如，也可以使用基因片段或合成的DNA。
為了在宿主動物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的編碼DNA并有效地表達(dá)之，最好將所說的DNA片段摻入到衍生于核多角體病毒(其屬于桿狀病毒)的多角體啟動子、衍生于SV40的啟動子、衍生于逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、人熱休克啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、SRα啟動子等啟動子的下游?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知方法或基于本公開的相似方法檢測所表達(dá)之受體的數(shù)量和質(zhì)量。例如，可以使用Nambi，P.et al.，The Journal of Biochemical Society，Vol.267，19555-19559(1992)中所述的方法。
因此，就檢測配體來說，含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽的材料可以包括按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或其相似方法純化的含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的產(chǎn)物、所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的肽片段，含有所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞、含有所說受體蛋白質(zhì)之細(xì)胞的膜部分等。
當(dāng)在配體檢測方法中使用含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)時，可以用包括戊二醛、甲醛等結(jié)合劑固定所說的細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或與之相似的方法進(jìn)行固定化處理。
含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞是表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等微生物。
細(xì)胞膜部分是在破碎細(xì)胞后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或其相似方法制備的離合細(xì)胞膜的部分。破碎細(xì)胞的方法可以包括使用Potter-Elvehiem勻漿器擠壓細(xì)胞、用Waring搗碎器或由Kinematica制造的Polytron勻漿器破碎細(xì)胞、用超聲波破碎細(xì)胞，通過從小噴嘴吹出同時使用French擠壓器等施加壓力破碎細(xì)胞。在分級分離細(xì)胞膜時，主要使用依靠離心力的分級分離方法，例如分級離心分離和密度梯度離心分離。例如，可用低速度(500rpm到3,000rpm)和短時間(通常為1至10分鐘)離心分離出已破碎細(xì)胞的細(xì)胞液，然后進(jìn)一步以高速度(15,000rpm 30,000rpm)將上清液離心30分鐘至2小時并以所得到的沉淀物作為膜部分。所說的膜部分含有大量表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)和大量膜成分，例如衍生于細(xì)胞的磷脂和膜蛋白。
含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞膜部分中G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的量較好為每個細(xì)胞103至108個分子，最好每個細(xì)胞105至107個分子。順便提到的是，每個膜部分所表達(dá)的量越大，配體結(jié)合活性(比活性)就越高，從而便有可能構(gòu)建高敏感的篩選系統(tǒng)，并且得以在同一批內(nèi)檢測大量的樣品。
在完成上述的檢測能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之配體的方法時，適當(dāng)?shù)腉蛋白偶聯(lián)受體部分和標(biāo)記的試驗(yàn)化合物是必不可少的。G蛋白偶聯(lián)受體部分較好是天然存在的(天然型)G蛋白偶聯(lián)受體或具有等同于天然型G蛋白偶聯(lián)受體之活性的重組G蛋白偶聯(lián)受體。這里，術(shù)語“等同于…的活性”是指如上文中討論的實(shí)質(zhì)上等同的配體結(jié)合活性。
標(biāo)記的試驗(yàn)化合物包括用[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等標(biāo)記的上文中提到的待試化合物。
具體地說，按下述方法檢測能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合的配體首先將含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞膜部分懸浮在適合于該檢測方法的緩沖液中，以制備用于檢測與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之配體的受體樣品。緩沖液可以是pH4-10，較好pH6-8的Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液的任何緩沖液，只要它不抑制配體與受體的結(jié)合即可。另外，為了減少非特異性結(jié)合，可以向緩沖液內(nèi)加入CHAPS、Tween 80TM(Kao-Atlas，Japan)、毛地黃皂苷。脫氧膽酸鹽等去污劑、以及牛血清白蛋白(BSA)、明膠、牛奶衍生物等各種蛋白質(zhì)。再者，為了抑制蛋白酶對受體和配體的分解破壞作用，可以加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由Peptide Laboratory生產(chǎn))、胃酶抑制劑等蛋白酶抑制劑。在0.01至10ml所說的受體溶液中共同存在用預(yù)定(或一定)量(5,000cmp到500,000cpm)的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等標(biāo)記的試驗(yàn)化合物。為了弄清非特異性結(jié)合量(NSB)，還制備一個向其中加入很大過量未標(biāo)記試驗(yàn)化合物的反應(yīng)試管。反應(yīng)于0-50℃下，較好于4-37℃下進(jìn)行20分鐘至24小時，較好進(jìn)行30分鐘至3小時。反應(yīng)后，通過玻璃纖維濾器等過濾，用適當(dāng)量的同一緩沖液洗，并借助液體閃爍計(jì)數(shù)器或γ計(jì)數(shù)器測定玻璃纖維濾器中保留的放射活性。鑒定由總結(jié)合量(B)(大于0)中減去非特異性結(jié)合量(NSB)得到的試驗(yàn)化合物中的結(jié)合量(B-NSB)，即作G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的量。
在完成上述檢測能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合的配體的方法4)至5)時，可以用已知方法或從市場購得的檢測藥盒檢測由G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性，例如釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、激活c-fos、降低細(xì)胞外pH、激活G蛋白、細(xì)胞增殖等。更具體地說，首先是在多孔平板等裝置中培養(yǎng)含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
在進(jìn)行配體檢測時，于實(shí)驗(yàn)前用新鮮培養(yǎng)基或沒有顯示對細(xì)胞有毒性的適當(dāng)緩沖液替換之，并于適當(dāng)條件下和加入試驗(yàn)化合物后足夠長時間進(jìn)行培養(yǎng)。然后，提取細(xì)胞內(nèi)容物或回收上清液并用各種方法測定所得到的產(chǎn)物。當(dāng)由于細(xì)胞中含有降解酶而難以鑒定例如花生四烯酸等物質(zhì)(其為細(xì)胞刺激活性的指標(biāo))的產(chǎn)生時，可在加入所說酶的抑制劑后再進(jìn)行檢測。例如僅就對抗cAMP產(chǎn)生之抑制作用的活性而言，可以檢測對毛喉素等物質(zhì)處理的細(xì)胞產(chǎn)生cAMP的抑制作用，以增加cAMP產(chǎn)生。
用于檢測與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之配體的方法中的藥盒包含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽、含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞、從含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的膜部分等。
檢測配體之藥盒的實(shí)例如下。這些藥盒優(yōu)選在管形瓶中含有各種不同的成分?？蓪蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)和/或配體凍干以增加貯存壽命?？梢园枋鲆陨蠝y定的說明
1.用于檢測配體的試劑。
1)用于檢測的緩沖液和用于洗滌的緩沖液。
緩沖液產(chǎn)品是向Hank氏平衡鹽溶液(由Gibco生產(chǎn))內(nèi)加入0.05％牛血清白蛋白(由Sigma生產(chǎn))而制成的。
可使該產(chǎn)品通過一個0.45μm孔徑的膜濾器進(jìn)行除菌，并貯存于4℃下或者在使用時配制。
2)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)樣品。
在12孔平板中以5×105個細(xì)胞/孔的比率繼代培養(yǎng)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞，并在潮濕的5％CO2/95％空氣環(huán)境下37℃培養(yǎng)2天以制備樣品。
3)標(biāo)記的試驗(yàn)化合物。
用市售的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等標(biāo)記的或用適當(dāng)方法標(biāo)記的化合物。
將水溶液狀態(tài)的產(chǎn)物貯存于4℃至-20℃下，并在使用時用檢測緩沖液稀釋到1μm。在試驗(yàn)化合物幾乎不溶于水的情況下，可將其溶液于二甲基甲酰胺、DMSO、甲醇等有機(jī)溶劑中。
4)未標(biāo)記的試驗(yàn)化合物。
未標(biāo)記的化合物是以100至1,000倍濃縮狀態(tài)制備的同一化合物。
2.檢測方式1)用1ml檢測緩沖液將培養(yǎng)于12孔組織培養(yǎng)板中的表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞洗兩次，然后向各孔內(nèi)加入490μl檢測緩沖液。
2)加入5μl標(biāo)記的試驗(yàn)化合物并使混合物于室溫下反應(yīng)1小時。為了檢測非特異性結(jié)合量，加入5μl來標(biāo)記的試驗(yàn)化合物。
3)從各孔中除去反應(yīng)溶液，用1ml檢測緩沖液將其洗3次。將與細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的試驗(yàn)化合物溶解于0.2N NaOH-1％SDS中并與4ml由WAKO Pure Chemical，Japan生產(chǎn)的液體閃爍劑混合。
4)使用例如由Beckmann生產(chǎn)的液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測放射活性。
可與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合的配體包括出現(xiàn)或存在于腦、腦垂體等組織中的物質(zhì)。配體的例子有(血管緊張肽、鈴蟾肽、類大麻苷、縮膽囊肽、谷氨酰胺、血管緊張素、褪黑素、神經(jīng)肽Y、阿片樣肽、嘌呤、加壓素、催產(chǎn)素、VIPs(血管活性腸肽和相關(guān)肽)、促生長素抑制素、多巴胺、促胃動素、糊精、緩激肽、CGRP(降鈣素基因相關(guān)肽)、白三烯、胰抑制素、前列腺素樣激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、腎上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、內(nèi)皮肽、腸抑胃泌素、組胺、神經(jīng)降壓素、TRH、胰多肽等)。
(2)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)缺陷性疾病的預(yù)防和治療劑如果G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體是通過上述方法(1)揭示的，則可使用編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA作為預(yù)防和/或治療劑，依賴于所說配體發(fā)揮的作用治療所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)缺陷性疾病。
例如，當(dāng)一個病人因?yàn)轶w內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)降低而不能發(fā)揮配體的生理學(xué)作用時，可以增加所說病人腦細(xì)胞中的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的量，從而通過下述方法充分實(shí)現(xiàn)配體所應(yīng)有的作用(a)給病人投用編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA以表達(dá)之；或者(b)將表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA摻入所說病人的腦細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)。因此，可以將編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA作為一種安全并有較小毒性的預(yù)防和治療劑用于預(yù)防和治療G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)缺陷性疾病。
當(dāng)使用上述DNA作為治療和預(yù)防劑時，可以單獨(dú)使用所說的DNA或者在將其插入適當(dāng)?shù)妮d體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體，痘病毒等載體中后，對產(chǎn)物載體進(jìn)行常規(guī)藥劑學(xué)處理。DNA也可作為“裸露”DNA，加有助于攝取的佐劑，通過“基因”槍或通過導(dǎo)管如裝有水凝膠的導(dǎo)管來施用。例如，可將其制成片劑(必要時進(jìn)行糖衣包裹)、膠囊劑、酏劑、微膠囊等形式的口服藥劑，或者制成可注射形式的藥劑例如加在水中或其他醫(yī)藥上可接受的液體中制成無菌溶液或懸液?？梢詫⒈景l(fā)明的DNA與生理上可接受的載體、香味劑、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘結(jié)劑等混合，以一般制藥業(yè)中常用的方式制成上述這些單元劑量形式的制劑。這些制劑中活性成分的含量應(yīng)使適當(dāng)劑量定在一個特定范圍之內(nèi)。
可混合在片劑、膠囊劑中的添加劑包括例如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠等粘結(jié)劑，結(jié)晶纖維素等賦形劑、玉米淀粉、明膠和藻酸等膨脹劑，硬脂酸鎂等潤滑劑，蔗糖、乳糖和糖精等甜味劑，以及胡椒薄荷，akamono油和咖啡果等香味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時，上述材料中可進(jìn)一步摻入例如油和脂肪等液態(tài)載體?？梢允褂弥扑帢I(yè)中常用的方法配制注射用的無菌組合物，例如將活性成分、天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮于注射用水等載體中以制成藥物組合物。
注射用含水液體包括生理鹽水和含有葡萄糖及其他輔助劑例如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉的等滲溶液，并可與例如乙醇、多元醇如聚乙二醇和丙二醇等適當(dāng)?shù)闹軇⒗缇凵嚼娲减?0(TM)和HCO-50等非離子表面活性劑合用。油狀液體包括芝麻油和大豆油，并可與苯甲酸芐酯和苯甲醇等助溶劑合用。另外，也可以加入例如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液等緩沖液，殺藻胺、鹽酸普魯卡因等安慰劑，人血清白蛋白、聚乙二醇等穩(wěn)定劑，苯甲醇、苯酚等防腐劑，及抗氧劑等一起配制上述材料。如此制得的藥物組合物如可注射液體一般裝在適當(dāng)安瓶內(nèi)。因?yàn)檫@些制劑是很安全而且是低毒性的，所以可投用于人和大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗、猴等溫血動物。
根據(jù)病征程度的不同，成年人(體重60kg)口服給藥藥劑中所說DNA的劑量一般約為每天0.1-100mg，較好1.0-20mg。在非口服給藥時，根據(jù)給藥對象、靶器官、癥狀、給藥方法等的不同，對成年人(體重60kg)一般每天投用大約0.01-30mg，較好0.1-20mg，最好0.1-10mg可注射制劑形式的DNA。對于其他種動物，可投用換算為每60kg體重的相應(yīng)劑量。
如果希望使用G蛋白偶聯(lián)受體蛋白或其片段，則應(yīng)使用純化形式的，優(yōu)選至少90％的純度，更優(yōu)選至少95％的純度，進(jìn)一步優(yōu)選至少98％的純度，最優(yōu)選至少99％的純度?？捎萌缟纤龅闹苽銬NA的方法制備蛋白制劑。例如，可以使用含有諸如生理鹽水的含水液體的藥物組合物。蛋白質(zhì)的施用方法與DNA的施用方法相同，其劑量范圍也相同。
(3)定量檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體對配體有結(jié)合特性的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)能夠以良好的敏感性定量檢測體內(nèi)配體的量。
例如可與競爭分析法聯(lián)合完成這一定量檢測。為此，使待檢樣品與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽接觸，從而可以測定所說樣品中的配體濃度。在一個定量檢測的實(shí)施方案中，可以使用下列文獻(xiàn)1)和2)中所述的方法或與其相似的方法1)Hiroshi Irie(ed)“Radioimmunoassay”(Kodansha，Japan，1974)；和2)Hiroshi Irie(ed)“Radioimmunoassay，Second Series”(Kodansha，Japan，1979)。
(4)篩選能改變G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物可使用本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽?；蛘?，也可構(gòu)建重組G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)并使用以所說的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行受體結(jié)合試驗(yàn)的系統(tǒng)。在這些試驗(yàn)系統(tǒng)中，有可能篩選能夠改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物，例如肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、動物組織提取物或其鹽等。這些化合物包括表現(xiàn)有G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)之細(xì)胞刺激活性的化合物(所說的細(xì)胞刺激活性例如包括促進(jìn)或抑制釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電勢、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、活化c-fos、降低細(xì)胞外pH等生理學(xué)反應(yīng)的活性，所謂“G蛋白偶聯(lián)受體激動劑”，沒有這種細(xì)胞刺激活性的化合物，所謂“G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑”等。術(shù)語“改變配體的結(jié)合活性”包括配體的結(jié)合受到抑制和配體的結(jié)合受到促進(jìn)這兩種情況。
因此，本發(fā)明提供篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)蛋白質(zhì)或其鹽之結(jié)合活性的化合物的方法，特征在于其包括以下兩種情況(i)其中配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或其部分肽或其鹽接觸；以及(ii)其中配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或部分肽或其鹽及所說試驗(yàn)化合物的混合物接觸。
在所說的篩選方法中，本發(fā)明的一個特征在于與所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合之配體的量、配體的細(xì)胞刺激活性等是分別在下列兩種情況下檢測的(i)配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽接觸，以及(ii)配體和試驗(yàn)化合物與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽接觸，然后將兩種情況下檢測的結(jié)果進(jìn)行比較。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，提供了下述方法1)篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，特征在于當(dāng)被標(biāo)記的配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽接觸時，并且當(dāng)被標(biāo)記的配體和試驗(yàn)化合物與G蛋白偶聯(lián)受體化合物或其部分肽接觸時，檢測并比較與所說的受體蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽結(jié)合的被標(biāo)記的受體的量；2)篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物的方法，特征在于當(dāng)被標(biāo)記的配體與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或所說細(xì)胞的膜部分接觸時，并且當(dāng)被標(biāo)記的抗體和試驗(yàn)化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或所說細(xì)胞的膜部分接觸時，檢測并比較與所說的蛋白質(zhì)或其部分肽或其鹽結(jié)合的被標(biāo)記配體的量；3)篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，特征在于當(dāng)被標(biāo)記配體與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化體而在其細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸時，并且當(dāng)被標(biāo)記的配體和試驗(yàn)化合物與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化體而在細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸時，檢測并比較與所說的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之被標(biāo)記配體的量；4)篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，特征在于當(dāng)激活G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)細(xì)胞接觸時，并且當(dāng)激活G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物和試驗(yàn)化合物與含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸時，檢測并比較所產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性，例如促進(jìn)或抑制包括釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化、激活c-fos、降低細(xì)胞外pH等生理學(xué)反應(yīng)的活性；以及5)篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，特征在于當(dāng)激活G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化體而在細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸時，以及當(dāng)激活G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的化合物和試驗(yàn)化合物一起與通過培養(yǎng)攜帶G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之編碼DNA的轉(zhuǎn)化體而在細(xì)胞膜上表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)接觸時，檢測并比較所產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性，例如促進(jìn)或抑制生理學(xué)反應(yīng)的活性；其中所說的生理學(xué)反應(yīng)包括釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生cGMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化、激活c-fos、降低細(xì)胞外pH等。
為了篩選G蛋白偶聯(lián)受體激動劑或拮抗劑。首先必須使用從大鼠或小鼠等衍生的含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織或細(xì)胞膜部分獲得候選化合物(初步篩選)，然后確認(rèn)候選化合物是否真的抑制人G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)和配體之間的結(jié)合(二級篩選)。必然存在其他一些受體蛋白質(zhì)，并且當(dāng)使用細(xì)胞、組織或細(xì)胞膜部分時，它們在固有性質(zhì)上使之難以篩選出所需受體蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑。但由于使用人衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，就沒有必要進(jìn)行初步篩選，從而有可能有效地篩選出改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體之間的結(jié)合活性的化合物。此外，也有可能估測被篩選的化合物是否為G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)激動劑或G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑。當(dāng)研究G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)激動劑或G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)拮抗劑并將其開發(fā)為人用藥物時，有必要使用人衍生的受體蛋白質(zhì)將其篩選出來，因?yàn)榻?jīng)篩選得到之化合物的不同效應(yīng)是由受體本身的種間屬異造成的。
具有強(qiáng)激動劑或拮抗劑活性的化合物可通過研究化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，和設(shè)計(jì)或修飾化合物來獲得。在這種情況下，如果能夠使用人衍生的受體，則能容易地進(jìn)行作為人類醫(yī)藥有效的適宜化合物的設(shè)計(jì)和評估。然而，如果使用動物衍生的受體篩選激動劑或拮抗劑，則一般不能得到對人具有強(qiáng)活性的化合物。
下文中給出對篩選方法的具體說明。
首先，就用于本發(fā)明篩選方法的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)來說，只要其含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)包括被取代的、被刪除的或被加入的蛋白質(zhì)或其部分肽，任何產(chǎn)物均可使用，但優(yōu)選的是使用哺乳動物器官的膜部分。然而，人器官可能極難得到，因此使用以重組技術(shù)大量表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選是優(yōu)選的。
在生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)中可以使用上述方法。
生產(chǎn)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)時可使用上述方法并可通過在哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)編碼所說蛋白質(zhì)的DNA而實(shí)現(xiàn)之。就編碼特定區(qū)域如細(xì)胞外表位、細(xì)胞外區(qū)域等的DNA片段來說，可以使用互補(bǔ)DNA，但表達(dá)方法不只限于此。例如，也可以使用基因片段或合成的DNA。
為了在宿主動物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA并有效地表達(dá)之，較好將所說的DNA片段摻入到衍生于核多角體病毒(屬于桿狀病毒)的多角體啟動子、衍生于SV40的啟動子、衍生于逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、人熱休克啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、SRα啟動子等啟動子的下游側(cè)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或其基于本公開的相似方法檢測所表達(dá)之受體的量和性質(zhì)。例如，可使用Nambi，p.等人(The Journal ofBiochemical Society(生化學(xué)會雜志)，Vol.267，19355-19559(1982))所述的方法進(jìn)行這一檢測。
因此，就檢測配體來說，含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽的材料可包括含有按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或其相似方法純化的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的產(chǎn)物、所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的肽片段、含有所說G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞、含有所說蛋白質(zhì)之細(xì)胞的膜部分等。
當(dāng)在檢測配體的方法中使用含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞時，可用戊二醛、甲醛等試劑固定所說的細(xì)胞?？砂幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或與之相似的方法進(jìn)行固定化處理。
含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞是表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等微生物。
細(xì)胞膜部分是在破碎細(xì)胞后按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或與之相似的方法制備的富含細(xì)胞膜的部分。破碎細(xì)胞的方法包括使用Potter-Elvehjem勻漿器壓榨細(xì)胞、用Waring搗碎器或Kinematica制造的Polytron勻漿器破碎細(xì)胞，用超聲波破碎細(xì)胞、通過從小噴嘴吹出同時使用Franch擠壓器等施加壓力破碎細(xì)胞。在分級分離細(xì)胞膜時，主要使用依靠離心力的分級分離方法，例如分級離心分離和密度梯度離心分離。例如，可用低速度(500rpm到3,000rpm)和短時間(通常為1至10分鐘)離心分離出已破碎細(xì)胞的細(xì)胞液，然后進(jìn)一步以高速度(15,000rpm 30,000rpm)將上清液離心30分鐘至2小時并以所得到的沉淀物作為膜部分。所說的膜部分含有大量表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)和大量膜成分，例如衍生于細(xì)胞的磷脂和膜蛋白。
含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞膜部分中G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的量較好為每個細(xì)胞103至108個分子，最好每個細(xì)胞105至107個分子。順便提到的是，每個膜部分所表達(dá)的量越大，配體結(jié)合活性(比活性)就越高，從而便有可能構(gòu)建高敏感的篩選系統(tǒng)，并且得以在同一批內(nèi)檢測大量的樣品。
在完成上述的檢測能夠與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合之配體的方法時，適當(dāng)?shù)腉蛋白偶聯(lián)受體部分和標(biāo)記的試驗(yàn)化合物是必不可少的。G蛋白偶聯(lián)受體部分較好是天然存在的(天然型)G蛋白偶聯(lián)受體或具有等同于天然型G蛋白偶聯(lián)受體之活性的重組G蛋白偶聯(lián)受體。這里，術(shù)語“等同于…的活性”是指如上文中討論的實(shí)質(zhì)上等同的配體結(jié)合活性。
就標(biāo)記的配體來說，有可能使用標(biāo)記的配體，與標(biāo)記的配體相類似的化合物等。例如，可利用〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等標(biāo)記的配體以及其他被標(biāo)記的物質(zhì)。
具體地說，首先將含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞膜部分懸浮于適用于所選方法的緩沖液中，以制備用于篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)結(jié)合活性之化合物的受體樣品。就緩沖液來說，可以使用pH4-10，較好pH6-8的、不抑制配體與受體結(jié)合的任何緩沖液，例如Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
另外，為了減少非特異性結(jié)合，可以向緩沖液內(nèi)加入例如CHAPS、Tween80TM(Kao-Atlas，Japan)，毛地黃皂苷、脫氧膽酸鹽等表面活性劑。另外，為了抑制蛋白酶對受體和配體的分解破壞作用，可以加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由PeptideLaboratory，Japan生產(chǎn))、胃酶抑制劑等蛋白酶抑制劑。向0.01ml至10ml所說的受體溶液中加入一定量(5,000cpm至500,000cpm)的標(biāo)記配體，同時其中存在有10-4至10-10M的試驗(yàn)化合物。為了確定非特異性結(jié)合量(NSB)，還制備一個其中加入了大大過量的未標(biāo)記之試驗(yàn)化合物的反應(yīng)管。
反應(yīng)于0-50℃，較好于4-37℃下進(jìn)行20分鐘至24小時，較好進(jìn)行30分鐘至3小時。反應(yīng)后，通過玻璃纖維濾器、過濾紙等過濾，用適當(dāng)量的同一種緩沖液洗滌，并借助液體閃爍計(jì)數(shù)器或γ計(jì)數(shù)器測定保留于玻璃纖維濾器中的放射活性。假定從總結(jié)合量(B0)(其中不存在拮抗物質(zhì))中減去非特異性結(jié)合量(NSB)所得到的計(jì)數(shù)定為100％，即可例如選擇其中從總結(jié)合量(B)中減去非特異性結(jié)合量(NSB)所得到的特異性結(jié)俁量(B-NSB)小于50％的試驗(yàn)化合物作為本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的候選配體。
在進(jìn)行上述篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物的方法4)至5)時，可使用已知方法或使用市場上可購得的檢測藥盒檢測G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性，例如促進(jìn)或抑制生理學(xué)反應(yīng)的活性，所說生理學(xué)反應(yīng)包括釋放花生四烯酸代謝物、釋放乙酰膽堿、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+、產(chǎn)生cAMP、產(chǎn)生肌醇磷酸、改變細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化、活化c-fos、降低細(xì)胞外pH等。更具體地說，最初是在多孔平板或類似裝置中培養(yǎng)含有G蛋白偶聯(lián)受體化合物的細(xì)胞。
在進(jìn)行篩選時，預(yù)先要用對新鮮培養(yǎng)基或細(xì)胞未表現(xiàn)有毒性的適當(dāng)緩沖液取代之，于適當(dāng)?shù)臈l件下并在向其中加入試驗(yàn)化合物后保溫一定時間。提取所得到的細(xì)胞或回收上清液，并用某種方法檢測(最好是定量檢測)所得到的產(chǎn)物。當(dāng)由于細(xì)胞內(nèi)所含分解酶的存在難以鑒定那些指標(biāo)物質(zhì)，例如作為細(xì)胞刺激活性之指標(biāo)的花生四烯酸時，可以在加入對抗所說之分解酶的抑制劑后進(jìn)行檢測。對于活性如對cAMP產(chǎn)生的抑制作用來說，可以作為對抗細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生(其中固有產(chǎn)率已因加入毛喉素等抑制劑而得以增加)的抑制作用進(jìn)行檢測。
在通過測定細(xì)胞刺激活性進(jìn)行篩選時，表達(dá)適當(dāng)?shù)腉蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞是必不可少的。優(yōu)選的表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞是天然存在的含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(天然型G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì))的細(xì)胞系或細(xì)胞株例如小鼠T細(xì)胞WEHI-7TG等，以及上述表達(dá)重組型G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞系或細(xì)胞株等。
試驗(yàn)化合物包括肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動物組織提取物、血清、血液、體液等。所說的化合物可以是新的或已知的。
用于篩選可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽之結(jié)合活性的化合物的藥盒包含G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其部分肽，或含有G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞或其細(xì)胞膜部分。
篩選藥盒的實(shí)例如下1.篩選試劑1)檢測緩沖液和洗滌緩沖液緩沖液產(chǎn)品是向Hank氏平衡鹽溶液(Gibco生產(chǎn)的)內(nèi)加入0.05％牛血清白蛋白(由Sigma生產(chǎn)的)制成的。
該緩沖液通過一個孔徑為0.45m的膜濾器過濾除菌，貯存于4℃下備用或臨使用時制備。
2)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的樣品。
在12孔平板中以5×105個細(xì)胞/孔的比率繼代培養(yǎng)可表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞，并于37℃，在5％CO2和95％空氣環(huán)境下培養(yǎng)2天以制備樣品。
3)標(biāo)記的配體。
配體是用市售的〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等標(biāo)記的配體。
將水溶液狀態(tài)的產(chǎn)物貯存于4℃或-20℃，使用時用緩沖液稀釋到1m用于檢測。
4)標(biāo)準(zhǔn)配體溶液將配體溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(由Sigma生產(chǎn)的)的PBS中使之達(dá)到1mM，并貯存于-20℃。
2.檢測方法。
1)在12孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)CHO細(xì)胞以表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。用1ml檢測緩沖液將表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞洗兩次。然后向各孔內(nèi)加入490μl檢測緩沖液。
2)加入5μl濃度為10-3-10-10M的試驗(yàn)化合物溶液，再加入5μl標(biāo)記的配體并于室溫下反應(yīng)1小時。為了了解非特異性結(jié)合量，加入5μl濃度為10-3M的配體以替代試驗(yàn)化合物。
3)從孔中除去反應(yīng)溶液，用1ml檢測緩沖液洗3次。將與細(xì)胞結(jié)合的被標(biāo)記的配體溶解于0.2N NaOH-1％SDS中并與4ml液體閃爍劑A(例如由Wako Pure Chemical，Japan生產(chǎn)的)混合。
4)使用液體閃爍計(jì)數(shù)器(例如Beckmam的產(chǎn)品)檢測放射活性并按下更公式計(jì)算PMB(百分最大結(jié)合)PMB＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100其中PMB百分最大結(jié)合
B加入樣品時的測定值NSB非特異性結(jié)合Bo最大結(jié)合以上述篩選方法或篩選藥盒制得的化合物或其鹽是可改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物，其中該化合物抑制或促進(jìn)結(jié)合，更具體地說，其為具有通過G蛋白偶聯(lián)受體或其鹽介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性的化合物，即所謂“G蛋白偶聯(lián)受體激動劑”，或不具有所說的刺激活性的化合物，即所謂“ G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑”。所說的化合物可以是肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)物等，并且可以是新的或已知的。
所說G蛋白偶聯(lián)受體激動劑具有與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體一樣的生理學(xué)作用，并因此可依據(jù)所說的配體活性將其用作安全而又只有較少毒性的藥物組合物。
另一方面，所說的G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑能夠抑制G蛋白偶聯(lián)受體蛋白之配體的生理學(xué)活性，并因此可用作抑制所說配體活性的安全而又有較小毒性的藥物組合物。
上述G蛋白偶聯(lián)受體激動劑或拮抗劑可用作例如脊髓損傷、早老性癡呆、氣喘、飲食過多、神經(jīng)病、癡呆、疼痛、腦血栓、腦炎、腦梗塞、腦血管痙攣、脊椎炎、心絞痛、壞死、鴉片依賴癥、鴉片戒除綜合癥、精神分裂癥、恐怖癥、腦缺血性休克、可卡因依賴癥、可卡因戒除綜合癥、焦慮癥、抑郁癥、呼吸窘迫綜合癥、戒酒綜合癥、嘔吐、癲癇等疾病的預(yù)防和治療劑。
當(dāng)使用借助篩選方法或篩選藥盒得到的化合物或其鹽作為上述藥物組合物時，可按常規(guī)方法使用之。例如，可以以必要時包裹糖衣的片劑、膠囊、酏劑、微膠囊等劑型進(jìn)行口服用藥，或者以無菌溶劑和懸浮液(在水或其他藥用液體中)將可注射制劑形式進(jìn)行非口服用藥。可以將化合物或其鹽與生理上可接受的載體、香味劑、賦形劑、溶劑、抗菌劑、穩(wěn)定劑、粘結(jié)劑等混合，以制藥業(yè)常用的單位劑量形式生產(chǎn)這些制劑。這些制劑中的活性成分含量應(yīng)使之得有特定范圍之內(nèi)的適當(dāng)劑量。
可在片劑、膠囊劑等制劑中混入的添加劑包括明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠等粘結(jié)劑，結(jié)晶纖維素等賦形劑，玉米淀粉、明膠和海藻酸等膨脹劑、硬脂酸鎂等潤滑劑，蔗糖，乳糖和糖精等甜味劑，胡椒薄荷、akamono油和咖啡果等香味劑。當(dāng)單位劑量形式是膠囊劑時，上述材料可進(jìn)一步摻入液體載體例如油和脂肪?？梢园闯Ｒ?guī)制藥方法配制注射用的無菌組合物，例如將活性成分、天然植物油例如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮于注射用水等載體中。
注射用水或液體包括生理鹽水和含有葡萄糖及其他輔助劑例如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉的等滲溶液，并可與例如乙醇、多元醇如聚乙二醇和丙二醇等適當(dāng)?shù)闹軇?、例如聚山梨醇?0(TM)和HCO-50等非離子表面活性劑合用。油狀液體包括芝麻油和大豆油，并可與苯甲酸芐酯和苯甲醇等助溶劑合用。另外，也可以加入例如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液等緩沖液，殺藻胺、鹽酸普魯卡因等安慰劑，人血清白蛋白、聚乙二醇等穩(wěn)定劑，苯甲醇、苯酚等防腐劑，及抗氧劑等一起配制上述材料。如此制得的可注射液體一般裝在適當(dāng)安瓶內(nèi)。因?yàn)檫@些制劑是很安全而且是低毒性的，所以可投用于人和大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗、猴等溫血動物。
根據(jù)病征程度的不同，成年人(體重60kg)口服給藥藥劑中所說的DNA的劑量一般約為每天0.1-100mg，較好1.0-20mg。在非口服給藥時，根據(jù)給藥對象、靶器官、癥狀、給藥方法等的不同，對成年人(體重60kg)一般每天投用大約0.01-30mg，較好0.1-20mg，最好0.1-10mg可注射制劑形式的所說的化合物或其鹽。對于其他種動物，可投用換算為每60kg體重的相應(yīng)劑量。
(5)抗G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之抗體或抗血清的生產(chǎn)可使用G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)作為抗原，按本領(lǐng)域已知的抗體或抗血清生產(chǎn)方法或與之相似的方法制備抗G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的抗體，例如多克隆抗體、單克隆抗體及抗血清。例如可按下述方法制備多克隆抗體。
多克隆抗體的制備將作為抗原的上述多肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)到載體蛋白質(zhì)上。載體蛋白質(zhì)例如可以是牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、牛γ球蛋白、血蘭蛋白或弗氏完全佐劑(Difco)。
抗原蛋白質(zhì)和載體蛋白質(zhì)之間的偶聯(lián)反應(yīng)可按已知的方法進(jìn)行。用于偶聯(lián)反應(yīng)的試劑包括但不只限于戊二醛和水溶性碳二亞胺?？乖鞍踪|(zhì)對載體蛋白質(zhì)的適當(dāng)比例約為1∶1至1∶10，并且就反應(yīng)的pH來說，在許多情況下當(dāng)反應(yīng)在中性pH，特別是在大約pH6-8范圍內(nèi)進(jìn)行時，可獲得令人滿意的結(jié)果。在許多情況下，反應(yīng)時間較好為大約1-12小時，最好為大約2-6小時。在大約0至18℃下，按常規(guī)方法將所得到的結(jié)合物對水透析，并冷凍貯存或凍干后貯存。
為了生產(chǎn)多克隆抗體，使用按上述方法得到的免疫原接種溫血動物。可用于這一目的的溫血動物包括哺乳類溫血動物，例如兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、馬、豬等；以及鳥類例如雞、鴿、鴨、鵝、鶉等。就使用免疫原接種溫血動物的方法學(xué)來說，免疫原的接種量應(yīng)足以刺激抗體產(chǎn)生。例如，在許多情況下可將1mg免疫原加在1ml含弗氏完全佐劑的鹽水中進(jìn)行乳化，并將此乳劑皮下注射于兔的背部和后肢足墊部位，每間隔4周注射一次，共注射5次以誘導(dǎo)產(chǎn)生所需的抗體。為了收獲在溫血動物例如兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，通常在末次接種后的7至12天從耳靜脈放血并離心回收抗血清。為了純化抗體，一般是使用已結(jié)合了各種抗原肽的載體對抗血清進(jìn)行親和層析并回收被吸附的部分，以提供多克隆抗體。
可按下述方法生產(chǎn)單克隆抗體。
單克隆抗體的制備(a)單克隆抗體生成細(xì)胞的制備單獨(dú)將G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或?qū)⑹荏w蛋白質(zhì)與載體或稀釋劑一起注射于給藥后可能產(chǎn)生抗體的部位。為了提高給藥后的抗體產(chǎn)生量，可投用弗氏完全或不完全佐劑。每2-6周給藥一次，共2-10次?？墒褂玫臏匮獎游锇ê?、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊和雞，較好是使用小鼠和大鼠。
在制備產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞時，從用抗原免疫的溫血動物中選擇出已記錄到有抗體滴度的動物(例如小鼠)，于末次免疫后2到5天收集動物的脾臟或淋巴結(jié)，將其中的抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。為了檢測抗血清中的抗體濃度，例如可使被標(biāo)記的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)(將在下文中提到)與抗血清反應(yīng)，然后測定標(biāo)記試劑與抗體的結(jié)合活性?？砂凑誎oehler和Milstein(Nature，256，495，1975)的方法完成融合操作。融合加速劑可以是聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，但較好是使用PEG。
骨髓瘤細(xì)胞可以是NS-1，P3U1、SP2/0、AP-1等，優(yōu)選的是P3U1。所使用的抗體生成細(xì)胞(脾細(xì)胞)對骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量比例較好在大約1∶1至20∶1范圍內(nèi)。以大約10-80％的濃度加入PEG(較好是PEG1000到PEG6000)，然后于20-40℃(較好為30-37℃)保溫1至10分鐘即可實(shí)現(xiàn)有效地細(xì)胞融合。
可用各種方法篩選產(chǎn)生抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體的雜交瘤。例如，將雜交瘤培養(yǎng)物的上清液加到直接或借助載體吸附了G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)抗原的固相(例如微量滴定板)上，然后向其中加入用放射活性物質(zhì)、酶等標(biāo)記物或蛋白A標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體(當(dāng)用于細(xì)胞融合的細(xì)胞是小鼠細(xì)胞時，則使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)，并檢測結(jié)合于固相上的抗G蛋白偶聯(lián)受體單克隆抗體；或者向已吸附了抗免疫球蛋白或蛋白A的固相內(nèi)加入雜交瘤培養(yǎng)物的上清液，然后加入用放射活性物質(zhì)標(biāo)記的G蛋白偶聯(lián)受體，并檢測與固相結(jié)合的抗G蛋白偶聯(lián)受體單克隆抗體。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或其相似方法選擇并克隆產(chǎn)生抗G蛋白偶聯(lián)受體單克隆抗體的雜交瘤。通常在含有HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)的動物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行所說的選擇和克隆。就用于選擇、克隆和細(xì)胞生長的培養(yǎng)基來說，只要雜交瘤細(xì)胞能在其中生長，任何培養(yǎng)基均可使用。例如所說的培養(yǎng)基可以是含有1-20％(較好10-20％)胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.，Japan)、含有1-20％胎牛血清的CIT培養(yǎng)基(Wako Pure Chemical，Japan)以及用于雜交瘤培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基(SFM-101；NissuiSeiyaku，Japan)。培養(yǎng)溫度通常為20-40℃，較好為大約37℃。培養(yǎng)時間通常為5天至3周，較好為1至2周。培養(yǎng)通常是在5％CO2氣體環(huán)境中進(jìn)行的?？墒褂蒙鲜鰴z測抗血清中抗G蛋白偶聯(lián)受體之抗體滴度的方法檢測雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的抗體滴度。
(b)單克隆抗體的純化同分離/純化常規(guī)多克隆抗體一樣，可使用分離/純化免疫球蛋白的方法分離/純化抗G蛋白偶聯(lián)受體單克隆抗體，這些方法例如包括鹽析、用乙醇沉淀、等電沉淀、電泳、使用離子交換劑例如DEAE吸附/解吸附、超離心、凝膠過濾，以及特異性純化方法(其中通過用例如結(jié)合抗原的固相、蛋白A或蛋白G等活性吸附劑處理以便只收集抗體，并在鍵斷裂后得到抗體)。
按上述方法(a)或(b)制備的抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體能夠特異性地識別G蛋白偶聯(lián)受體，并因此可將其用于定量檢測液體試驗(yàn)樣品中的G蛋白偶聯(lián)受體，特別是用夾心免疫檢測法進(jìn)行定量檢測。
因此，本發(fā)明提供例如下述方法(i)定量檢測液體試驗(yàn)樣品中的G蛋白偶聯(lián)受體的方法，其包括(a)使液體試驗(yàn)樣品和標(biāo)記的G蛋白偶聯(lián)受體與結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體的抗體進(jìn)行競爭性反應(yīng)，并(b)檢測與所說抗體結(jié)合的被標(biāo)記之G蛋白偶聯(lián)受體的比例；以及(ii)定量檢測液體試驗(yàn)樣品中的G蛋白偶聯(lián)受體的方法，其包括(a)使液體試驗(yàn)樣品同時或相繼與固定于不溶性載體上的抗體及被標(biāo)記的抗體反應(yīng)，并(b)檢測不溶性載體上標(biāo)記試劑的活性；其中一種抗體能夠識別G蛋白偶聯(lián)受體的N末端區(qū)域，而另一種抗體能夠識別G蛋白偶聯(lián)受體的C末端區(qū)域。
當(dāng)使用識別G蛋白偶聯(lián)受體的本發(fā)明的單克隆抗體(下文中可將其稱為“抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體”)時，可借助組織染色等方法檢測并進(jìn)而確定G蛋白偶聯(lián)受體。為此目的，可以使用抗體本身或抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。對利用本發(fā)明的抗體完成的檢測方法沒有特殊限制，只要其中提供助化學(xué)或物理手段檢測待檢液體樣品中依賴于或相應(yīng)于抗原量(例如G蛋白偶聯(lián)受體等的量)之抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，然后使用由含有已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算結(jié)果即可。例如，可適當(dāng)?shù)剡x用naphrometry競爭法、免疫檢測法及夾心法，但從敏感性和特異性角度考慮，較好是使用下文描述的夾心法。
用于該檢測方法的標(biāo)記試劑例如可以是放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、膠體、磁性物質(zhì)等。放射性同位素可以是〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕和〔14C〕；優(yōu)選的酶是比較穩(wěn)定的并且有大的比活性的酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶；熒光物質(zhì)例如可以是熒光胺、異硫氰酸熒光素等；發(fā)光物質(zhì)例如可以是魯米諾、獸米諾衍生物、蟲熒光素、光澤精素(lucigenin)等。此外，也可以使用生物素-抗生物素蛋白使抗體或抗原與標(biāo)記試劑連接在一起。
在固定抗原或抗體時，可以使用物理吸附法，或者也可使用通常用于固定蛋白質(zhì)或酶的化學(xué)結(jié)合法。載體例如可以是瓊脂糖、葡聚糖及纖維素等不溶性多糖，和聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷等合成樹脂，以及玻璃等。
在夾心(或兩位點(diǎn))方法中，先使試驗(yàn)液體樣品與固定化的抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體反應(yīng)(第一反應(yīng))，然后使之與被標(biāo)記的抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體反應(yīng)(第二反應(yīng))，并檢測不溶性載體上標(biāo)記試劑的活性，進(jìn)而確定試驗(yàn)液體中G蛋白偶聯(lián)受體的量。第一反應(yīng)和第二反應(yīng)可以顛倒或同步進(jìn)行，或者可以間隔進(jìn)行。標(biāo)記試劑的類型和固定化方法可以與上文所述的相同。在借助夾心法進(jìn)行免疫試驗(yàn)中，用作標(biāo)記抗體的抗體和用于固相的抗體并不一定總是同一類型或同一種來源的，為了改善檢測敏感性等，也可以使用兩種或多種抗體的混合物。
在本發(fā)明的利用夾心法檢測G蛋白偶聯(lián)受體的方法中，用于第一和第二反應(yīng)的優(yōu)選抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體是其中與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的位點(diǎn)彼此不同的抗體。因此，用于第一和第二反應(yīng)的抗體是其中當(dāng)用于第二反應(yīng)的抗體識別G蛋白偶聯(lián)受體的C末端區(qū)域時，則在第一反應(yīng)中較好是使用識別C末端以外的位點(diǎn)例如識別N末端區(qū)域的抗體。
本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)受體的抗體可以用于夾心法以外的檢測系統(tǒng)例如競爭法、免疫測定法的naphrometry。在競爭法中，使試驗(yàn)溶液中的抗原和被標(biāo)記的抗原與抗體以競爭方式反應(yīng)，然后分離未反應(yīng)的被標(biāo)記抗原(F)和與抗體結(jié)合的被標(biāo)記抗原(B)(即B/F分離)，并檢測B和F的標(biāo)記量，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上確定試驗(yàn)溶液中的抗原量。就用于這種反應(yīng)的方法來說，可包括液相法-其中使用可溶性抗性作為第一抗體并使用聚乙二醇、抗上述抗體的第二抗體等進(jìn)行B/F分離，以及固相法-其中使用固定化的抗體作為第一抗體或使用可溶性抗體作為第一抗體，同時使用固定化的抗體作為第二抗體。
在免疫測定法中，使試驗(yàn)溶液中的抗原和固定化的抗原與一定量的被標(biāo)記抗原進(jìn)行競爭反應(yīng)，然后分離出固相和液相；或者使試驗(yàn)溶液中的抗原和過量的被標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后加入固定化的抗原，以結(jié)合未反應(yīng)的用固相標(biāo)記的抗體并分離成固相和液相。之后，檢測各相的標(biāo)記量以確定試驗(yàn)溶液中的抗原量。
在nephrometry中，檢測因凝膠中或溶液中抗原-抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的不溶性沉淀物的量。當(dāng)試驗(yàn)溶液中的抗原量很小并且只得到小量的沉淀物時，可以適當(dāng)?shù)剡x用其中利用激光散射的激光nephrometry法。
在將那些免疫學(xué)檢測方法(免疫檢測法)應(yīng)用于本發(fā)明的檢測方法時，不必采用特殊的條件、操作步驟等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員在技術(shù)上的考慮，采用各種方法的常規(guī)條件和操作步驟建立用于檢測G蛋白偶聯(lián)受體的檢測系統(tǒng)。有關(guān)那些常規(guī)技術(shù)手段的詳細(xì)內(nèi)容，可見參各種評論文獻(xiàn)、參考書等，例如可參見Hiroshi Irie(ed)＂Radioimmunoassay＂(Kodansha，Japan，1974)；HiroshiIrie(ed)＂Radioimmunoassay；Second Series＂(Kodansha，Japan，1979)；Eiji Ishikawa et al.(ed)＂EnzymeImmunoassay＂(Igaku Shoin，Japan，1978)；Eiji Ishikawaet al.(ed)＂Enzyme Immunoassay＂(Second Edition)(Igaku Shoin，Japan，1982)；Eiji Ishikawa et al.(ed)＂Enzyme Immunoassay＂(Third Edition)(Igaku Shoin，Japan，1987)；＂Methods in Enzymology＂ Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))；ibid. Vo.73(Immunochemical Techniques(Part B))；ibid. Vo.74(Immunochemical Techniques(Part C))；ibid. Vo.84(Immunochemical Techniques (Part D SelectedImmunoassays))；ibid. Vol.92(ImmunochemicalTechniques(Part EMonoclonal Antibodies and GeneralImmunoassay Methods))；ibid. Vol.121(ImmunochemicalTechniques(Part IHybridoma Technology and MonoclonalAntibodies))(Academic Press)據(jù)此，現(xiàn)在即可使用本發(fā)明的抗G蛋白偶聯(lián)受體抗體以高準(zhǔn)確度確定G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的量。
在本發(fā)明的說明書和附圖中，用于代表堿基(核苷酸)、氨基酸等的縮寫符號是由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的或是本領(lǐng)域中習(xí)慣使用的。下面給出這些縮寫字的某些實(shí)例。除特別指出者外，可能存在光學(xué)異構(gòu)體的氨基酸均為L型。
DNA脫氧核糖核苷酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶
RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸鈉EIA酶免疫檢測法G，Gly甘氨酸(或甘氨酰)A，Ala丙氨酸(或丙氨酰)V，Val纈氨酸(或纈氨酰)L，Leu亮氨酸(或亮氨酰)I，Ile異亮氨酸(或異亮氨酰)S，Ser絲氨酸(或絲氨酰)T，Thr蘇氨酸(或蘇氨酰)C，Cys半胱氨酸(或半胱氨酰)M，Met蛋氨酸(或蛋氨酰)E，Glu谷氨酸(或谷氨酰)D，Asp天冬氨酸(或天冬氨酰)K，Lys賴氨酸(或賴氨酰)R，Arg精氨酸(或精氨酰)H，His組氨酸(或組氨酰)F，Phe苯丙氨酸(或苯丙氨酰)Y，Tyr酪氨酸(或酪氨酰)W，Trp色氨酸(或色氨酰)P，Pro脯氨酸(或脯氨酰)N，Asn天冬酰胺(或天冬酰胺酰)Q，Gln谷氨酰胺(或谷氨酰胺酰)
說明書的序列表中所列出的各個SEQ ID NO是指下述序列〔SEQ ID NO1〕是由包括在p63A2full中的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)cDNA編碼的全長度氨基酸序列，〔SEQ ID NO2〕是包含在p63A2full中的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)cDNA的核苷酸序列，〔SEQ ID NO3〕是人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列，該序列是根據(jù)對包含在p63A2中之cDNA5’末端部分的核苷酸測序推導(dǎo)的，〔SEQ ID NO4〕是人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列，該序列是根據(jù)對包含在p63A2中之cDNA3’末端部分的核苷酸測序推導(dǎo)的，〔SEQ ID NO5〕是對包含在p63A2中的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)cDNA片段之5’末端序列測定所得到的部分核苷酸序列，〔SEQ ID NO6〕是對包括在p63A2中的人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之3’末端序列測定所得到的部分核苷酸序列，〔SEQ ID NO7〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO8〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO9〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO10〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO11〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO12〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO13〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO14〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO15〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO16〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO17〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO18〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，〔SEQ ID NO19〕是用于篩選編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之cDNA的合成的DNA引物，已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于1994年8月9日將按參考實(shí)施例3中所述方法制得的定名為INVαF’/p63A2的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株保藏在日本國際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局的國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究院(NIBH)，指定的保藏號為FERM BP-4777。并于1994年8月22日將該菌株保藏在日本大阪的發(fā)酵研究所(IFO)，其保藏號為IFO 15738。
按下文實(shí)施例2中所述制得的定名為p63A2 full的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株也已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1996年2月2日保藏在NIBH并指定保藏號為BP-5380。還于1996年2月13日將該樣品保藏于IFO并指定了保藏號為IFO15924。
實(shí)施例以下描述的是本發(fā)明的工作實(shí)施例，提供這些實(shí)施例只是為了舉例說明的目的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
參考實(shí)施例1制備用于擴(kuò)增編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之DNA的合成的DNA引物對編碼相應(yīng)于或接近于人衍生的TRH受體蛋白質(zhì)(HTRHR)、人衍生的RANTES受體蛋白質(zhì)(HUMRANTES)、人伯基特氏淋巴瘤衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(HSBLRIA)、人衍生的促生長素抑制素受體蛋白質(zhì)(HUMSOMAT)、大鼠衍生的μ-阿片樣物質(zhì)受體蛋白質(zhì)(RNU02083)、大鼠衍生的K-阿片樣物質(zhì)受體蛋白質(zhì)(U00442)、人衍生的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體蛋白質(zhì)(HUMNMBR)、人衍生的毒蠅堿性乙酰膽堿受體蛋白質(zhì)(HSHM4)、大鼠衍生的腎上腺素α1B受體蛋白質(zhì)(RATAADRE01)、人衍生的促生長素抑制素3受體蛋白質(zhì)(HUMSSTR3X)、人衍生的C5a受體蛋白質(zhì)(HUMC5AAR)、人衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(HUMRDCIA)、人衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(HUMOPIODRE)和大鼠衍生的腎上腺素α2B受體蛋白質(zhì)(RATA2BAR)之一的第一跨膜區(qū)之已知氨基酸序列的脫氧核糖核苷酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中存在高度同源的區(qū)域或其部分。
另外，對編碼相當(dāng)于或接近于小鼠衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(HUMGIR)、人衍生的鈴蟾肽受體蛋白質(zhì)(HUMBOMB3S)、人衍生的腺嘌呤核苷A2受體蛋白質(zhì)(S46950)、小鼠衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(MUSGPCR)、小鼠衍生的TRH受體蛋白質(zhì)(S43387)、大鼠衍生的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽K受體蛋白質(zhì)(RATNEURA)、大鼠衍生腎上腺素A1受體蛋白質(zhì)(RATAIARA)、人衍生的神經(jīng)激肽A受體蛋白蛋白(HUMNEKAR)、大鼠衍生的腎上腺素A3受體蛋白質(zhì)(RATADENREC)、人衍生的促生長素抑制素1受體蛋白質(zhì)(HUMSRI1A)、人衍生的神經(jīng)激肽3受體蛋白質(zhì)(S8637194)、大鼠衍生的未知配體受體蛋白質(zhì)(RNCGPCR)、人衍生的促生長素抑制素4受體蛋白質(zhì)(HUMSSTR4Z)和大鼠衍生的GnRH受體蛋白質(zhì)(RATGNRHA)之一第6跨膜區(qū)之已知氨基酸序列的脫氧核糖核酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間存在高度同源的區(qū)域或其部分。
括號中的上述縮寫字是當(dāng)使用DNASIS Gene/蛋白質(zhì)測序數(shù)據(jù)庫(CD019，Hitachi Software Engineering，Japan)檢索GenBank/EMBL Data Bank時指定的標(biāo)志符(參考號)，并且通常稱為“登錄號”或“輸入號”。但HTRHR是日本專利公開號304797/1993(歐洲專利申請638645)中公開的序列。
具體地說，計(jì)劃摻入一些依賴于堿基區(qū)域的，與編碼大量受體蛋白質(zhì)的cDNA相一致的混合堿基，以便提高甚至包括在其他區(qū)域中之盡可能多的受體cDNA的序列堿基一致性?；谶@些序列，制備具有由SEQ ID NO7或SEQ ID NO8表示的互補(bǔ)于同源核苷酸序列之核苷酸序列的簡并性合成DNA。
〔合成的DNA〕5′-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)TGGGCAAC(A，G，C或T)(C或T)CCTG-3′(SEQ ID NO7)5′-GT(A，G，C或T)G(A或T)(A or G)(A或G)GGCA(A，G，C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3′括號指示摻入多個堿基，以在引物制備中產(chǎn)生多個寡核苷酸。換句話說，在合成時，于多堿基之混合物的存在下?lián)饺肜ㄌ杻?nèi)所示上述DNA的核苷酸殘基。
參考實(shí)施例2分離編碼人杏仁核衍生之G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA(1)以PCR方法，使用人杏仁核衍生的cDNA擴(kuò)增受體cDNA使用人扁桃體衍生的cDNA(Quicklone，CLONTECHLaboratories，Inc.)作為模板，以實(shí)施例1中合成的DNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)溶液的成分由各1μm合成的DNA引物(SEQ5’引物序列和3’引物序列)、1ng模板cDNA、0.25mM dNTP、1μl Taq DNA聚合酶和酶檢測藥盒所附帶的緩沖液組成，反應(yīng)溶液的總量為100μl。使用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Co.)將包括95℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘的擴(kuò)增循環(huán)重復(fù)30次。在加入Taq DNA聚合酶之前，混合保留的反應(yīng)溶液并于95℃加熱5分鐘，于65℃加熱5分鐘。借助1.2％瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色進(jìn)一步證實(shí)擴(kuò)增的產(chǎn)物。
(2)將PCR產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒載體中并通過分析被插入之cDNA區(qū)域的核苷酸序列來選擇新的受體候選克隆使用0.8％低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，用剃刀切下凝膠上的電泳帶部分，加熱熔化后用苯酚提取并在乙醇中沉淀以回收DNA。按照TA克隆藥盒(Invitrogen Co.)中所附帶的使用說明書，將回收的DNA亞克隆到質(zhì)粒載體pCRTMII中。將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌INVαF’感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen Co.)中以產(chǎn)生重組體克隆。然后在含有氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇帶有被插入之cDNA片段的重組體克隆。用無菌牙簽挑取呈現(xiàn)白顏色的重組細(xì)胞克隆以得到大腸桿菌INVαF’/p63A2。
在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將個別克隆培養(yǎng)過夜并用自動質(zhì)粒提取機(jī)(Kurabo Co.，Japan)處理以制備質(zhì)粒DNA。用EcoRI切割如此制得的DNA等分樣品以證實(shí)被插入之cDNA片段的大小。用RNase進(jìn)一步加工余留的DNA樣品，用苯酚/氯仿提取，并在乙醇中沉淀以濃縮之。使用DyeDeoxy終止子循環(huán)測序藥盒(ABI Co.)進(jìn)行序列測定，使用熒光自動序列儀測定DNA序列，并使用DNASIS(Hitachi System Engineering Co.，Japan)分析所得到的核苷酸序列數(shù)據(jù)。
基于所確定的核苷酸序列進(jìn)行同源性檢索(圖1和2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化體大腸桿菌INVαF’/p63A2所攜帶的質(zhì)粒p63A2中的cDNA片段插入物編碼一種新的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一事實(shí)，使用DNASIS(Hitachi System Engineering Co.，Japan)將核苷酸序列轉(zhuǎn)變成氨基酸序列(圖1和2)，在考慮到疏水性作圖(圖3和4)的情況下并在氨基酸序列水平上進(jìn)行同源性檢索，以找出與小鼠GIR的同源性(圖5)。
SEQ ID NOS3和4的部分肽序列可采用上述方法得到。
實(shí)施例1
用RACE方法(cDNA末端的快擴(kuò)增)從人下丘腦cDNA文庫中克隆編碼新的人孤獨(dú)受體之cDNA的未知序列區(qū)域(63A2full)制備作為RACE模板的人下丘腦cNDA文庫(clontech)。因?yàn)樵揷DNA文庫是在噬菌體載體λgt11的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，所以合成下列用于擴(kuò)增cDNA部分的引物基于λgt11在側(cè)臂部分之已知核苷酸序列的引物U1序列5′-ATATGGGGATTGGTGGCGACGACTC-3′(25mer) (SEQ ID NO9)U2序列5′-CAACATCAGCCGCTACAGTCAACAG-3′(25mer) (SEQ ID NO10)基于右側(cè)臂之已知核苷酸序列的引物L(fēng)1序 5′-GCCCGGTTATTATTATTTTTGACAC-3′(25mer) (SEQ ID NO11)L2序列5′-TTCCTTACGCGAAATACGGGCAGAC-3′(25mer) (SEQ ID NO12)另外，合成下列特異于63A2的引物63U序列5′-CGGCCACCAGCCTCTTCATCGTCAACCTGGC-3′(31mer) (SEQ ID NO13)63L序列5′-GGCAACCAGCAGAGGGCAAAGAGGACTACC-3′(30mer) (SEQ ID NO14)圖6中顯示了各自引物、插入的cDNA片段及λgt11的預(yù)測的相對位置。
將人丘腦cDNAλgt11噬菌體文庫溶液(20μl)與80μl無菌蒸餾水相混合并于95℃加熱10分鐘以進(jìn)行熱變性，然后在冰水上驟冷10分鐘。
使用AmpliWax PCR Gem 100(Perkin Elmer)，以熱啟動技術(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將2μl10×EXPCR緩沖液(酶附帶的)、4μl12.5mM dNTP溶液、各0.5μl50μM引物溶液(相應(yīng)于圖6和圖7的引物組合是泳道1，63U和63L；泳道2，U1和63U；泳道3，U1和63L；泳道4，U2和63U；泳道5，U2和63L；泳道6，L1和63U；泳道7，L1和63L；泳道8，L2和63U；泳道9，U2和63L)和13μl無菌蒸餾水混合在一起制成底層混合物。將2.5μl按上述方法作為模板板制備的噬菌體溶液、3μl10×EXPCR緩沖液(酶附帶的)、0.5l TakaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)和24μl無菌蒸餾水混合在一起制成頂層混合物。向如此制得的頂層混合物內(nèi)加入一份AmpliWax PCR Gem100，于70℃將其處理5分鐘并于冰上處理5分鐘，然后向其中加入頂層混合物以制成PCR混合物。
將含有反應(yīng)混合物的試管固定在熱循環(huán)儀Gene ATAQ控制器(Pharmacia)上，于95℃處理3分鐘，于62℃處理22分鐘并于75℃處理2分鐘。然后將95℃1分鐘、 62℃1分鐘和75℃2分鐘的擴(kuò)增循環(huán)重復(fù)30次，再于75℃處理8分鐘。
反應(yīng)完成后，將一部分反應(yīng)混合物加到Seakem GTG(FMC)中進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，以分析擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖7中所示，檢測大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便進(jìn)行Southern雜交，進(jìn)而確定對63A2特異的PCR產(chǎn)物。
使用非放射性同位素(RI)標(biāo)記的DIG系統(tǒng)(Boeh ringerMannheim)進(jìn)行Southern雜交。使用PCR DIG探針合成藥盒(Boehringer Mannheim)，以質(zhì)粒p63A2作模板并以63U和63L作引物制備探針。使用20×SSC，0.4M NaOH溶液，以毛細(xì)管法進(jìn)行Southern轉(zhuǎn)移。使用UV交聯(lián)劑CL-1000(UVP)將DNA固定在濾膜上。使用含有60ng已制備的PCR DIG探針的Express Hyb雜交溶液(Clontech)于68℃雜交1小時。第一個15分鐘洗滌用2×SSC，0.1％SDS溶液于室溫下進(jìn)行兩次。第二個15分鐘洗滌用0.1×SSC，0.1％SDS溶液于60℃進(jìn)行兩次。使用DIG發(fā)光檢測藥盒(Boehringer Mannheim)檢測雜交的帶。
如圖8中所示，利用引物組合U1和63U，以及U2和63U，經(jīng)Southern雜交檢測出一條與探針雜交的約670bp的DNA帶，而利用引物組合L1和63L，以及L2和63L則檢測出一條大約1,200bp的DNA帶。因此，從雜交的部分中回收到各自的DNA片段并使用TA克隆藥盒(Invitrogen)將其亞克隆到質(zhì)粒載體中，然后對含有670bp或1,200bp PCR產(chǎn)物的克隆進(jìn)行插入物核苷酸序列分析。
使用BcaBESTTM雙脫氧測序藥盒(Takada Shuzo)在R.O.B.DNA處理器(Pharmacia)上進(jìn)行測序反應(yīng)，并使用ALF DNA序列儀II(Pha rmacia)進(jìn)行核苷酸序列測定。
將如此得到的核苷酸序列與GIR(其為63A2的小鼠對應(yīng)物)的核苷到序列比較，證實(shí)存在結(jié)構(gòu)上很相似的部分(如圖9和圖10所示)。但如圖10中所示，根據(jù)GIR的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，就63A2之開放讀框的3’側(cè)來說，尚沒得到含有終止密碼子(用于終止轉(zhuǎn)譯)的部分?；趫D9和圖10中所示的序列，揭示出如圖11中圖解顯示的63A2和未知序列區(qū)的序列。然后，以總?cè)四Xpoly(A)+RNA(Clontech)作為模板，使用3’- Ampli FINDERRACE藥盒(Clontech)克隆開放讀框的3’側(cè)部分。
為了進(jìn)行3’-Ampli FINDER RACE，合成下列對63A2特異的引物63-6序列 5′-TTCATCCTGCTCTACATCCTGCCCCTCCTC-3′(30mer)(SEQ ID NO15)63-7序列 5′-GCCCTGCGGCGCAAAAAGAAGAAGACCATC-3′(30mer)(SEQ ID NO16)63-8序列5′-GCTGGTGGTAGTCCTCTTTGCCCTCTGCTG-3′(30mer)(SEQ ID NO17)為了合成第一股cDNA，向1μl1μg/μl總?cè)四Xpoly(A)+RNA中加入11.5μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水(藥盒附帶的)和1μl10μM NN-1 oligo(dT)CDS引物(藥盒附帶的)，并于65℃將混合物處理10分鐘，再在水中處理2分鐘。向此混合物中加入5μl4×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(藥盒附帶的)和5μl超純dNTP混合物(藥盒附帶的)。于52℃處理2分鐘后，進(jìn)一步加入0.5μl 25單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(藥盒附帶的)。于52℃處理30分鐘后，加入0.5μl2單位/μl大腸桿菌RNase H(藥盒附帶的)，并將整個混合物于37℃處理20分鐘，再于95℃處理5分鐘。將如此制備的溶液作為第一股cDNA合成溶液貯存于-20℃。
使用AmpliWax PCR Gem100(Perkin Elmer)，以熱啟動技術(shù)進(jìn)行初步PCR。將2l10×EXPCR緩沖液(附帶在酶上)、1μl10mM dNTP溶液、各1μl10μM引物溶液(相應(yīng)于圖12的引物組合是泳道1，63U和錨定引物(藥盒附帶的)；泳道2，63-6和錨定引物；泳道3，63-7和錨定引物)和15μl無菌蒸餾水充分混合制成底層混合物。將1μl預(yù)先作為模板制備的第一股cDNA合成溶液、3μl10×EX PCR緩沖液(酶附帶的)、0.5μlTaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Kakara Shuzo)和25.5μl無菌蒸餾水混合在一起制成頂層混合物。將一份AmpliWax PCR Gem 100加到如此制備的底層混合物中，于70℃將其處理5分鐘再于水上放置5分鐘，然后向其中加入頂層混合物以制成PCR混合物。
將含有反應(yīng)混合物的試管固定在熱循環(huán)儀PJ 2000(PerkinElmer)上，于95℃處理3分鐘，于60℃處理2分鐘并于75℃處理2分鐘。然后，將95℃1分鐘，60℃1分鐘和75℃1分鐘的擴(kuò)增循環(huán)重復(fù)30次，再于75℃處理8分鐘。
另外使用AmpliWax PRC Gem100(Perkin Elmer)以熱啟動技術(shù)進(jìn)行二次PCR。將2μl10×EXPCR緩沖液(酶所附帶的)、1μl10mM dNTP溶液、各1μl10μM引物溶液(相應(yīng)于圖12的引物組合是泳道4，63-6和錨定引物；泳道5，63-7和錨定引物；泳道6，63-8和錨定引物)和15μl無菌蒸餾水混合在一起制得底層混合物。將1μl作為模板的初步PCR反應(yīng)溶液(使用63U和錨定引物進(jìn)行的初步反應(yīng)的PCR溶液被用于使用63-6和錨定引物進(jìn)行的反應(yīng)；使用63-6和錨定引物進(jìn)行的初步反應(yīng)的PCR溶液被用于使用63-7和錨定引物進(jìn)行的反應(yīng)；并將使用63-7和錨定引物進(jìn)行的初步反應(yīng)的PCR溶液被用于使用63-8和錨定引物進(jìn)行的反應(yīng))、3μl10×EX PCR緩沖液(酶所附帶的)、0.5μl TaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)和25.5μl無菌蒸餾水混合在一起制得頂層混合物。將1份AmpliWax PCRGem100加到如此制得的底層混合物中，于70℃將其處理5分鐘，在冰上放置5分鐘，并向其中加入頂層混合物以制成PCR混合物。
將含有反應(yīng)混合物的試管固定在熱循環(huán)儀PJ2000(PerkinElmer)上，于95℃處理3分鐘，于60℃處理2分鐘并于75℃處理2分鐘。然后，將95℃1分鐘，60℃1分鐘和75℃1分鐘的擴(kuò)增循環(huán)重復(fù)30次，再于75℃處理8分鐘。
如圖12中所示，在初步PCR中以及使用初步PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行的二級PCR中出現(xiàn)了多條帶。因此，以如上述的同樣方法進(jìn)行Southern雜交分析。結(jié)果如圖13中所示，測到了約3Kb的帶。從各個雜交的部分中回收DNA片段并使用TA克隆藥盒(Invitrogen)亞克隆到質(zhì)粒載體中，然后分析含有3kb PCR產(chǎn)物之克隆的插入物核苷酸序列。
使用BcaBEST雙脫氧測序藥盒(Takara Shuzo)和R.O.B.DNA處理器(Pharmacia)進(jìn)行測序反應(yīng)，并使用ALF DNA序列儀II(Pharmacia)進(jìn)行核苷酸序列分析。
將如此得到的核苷酸序列與作為63A2之小鼠對應(yīng)物的GIR相比較，從而證實(shí)存在一個在序列上很接近于GIR之開放讀框的3’末端側(cè)的部分(參見圖14)。
實(shí)施例2克隆63A2之編碼cDNA的全長度開放讀框基于如實(shí)施例1中確定的5’和3’非翻譯區(qū)部分的序列，合成加有限制性酶SalI位點(diǎn)的下列引物對F63U(-30)序列5′-GGAGTCGACCAGGGGAGGGGTGGCTCCTGCAAA-3′(33mer)(SEQ IDNO18)F63L(1465)序列5′-CCCGTCGACCCCCTCCCACTCCCTCTTCCCAAC-3′(33mer)(SEQ IDNO19)使用這些引物并以人腦QUICK-Clone cDNA(Clontech)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增63A2full之全長度開放讀框的PCR反應(yīng)。
使用AmpliWax PCR Gem 100(Perkin Elmer)，以熱啟動技術(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將2μl10×EXPCR緩沖液(酶附帶的)、4μl2.5mM dNTP溶液、各0.5μl50μM引物溶液(引物組合是F63U和F63L)及13μl無菌蒸餾水相混合以制成底層混合物。將1l作為模板的總?cè)四XQUICK-Clone cDNA、3l10×EXPCR緩沖液(酶附帶的)、0.5μl TaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及25.5μl無菌蒸餾水相混合以制成頂層混合物。將1份AmpliWaxPCR Gem100加到如此制得的底層混合物上，于75℃將所得混合物處理5分鐘后再于冰水上放置5分鐘，然后在其上加入頂層混合物以制成反應(yīng)混合物。
將含有反應(yīng)混合物的試管固定在熱循環(huán)儀PJ2000(PerkinElmer)上并于95℃處理3分鐘，于63℃處理2分鐘，再于75℃處理2分鐘。然后，將95℃1分鐘、63℃1分鐘和75℃2分鐘的循環(huán)重復(fù)進(jìn)行30次，并進(jìn)一步于75℃處理8分鐘。
反應(yīng)完成后，使用Seakem GTG(FMC)對一部分(5μl)反應(yīng)混合物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳以分析擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖15中所示，結(jié)果測到一條1.34kb大小的帶。使用TA克隆藥盒(Invitrogen)將此PCR產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒載體中，并針對所得到的轉(zhuǎn)化體菌株測定插入部分的完整核苷酸序列。所說的菌株被定名為大腸桿菌/p63A2full。
圖16和圖17中顯示了63A2full之開放讀框的全長度核苷酸序列和由之推導(dǎo)的氨基酸序列。如圖18中所示，還從疏水性作圖的結(jié)果證實(shí)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)中存在7個特異性的疏水區(qū)域。此外，如圖19中所示，當(dāng)與小鼠GIR的序列相比較時，可見人總腦衍生的63A2full的氨基酸序列與之有高達(dá)85.8％的同源性。
本發(fā)明提供的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)和編碼所說蛋白質(zhì)的DNA可用于(1)鑒定本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的配體，(2)獲得抗體和抗血清，(3)構(gòu)建重組受體蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，(4)發(fā)展受體結(jié)合檢測系統(tǒng)并使用所說的表達(dá)系統(tǒng)篩選出候選藥物化合物，(5)基于同結(jié)構(gòu)上相似的配體和受體的比較設(shè)計(jì)藥物，(6)制備用于基因診斷的探針和PCR引物，以及(7)基因治療等。具體地說，闡明G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性可導(dǎo)致對作用于這些系統(tǒng)之獨(dú)特藥物的開發(fā)。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Takeda Chemical Industries，Ltd.
(B)街道1-1，Doshomachi4-chome，Chuo-Ku(C)城市Osaka(D)州Osaka(D)國家Japan(F)郵政編碼(ZIP)541(ii)發(fā)明名稱G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)及應(yīng)用(iii)序列數(shù) 19(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度423(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)序列描述SEQ ID NO1Met Val Pro His Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Pro Leu Val Arg Ala1 5 10 15Thr Glu Pro His Glu Gly Arg Ala Asp Glu Gln Ser Ala Glu Ala Ala20 25 30Leu Ala Val Pro Asn Ala Ser His Phe Phe Ser Trp Asn Asn Tyr Thr35 40 45Phe Ser Asp Trp Gln Asn Phe Val Gly Arg Arg Arg Tyr Gly Ala Glu50 55 60Ser Gln Asn Pro Thr Val Lys Ala Leu Leu Ile Val Ala Tyr Ser Phe65 70 75 80Ile Ile Val Phe Ser Leu Phe Gly Asn Val Leu Val Cys His Val Ile85 90 95Phe Lys Asn Gln Arg Met His Ser Ala Thr Ser Leu Phe Ile Val Asn100 105 110Leu Ala Val Ala Asp Ile Met Ile Thr Leu Leu Asn Thr Pro Phe Thr115 120 125Leu Val Arg Phe Val Asn Ser Thr Trp Ile Phe Gly Lys Gly Met Cys130 135 140His Val Ser Arg Phe Ala Gln Tyr Cys Ser Leu His Val Ser Ala Leu145 150 155 160Thr Leu Thr Ala Ile Ala Val Asp Arg His Gln Val Ile Met His Pro165 170 175Leu Lys Pro Arg Ile Ser Ile Thr Lys Gly Val Ile Tyr Ile Ala Val180 185 190Ile Trp Thr Met Ala Thr Phe Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Cys Gln195 200 205Lys Leu Phe Thr Phe Lys Tyr Ser Glu Asp Ile Val Arg Ser Leu Cys210 215 220Leu Pro Asp Phe Pro Glu Pro Ala Asp Leu Phe Trp Lys Tyr Leu Asp225 230 235 240Leu Ala Thr Phe Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ser245 250 255Val Ala Tyr Ala Arg Val Ala Lys Lys Leu Trp Leu Cys Asn Met Ile260 265 270Gly Asp Val Thr Thr Glu Gln Tyr Phe Ala Leu Arg Arg Lys Lys Lys275 280 285Lys Thr Ile Lys Met Leu Met Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys290 295 300Trp Phe Pro Leu Asn Cys Tyr Val Leu Leu Leu Ser Ser Lys Val Ile305 310315 320Arg Thr Asn Asn Ala Leu Tyr Phe Ala Phe His Trp Phe Ala Met Ser325 330 335Ser Thr Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Cys Trp Leu Asn Glu Asn Phe340 345 350Arg Ile Glu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Met Cys Gln Arg Pro Pro Lys355 360 365Pro Gln Glu Asp Arg Pro Pro Ser Pro Val Pro Ser Phe Arg Val Ala370 375 380Trp Thr Glu Lys Asn Asp Gly Gln Arg Ala Pro Leu Ala Asn Asn Leu385 390 395 400Leu Pro Thr Ser Gln Leu Gln Ser Gly Lys Thr Asp Leu Ser Ser Val405 410 415Glu Pro Ile Val Thr Met Ser420(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度1272(B)類型核酸(C)鏈型雙股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)特征(C)鑒定方法S(X)序列描述SEQ ID NO2ATGGTCCCTC ACCTCTTGCT GCTCTGTCTC CTCCCCTTGG TGCGAGCCAC CGAGCCCCAC 60GAGGGCCGGG CCGACGAGCA GAGCGCGGAG GCGGCCCTGG CCGTGCCCAA TGCCTCGCAC 120TTCTTCTCTT GGAACAACTA CACCTTCTCC GACTGGCAGA ACTTTGTGGG CAGGAGGCGC 180TACGGCGCTG AGTCCCAGAA CCCCACGGTG AAAGCCCTGC TCATTGTGGC TTACTCCTTC 240ATCATTGTCT TCTCACTCTT TGGCAACGTC CTGGTCTGTC ATGTCATCTT CAAGAACCAG 300CGAATGCACT CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG CAGTTGCCGA CATAATGATC 360ACGCTGCTCA ACACCCCCTT CACTTTGGTT CGCTTTGTGA ACAGCACATG GATATTTGGG 420AAGGGCATGT GCCATGTCAG CCGCTTTGCC CAGTACTGCT CACTGCACGT CTCAGCACTG 480ACACTGACAG CCATTGCGGT GGATCGCCAC CAGGTCATCA TGCACCCCTT GAAACCCCGG 540ATCTCAATCA CAAAGGGTGT CATCTACATC GCTGTCATCT GGACCATGGC TACGTTCTTT 600TCACTCCCAC ATGCTATCTG CCAGAAATTA TTTACCTTCA AATACAGTGA GGACATTGTG 660CGCTCCCTCT GCCTGCCAGA CTTCCCTGAG CCAGCTGACC TCTTCTGGAA GTACCTGGAC 720TTGGCCACCT TCATCCTGCT CTACATCCTG CCCCTCCTCA TCATCTCTGT GGCCTACGCT 780CGTGTGGCCA AGAAACTGTG GCTGTGTAAT ATGATTGGCG ATGTGACCAC AGAGCAGTAC 840TTTGCCCTGC GGCGCAAAAA GAAGAAGACC ATCAAGATGT TGATGCTGGT GGTAGTCCTC 900TTTGCCCTCT GCTGGTTCCC CCTCAACTGC TACGTCCTCC TCCTGTCCAG CAAGGTCATC 960CGCACCAACA ATGCCCTCTA CTTTGCCTTC CACTGGTTTG CCATGAGCAG CACCTGCTAT 1020AACCCCTTCA TATACTGCTG GCTGAACGAG AACTTCAGGA TTGAGCTAAA GGCATTACTG 1080AGCATGTGTC AAAGACCTCC CAAGCCTCAG GAGGACAGGC CACCCTCCCC AGTTCCTTCC 1140TTCAGGGTGG CCTGGACAGA GAAGAATGAT GGCCAGAGGG CTCCCCTTGC CAATAACCTC 1200CTGCCCACCT CCCAACTCCA GTCTGGGAAG ACAGACCTGT CATCTGTGGA ACCCATTGTG 1260ACGATGAGTT AG 1272(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度70(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Val Cys His Val Ile Phe Lys Asn Gln Arg Met His Ser Ala Thr Ser1 5 10 15Leu Phe Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Ile Met Ile Thr Leu Leu20 25 30Asn Thr Pro Phe Thr Leu Val Arg Phe Val Asn Ser Thr Trp Ile Phe35 40 45Gly Lys Gly Met Cys His Val Ser Arg Phe Ala Gln Tyr Cys Ser Leu50 55 60His Val Ser Ala Leu Thr65 70(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度71(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Pro Ala Asp Leu Phe Trp Lys Asn Leu Asp Leu Pro Thr Phe Ile1 5 10 15Leu Leu Asn Ile Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ser Val Ala Tyr Val Arg20 25 30Val Thr Lys Lys Leu Trp Leu Cys Asn Met Ile Val Asp Val Thr Thr35 40 45Glu Gln Tyr Phe Ala Leu Arg Pro Lys Lys Lys Lys Thr Ile Lys Met50 55 60Leu Met Leu Val Val Val Leu65 70(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度210(B)類型核苷酸(C)鏈型雙股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)特征(C)鑒定方法S(X)序列描述SEQ ID NO5GTCTGTCATG TCATCTTCAA GAACCAGCGA ATGCACTCGG CCACCAGCCT CTTCATCGTC 60AACCTGGCAG TTGCCGACAT AATGATCACG CTGCTCAACA CCCCCTTCAC TTTGGTTCGC 120TTTGTGAACA GCACATGGAT ATTTGGGAAG GGCATGTGCC ATGTCAGCCG CTTTGCCCAG 180TACTGCTCAC TGCACGTCTC AGCACTGACA 210(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度213(B)類型核苷酸(C)鏈型雙股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)特征(C)鑒定方法S(X)序列描述SEQ ID NO6GAGCCAGCTG ACCTCTTCTG GAAGAACCTG GACTTGCCCA CCTTCATCCT GCTCAACATC 60CTGCCCCTCC TCATCATCTC TGTGGCCTAC GTTCGTGTGA CCAAGAAACT GTGGCTGTGT 120AATATGATTG TCGATGTGAC CACAGAGCAG TACTTTGCCC TGCGGCCCAA AAAGAAGAAG 180ACCATCAAGA TGTTGATGCT GGTGGTAGTC CTC 213(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈型雙股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG25(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9
ATATGGGGAT TGGTGGCGAC GACTC 25(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10CAACATCAGC CGCTACAGTC AACAG25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GCCCGGTTAT TATTATTTTT GACAC25(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12TTCCTTACGC GAAATACGGG CAGAC25(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG C31(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GGCAACCAGC AGAGGGCAAA GAGGACTACC 30(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸
(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15TTCATCCTGC TCTACATCCT GCCCCTCCTC 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GCCCTGCGGC GCAAAAAGAA GAAGACCATC 30(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17GCTGGTGGTA GTCCTCTTTG CCCTCTGCTG 30(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征
(A)長度33(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GGAGTCGACC AGGGGAGGGG TGGCTCCTGC AAA 33(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度33(B)類型核酸(C)鏈型單股(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19CCCGTCGACC CCCTCCCACT CCCTCTTCCC AAC 3權(quán)利要求
1.包含由SEQ ID NO1表示之氨基酸序列的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其實(shí)質(zhì)上的等同物，或其鹽。
2.如權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽。
3.包含編碼如權(quán)利要求1中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求2中所述部分肽之核苷酸序列的DNA。
4.如權(quán)利要求3中所述的DNA，其包含由SEQ ID NO2表示的核苷酸序列。
5.包含如權(quán)利要求3中所述之DNA的重組載體。
6.攜帶如權(quán)利要求3中所述DNA或如權(quán)利要求5中所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
7.生產(chǎn)如權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽的方法，其包括培養(yǎng)如權(quán)利要求6中所述的轉(zhuǎn)化體。
8.檢測如權(quán)利要求1中所述G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法，其包括使(i)如權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或如權(quán)利要求2中所述的部分肽或其鹽與(ii)待檢樣品相接觸。
9.篩選能夠改變?nèi)鐧?quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的方法，該方法包括對下述兩種情況下檢測的結(jié)果進(jìn)行比較(i)至少一種情況是所說的配體與權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或權(quán)利要求2中所述的部分肽或其鹽接觸，以及(ii)至少一種情況是所說的配體與待檢樣品一起與權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或權(quán)利要求2中所述的部分肽或其鹽接觸。
10.篩選能夠改變權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽的藥盒，該藥盒包含如權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽，或如權(quán)利要求2中所述的部分肽或其鹽。
11.能夠改變權(quán)利要求1中所述的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)與配體之結(jié)合活性的化合物或其鹽，該化合物是使用權(quán)利要求9中所述的篩選方法或使用權(quán)利要求10中所述的篩選藥盒得到的。
12.如權(quán)利要求1中所述的抗G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽或權(quán)利要求2中所述的部分肽或其鹽的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及人杏仁核衍生的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或其鹽、G蛋質(zhì)偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的部分肽、編碼G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)的DNA、鑒定G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之配體的方法、篩選出能夠改變配體與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)之結(jié)合活性的化合物的方法或藥盒、用該篩選方法或使用篩選藥盒得到的化合物或其鹽、含有該化合物或其鹽的藥物組合物，以及抗G蛋白偶聯(lián)受體蛋白質(zhì)或部分肽的抗體。
文檔編號C07K14/435GK1165147SQ9710217
公開日1997年11月19日 申請日期1997年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月7日
發(fā)明者日沼州司, 坂本潤一, 細(xì)谷昌樹 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社