專利名稱：介導異源三體g蛋白和單體g蛋白相互作用的因子的鑒定的制作方法
背景技術(shù)：
使胞外因子與Rho GTP酶的激活相聯(lián)系的信號傳導途徑與細胞生長的控制和細胞骨架的重排有關(guān)。特異地，盡管介導的機制還不清楚，已表明異源三體G蛋白介導這些途徑。鑒定與異源三體G蛋白和Rho GTP酶均相互作用的因子將為調(diào)查和控制各種細胞過程，包括細胞增生性疾病提供重要的工具。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種含有新的RGS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽，以及相應(yīng)的核酸，該結(jié)構(gòu)域可以從如鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)蛋白中得到，其中多肽優(yōu)選地不包括dbl同源(DH)結(jié)構(gòu)域或普列克底物蛋白同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選實施方案中，該多肽具有GTP酶激活活性和對G蛋白亞單位(如Gα)的結(jié)合親和性。
如下面所討論的，該多肽和核酸可被用作研究、治療和診斷的工具。
本發(fā)明還涉及鑒定或檢測調(diào)節(jié)GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域與底物如G蛋白亞單位(如Gα)結(jié)合的分子或分子混合物的方法。在一個實施例中，該方法包括在有效條件下，將具有GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域，或者任選地具有GEF活性的多肽，在存在和／或不存在供試分子時，與Gα亞單位或其片段進行溫育；檢測供試分子的存在是否調(diào)節(jié)多肽與亞單位或其片段的結(jié)合。如后面所討論的，可以采用各種RGS-GEF多肽結(jié)合底物。
另外，本發(fā)明涉及鑒定或檢測能夠調(diào)節(jié)含有GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的多肽對具有GTP酶活性的多肽的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一個優(yōu)選實施例中，該方法包括在有效條件下，將Gα亞單位和GEF蛋白在存在和不存在供試分子時進行溫育，并檢測供試分子的存在是否調(diào)節(jié)GEF蛋白對Gα亞單位的GTP酶活性的刺激作用。
本發(fā)明還涉及鑒定或檢測能夠特異地調(diào)節(jié)第一種多肽，如被激活的Gα亞單位或具有GTP酶活性的多肽，對第二種多肽的核苷酸交換因子活性的刺激作用的分子的方法。第二種多肽優(yōu)選地含有來自GEF的RGS-GEF結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選地是單體G蛋白的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)。在該方法的一個實施例中，第一次檢測是將被激活的Gα亞單位與GEF蛋白和單體G蛋白在存在和不存在供試分子的情況下溫育；第二次檢測將GEF蛋白和單體G蛋白在存在和不存在供試分子的情況下溫育，比較兩次檢測，確定供試分子是否具有不同的作用。
本發(fā)明進一步涉及鑒定或檢測能夠模擬被激活的Gα亞單位對GEF介導的單體G蛋白的核苷酸交換的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一個實施例中，該方法包括鑒定對GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域顯示結(jié)合親和性的供試化合物，將GEF蛋白和單體G蛋白在存在或不存在供試化合物的情況下溫育，測定供試化合物是否表現(xiàn)出對GEF介導的單體G蛋白的核苷酸交換具有刺激作用。
本發(fā)明進一步涉及鑒定或檢測能夠模擬GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域?qū)α亞單位的GTP酶活性的刺激作用的分子或分子混合物的方法。在一個實施例中，該方法包括鑒定對Gα亞單位顯示結(jié)合親和性的供試化合物，將GTP承載的Gα亞單位在存在或不存在供試化合物的情況下溫育，以測定供試化合物是否表現(xiàn)出對GEF介導的單體G蛋白的核苷酸交換具有刺激作用。
附圖簡述

圖1，A描述通過Clustal W進行的RGS蛋白的序列和p115 RhoGEF的N-端區(qū)的排列比較，使用RGS4的二級結(jié)構(gòu)框架(mask)分配罰區(qū)間。進一步將Lsc、KIAA380和DrhoGEF2的RGS同源序列通過Clustal W和手工調(diào)整加入序列對比中。RGS4上面的(a)符號表示RGS4的RGS結(jié)構(gòu)域的α螺旋。深色陰影框表示RGS結(jié)構(gòu)疏水核心的保守殘基。淺色陰影框表示其他保守殘基。星號標出了與Gαil接觸的RGS4的殘基。序列對比中采用的原始序列如下大鼠RGS4(SwissProt登記號P49799)，小鼠RGS2(008849)，人GAIP(P49785)，大鼠RGS12(O08773)，人p115(1654344)，小鼠Lsc(1389756)，人KIAA380(2224701)和果蠅DrhoGEF2(2760368)。
圖1，B描繪此處所述研究中采用的p115 Rho GEF構(gòu)件。數(shù)字表示各個構(gòu)件中p115的殘基。圖中指出了RGS、dbl(DH)和普列克底物蛋白(PH)同源區(qū)。GST=谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
圖2，A表示在15℃、有(●○)或沒有(■□)10nM p115 RhoGEF時與Gα13和Gα12結(jié)合的GTP的水解。
圖2，B表示在4℃、存在不同濃度的p115 Rho GEF時與Gα13(●)和Gα12(○)結(jié)合的GTP的水解。將初始反應(yīng)速率以p115 RhoGEF濃度的函數(shù)作圖。
圖3表示在15℃、在有全長的p115 Rho GEF(●)、Np115(■)、或RGS-p115(▲)，或者沒有任何p115構(gòu)件(_)時與Gα13和Gα12結(jié)合的GTP的水解。
圖4表示用100nM p115 Rho GEF(△)、100nM RGS4(□)，或緩沖液對照(○)與Gαil，Gαz，Gαq和Gαs結(jié)合的GTP的水解。對Gαil和Gαs的檢測在4℃下進行，Gαz在15℃，而Gαq在20℃。
圖5表示被AlF4激活形式的Gα亞單位對p115 GAP活性的選擇性抑制。A在存在30μM AlCl3，10mM NaF和10mM MgSO4下將P115(400nM)與不同的Gα亞單位(400nM)冰上溫浴15分鐘?；旌衔锵♂?0倍，與0．3nM Gα12(GTP)混合，15℃溫育2分鐘后測定結(jié)合GTP的水解。BP115(400nM)與不同濃度的Gα12(GDP-AIF4-)(●)或Gα13(GDP-AIF4-)(■)按A中所述溫育。混合物稀釋20倍，在4℃下與1nM Gα13(GTP)混合，測定經(jīng)過一段時間后結(jié)合GTP的水解。將Gα13的GTP酶的初始速率對α亞單位GDP-AIF4-的終濃度作圖。填充的三角形表示沒有p115時Gα的GTP酶速率。
圖6，A是表示利用抗-myc抗體檢測myc-標記的p115 Rho GEF在COS細胞中表達的免疫印跡圖象。
圖6，B是表示利用抗-myc抗體檢測p115 Rho GEF和Gα13共免疫沉淀的免疫印跡圖象。
圖6，C是表示利用抗-Gα13抗體檢測p115 Rho GEF和Gα13共免疫沉淀的免疫印跡圖象。
圖6，D是表示利用抗-Gα13抗體，將純化的Gα13加入到共免疫沉淀的p115 Rho GEF中時，檢測p115 Rho GEF和Gα13結(jié)合的免疫印跡圖象。
圖7，A表示在存在或不存在100nM Gα13或Gα12時以及存在不同濃度的p115 Rho GEF時，10分鐘后結(jié)合的GDP從100nM RhoA中的解離情況。
圖7，B表示在存在25nM p115 Rho GEF和所示濃度的Gα13或Gα12時，10分鐘后GDP從100nM RhoA中的解離情況。通過下部虛線表示未刺激的GDP從RhoA的解離。
圖7，C表示如所述與經(jīng)AMF、GTPγS或GDPβS處理過的p115 Rho GEF和Gα13溫育10分鐘后GDP從100nM RhoA中的解離情況。
圖7，D表示與p115 Rho GEF(25nM)和不同Gα亞單位(100nM)溫育10分鐘后GDP從100nM RhoA中的解離情況。
圖8，A表示在所示濃度的截短的全長p115 Rho GEF存在時，1nM[32P]GTP與100nM RhoA的結(jié)合情況，測定是30分鐘后在30℃下通過過濾進行的。
圖8，B表示存在或不存在25nM p115 Rho GEF、20nM Gα13和300nM GST-RGSp115時，溫育10分鐘后[3H]-GDP從100nM RhoA中的解離情況。
圖8，C表示存在25nM p115 Rho GEF、存在或不存在25nM Gα13以及所示濃度的Gα12時，溫育10分鐘后[3H]-GDP從100nM RhoA中的解離情況。
圖9，A是表示利用抗-myc抗體檢測myc-標記的KIAA380(命名為FL147)在COS細胞中表達的免疫印跡圖象。
圖9，B是表示利用抗-Gα12抗體檢測KIAA380(命名為L147)和Gα12共免疫沉淀的免疫印跡圖象。
圖10是p115 Rho GEF的氨基酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域為45-170位氨基酸。
圖11是p115 Rho GEF的核酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域由187-564位核苷酸編碼。
圖12是KIAA380的氨基酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域為310-432位氨基酸。
圖13是KIAA380的核酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域由1673-2041位核苷酸編碼。
圖14是Lsc的氨基酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域為43-168位氨基酸。
圖15是Lsc的核酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域由218-595位核苷酸編碼。
圖16是DRhoGEF2的氨基酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域為924-1053位氨基酸。
圖17是DRhoGEF2的核酸序列的序列表。RGS結(jié)構(gòu)域由3185-3574位核苷酸編碼。
圖18是幾種蛋白質(zhì)的RGS區(qū)的同源序列對比，這些蛋白質(zhì)包括具有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF)。序列對比采用Clustal法進行，并利用PAM250殘基權(quán)重表。
發(fā)明詳述G蛋白將信號從大量的細胞表面七螺旋受體傳導至各種胞內(nèi)效應(yīng)物上。每個七螺旋G蛋白由一個鳥嘌呤核苷酸結(jié)合α亞單位和一個高親和性的β和γ亞單位二聚體組成。根據(jù)其氨基酸序列的同源性和功能，Gα亞單位通常分為四個亞種(Gs，Gi，Gq和G12)(A．G．Gilman，生物化學年度評述(Annu．Rev．Biochem．)，56，615(1987)；Y．Kaziro等人，生物化學年度評述，60，349(1991)；Hepler和Gilman，生化科學進展(Trends Biochem．Sci．)，17，383(1992))。G12亞種含有兩個已被鑒定的成員，G12和G13。
根據(jù)本發(fā)明，描述了既對異源三體G蛋白的α亞單位具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性，又對單體G蛋白具有鳥嘌呤核苷酸交換因子活性的蛋白質(zhì)的鑒定。還根據(jù)本發(fā)明，描述了對G蛋白的G12亞種具有GAP活性的蛋白質(zhì)的首次鑒定。還根據(jù)本發(fā)明，描述了異源三體G蛋白的α亞單位刺激由GEF介導的單體G蛋白的鳥嘌呤核苷酸交換活性的能力。GAP和GEF活性，以及其篩選方法在文獻Berman等人，1996，細胞(Cell)和Hart等人，1996，生物化學雜志(J．Biol．Chem．)27125452中有描述。
根據(jù)本發(fā)明，GEF蛋白的GAP活性與從GEF蛋白獲得的新的RGS結(jié)構(gòu)域有關(guān)。本發(fā)明涉及這樣一個RGS結(jié)構(gòu)域的所有方面，包括Rho GEF如p115 Rho-GEF的所有方面(美國專利08／943，768，在此引入作為參考)。
通過調(diào)節(jié)GTP酶的鳥嘌呤核苷酸交換活性，GEF蛋白在體外和體內(nèi)都能調(diào)節(jié)細胞信號傳導途徑。根據(jù)本發(fā)明，描述了還調(diào)節(jié)異源三體Gα亞單位的GTP酶活性的GEF蛋白。通過闡述的方法，對調(diào)節(jié)Rho GTP酶的鳥嘌呤核苷酸交換活性以及異源三體G蛋白的Gα亞種的GTP酶活性之p115 Rho-GEF進行了描述。
本發(fā)明尤其涉及含有GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽，以及相應(yīng)的核酸。
本發(fā)明還涉及利用這些多肽、核酸，或其衍生物的方法，例如用于治療、診斷和作為研究工具。本發(fā)明的其他方面涉及識別GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域或核酸的抗體和其他配體，鑒定或檢測含有RGS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的GEF活性和／或GAP活性調(diào)節(jié)物(modulator)的方法，以及處理涉及RGS結(jié)構(gòu)域或與其有關(guān)的病理條件的方法，例如由GEF介導的Gα亞單位和Rho GTP酶的相互作用。
如此處所用的，“RGS-GEF多肽”是指，例如，含有衍生自GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域的多肽，例如p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380，或DRhoGEF2，并且該多肽具有一種或多種下列活性對多肽底物(如G蛋白亞單位)，優(yōu)選地是α亞單位(如G12或G13)的特異結(jié)合親和性；GTP酶激活活性(GAP)，例如對G蛋白α亞單位的GAP活性；或者免疫原性活性。RGS-GEF多肽優(yōu)選地不含有(dbl同源的)DH或(普列克底物蛋白同源的)PH結(jié)構(gòu)域。DH和PH結(jié)構(gòu)域在Cerione和Zheng，1996，細胞生物學現(xiàn)代觀點(Curr．Opin．In CellBiol．)，8216中被公開。例如，p115 Rho-GEF的氨基酸序列(圖10)在47-170位氨基酸處含有新的RGS結(jié)構(gòu)域，在420-637位氨基酸處有DH結(jié)構(gòu)域，并在646-672位氨基酸處有PH結(jié)構(gòu)域?！把苌摹笔侵赴被嵝蛄衼碜蕴烊恍纬傻腉EF(例如p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380，和DRhoGEF2)或者是根據(jù)天然形成的GEF而“突變的”、非天然形成的序列(即在特定的位點將天然形成的序列中的氨基酸殘基替換為不同的氨基酸殘基)。多肽可以是“被分離的”，就是說該材料的形式不同于其所在的原始環(huán)境中，例如，更加濃縮的，更加純化的，或是從其他組分中分離的，等等。優(yōu)選的RGS多肽既具有GAP活性又具有GEF活性，例如突變的p115 Rho-GEF。參見下文。
RGS-GEF核酸編碼RGS-GEF多肽。該核酸既指有義核酸又指反義核酸。
術(shù)語“特異結(jié)合親和性”是指，例如，與GDP-結(jié)合態(tài)或核苷酸缺乏態(tài)相比，RGS-GEF多肽對于G蛋白亞單位的激活態(tài)或過渡態(tài)具有結(jié)合偏好性?！癎EF活性”是指，例如，多肽刺激或催化GDP從單體G蛋白如Rho的解離，并且隨后結(jié)合GTP。單體G蛋白包括但并不限于Ras，Rho／Rac，Sar，Rab，Arf，和Ran家族的G蛋白。特別感興趣的是下列GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域人p115(1654344)(圖10，在45-170位氨基酸處的RGS結(jié)構(gòu)域)，小鼠Lsc(1389756)(圖14，在43-168位氨基酸處的RGS結(jié)構(gòu)域)，KIAA380(2224701)(圖12，在310-432位氨基酸處的RGS結(jié)構(gòu)域)以及果蠅DrhoGEF2(2760368)(圖16，在924-1053位氨基酸處的RGS結(jié)構(gòu)域)。
本發(fā)明的另一方面涉及GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域的新的共有序列，此處指“亞RGS共有序列”。此處采用的“RGS結(jié)構(gòu)域”指蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該蛋白能夠結(jié)合到G蛋白或與G蛋白物理上相互作用，任選地，它刺激G蛋白的GTP酶活性。此處采用的“亞RGS共有序列”指能夠被用于鑒定含有RGS結(jié)構(gòu)域的特異亞類(subset)蛋白質(zhì)的共有序列。例如，來自圖18和相應(yīng)的圖例中所示和描述的幾種蛋白質(zhì)的RGS結(jié)構(gòu)域的同源序列對比，顯示幾種亞RGS共有序列可以根據(jù)GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域中明顯的13至14個氨基酸的缺口加以定義。這些共有序列之一，此處命名為“RGS-GEF共有序列1”，被定義為共有序列AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-(13個氨基酸的缺口)-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26，其中AA1是L；AA2是E或V；AA3是K或P；AA4是T，N，或R；AA5是A；AA6是V或P；AA7是L；AA8是S或是一個氨基酸的缺口，與13個氨基酸缺口相鄰；AA22是R或W；AA23是V或Y；AA24是P，K，或RAA25是V，I，或Q；AA26是P或D。
另一個共有序列，此處命名為“RGS-GEF共有序列2”，被定義為共有序列AA1-AA2-AA3-AA4-(13個氨基酸的缺口)-AA18-AA19，其中AA1是A；AA2是V或P；AA3是L；AA4是S或一個氨基酸的缺口，與13個氨基酸缺口相鄰；AA18是R或W；AA19是V或Y。
其他蛋白質(zhì)，包括其他GEF蛋白可以與圖18中所示的RGS蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域進行序列對比，并且利用此處描述的方法，確定它們是否含有亞-RGS共有序列，例如上面定義的RGS-GEF共有序列1或RGS-GEF共有序列2。
檢查圖18時，同樣很明顯的是非GEF蛋白的RGS蛋白所特有的核苷酸序列表示為編碼相應(yīng)于RGS-GEF蛋白中13-14氨基酸缺口的氨基酸的核苷酸序列。這些核苷酸序列可以用作鑒定特定類型的RGS蛋白的探針。
RGS-GEF多肽優(yōu)選地具有生物學活性。有生物學活性是指多肽片段在活的系統(tǒng)中或是與活的系統(tǒng)的組分一起具有活性。生物學活性包括，但不限于上面所定義的對G蛋白α亞單位的特異結(jié)合親和性，以及對G蛋白α亞單位的GAP活性。如實施例中所述，這種多肽可以通過常規(guī)方法制備，例如通過重組方法或通過對分離的多肽進行蛋白水解切割，然后檢測所需的活性。
本發(fā)明的多肽包括與p115 Rho-GEF(圖10)，Lsc(圖14)，KIAA0380(圖12)，或DRhoGEF2(圖16)的氨基酸序列的相同性小于100％的多肽。為了進行下列討論序列的相同性指在圖10-17中所示序列中可見的相同的核苷酸或氨基酸，在所比較的序列的相應(yīng)位置上也能找到。具有與圖10，12，14和16列出的氨基酸序列相同性小于100％的多肽可以通過各種方式被替換，例如，通過保守的氨基酸。相同的和保守性替換的殘基總數(shù)被序列中的殘基總數(shù)除，結(jié)果等于序列的相似性百分比。為了計算序列的相同性和相似性，被比較的序列可以作序列對比，并根據(jù)任何所需的方法、法則、計算機程序等等進行計算，包括，如FASTA，BLASTA。與圖10，12，14，和16所示的GEF蛋白的氨基酸序列的相同性小于100％的多肽可以具有，例如，大約60％，65％的序列相似性，而更優(yōu)選地為大約67％，70％，78％，80％，90％，92％，96％，99％等等的序列相似性。
特別地，本發(fā)明涉及p115 Rho-GEF，Lsc，KIAA0380和DRhoGEF2的多肽及相應(yīng)的核酸，它們的GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域發(fā)生了突變，并且具有一種或多種上述RGS-GEF多肽活性。術(shù)語“突變的”在此處指這種序列不是天然形成的。例如所述突變的多肽中一個或多個天然形成的位點可以被保守性的氨基酸替換，例如，(根據(jù)側(cè)鏈的大小和極化的程度)小的非極性氨基酸半胱氨酸，脯氨酸，丙氨酸，蘇氨酸；小的極性氨基酸絲氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺大的極性氨基酸谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸；中等極性氨基酸酪氨酸，組氨酸，色氨酸；大的非極性氨基酸苯丙氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸。這種保守性的替換還包括Dayhoff在《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集5》(1978)和Argos在EMBOJ．，8，779-785(1989)中描述的那些。具有圖10，12，14，和16中的氨基酸序列的多肽可以在1，5，10，15，或20個位點上被保守性氨基酸替換。突變可以被引入到GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的保守性共有區(qū)或是其他的殘基中。
選擇對RGS-GEF多肽的突變使其具有一種或多種上述的活性，例如，對G蛋白α亞單位的特異結(jié)合親和性，對G蛋白α亞單位的GAP活性等等。這種活性的檢測可以按下述方法或按Cerione和Zheng，1996，細胞生物學現(xiàn)代觀點，8216中所述進行。
通過向RGS結(jié)構(gòu)域的疏水核心引入氨基酸替換可以對RGS-GEF多肽進行修飾(圖1，A)。例如，一個保守性氨基酸的替換預(yù)期不會影響活性，而非保守性的氨基酸替換，例如，將疏水殘基變?yōu)橛H水殘基，預(yù)期將會降低或消除其活性。疏水殘基是非極性的氨基酸如苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，和半胱氨酸。親水殘基是極性氨基酸如賴氨酸，精氨酸，組氨酸，谷氨酸，以及天冬氨酸。
對本發(fā)明的RGS-GEF多肽或相應(yīng)核苷酸序列的修飾，例如，突變，還可以根據(jù)從基因數(shù)據(jù)庫如GenBank，EMBL中進行同源性搜索而完成。序列同源性搜索可以利用各種方法實現(xiàn)，包括計算機程序BLAST系列中的算法，Smith-Waterman算法，等等。例如，保守性氨基酸可以從各種含有GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域的不同序列中鑒定出來(見圖18)。通過鑒定和比較多肽之間保守的氨基酸，然后在保守或非保守的位點修飾氨基酸，可以將突變引入到這種序列中。突變的RGS-GEF序列含有保守的或非保守的氨基酸，例如，在同源核酸的相應(yīng)區(qū)域之間。例如，突變的序列可以含有來自上述同源序列任何位點的和／或從合適的搜索算法確定的保守的或非保守的殘基。
相應(yīng)的突變可以在RGS-GEF核酸的特異區(qū)域中進行。例如，突變也可以發(fā)生在參與GTP酶催化功能的氨基酸上或者突變可以發(fā)生在作為RGS-GEF序列和Gα亞單位之間的接觸點的氨基酸上。
一個RGS-GEF多肽或其片段，或者被替換的RGS-GEF多肽或其片段，還可以含有各種修飾，其中這些修飾包括糖基化，共價修飾(例如氨基酸的R-基團)，氨基酸替換，氨基酸缺失，或氨基酸添加。對多肽的修飾可以根據(jù)各種方法，包括重組，合成，化學等方法來完成。
本發(fā)明的多肽(例如RGS-GEF多肽，或其片段和突變體)可以各種方式加以利用，例如，作為下述抗體的免疫原，作為生物活性劑(例如具有一種或多種與RGS-GEF多肽有關(guān)的活性)，作為相應(yīng)的全長多肽活性的抑制劑。例如，隨著p115 Rho-GEF與Gα亞單位的結(jié)合，在細胞內(nèi)啟動了級聯(lián)反應(yīng)，例如促進細胞繁殖和／或細胞骨架的重排。p115 Rho-GEF和Gα亞單位之間的相互作用可通過利用RGS-GEF多肽或其片段來進行調(diào)節(jié)，以抑制p115 Rho-GEF和Gα亞單位之間的相互作用。這樣的片段對于調(diào)節(jié)與Rho信號傳導途徑有關(guān)的病因性條件是有用的。有用的片段可以用常規(guī)方法進行鑒定，即通過測試全長GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的重疊片段抑制p115 Rho-GEF與Gα亞單位的結(jié)合的能力或者抑制p115 Rho-GEF對Gα亞單位GAP活性的能力?；钚缘臏y量在下面的實施例中進行描述。肽可以被化學修飾等等。
本發(fā)明的RGS-GEF多肽可以包含一個或多個結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，功能結(jié)構(gòu)域，可檢測結(jié)構(gòu)域，抗原結(jié)構(gòu)域，以及／或者其他目的多肽，其排列方式不是在自然界中形成的，即非天然形成的。具有這種特征的多肽是嵌合多肽或融合多肽。這些的嵌合多肽可以根據(jù)各種方法進行制備，包括化學的，合成的，半合成的，和／或重組的方法。編碼嵌合多肽的嵌合核酸可以在連續(xù)的或有中斷的開放閱讀框中含有各種結(jié)構(gòu)域或目的多肽，例如，含有內(nèi)含子，剪接位點，增強子等等。嵌合核酸可以根據(jù)各種方法產(chǎn)生。參見如美國專利5，439，819。結(jié)構(gòu)域或目的多肽可以擁有任何所需的特性，包括生物學功能如催化、信號傳導、刺激生長、細胞定向，等等，結(jié)構(gòu)功能如疏水性，親水性，跨膜性等，受體-配體功能，以及／或可檢測功能，例如與酶、熒光多肽、綠色熒光蛋白GFP結(jié)合(Chalfie等人，1994，科學(Science)，263802；Cheng等人，1996，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，14606；Levy等人，1996，自然生物技術(shù)，14610，等等)。另外，RGS-GEF核酸，或其片段，被引入宿主細胞中時可用作選擇性標記。例如，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸可以符合讀框地融合到所需編碼序列上，作為純化、選擇或制備時的標記。融合區(qū)編碼一個切割位點。
本發(fā)明的多肽可以在表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，例如，根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)、體外、無細胞、重組、細胞融合等系統(tǒng)。通過這種系統(tǒng)對多肽進行的修飾包括糖基化，氨基酸替換(例如通過改變密碼子的使用)，多肽加工如消化、切割、肽鏈內(nèi)切酶或肽鏈外切酶活性，附著化學基團，包括脂類、磷酸等。例如，一些細胞系可以從表達的多肽中去除末端的甲硫氨酸。
本發(fā)明的多肽可以根據(jù)常規(guī)方法從天然材料、轉(zhuǎn)化的宿主細胞(培養(yǎng)基或細胞)中回收，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。在純化時低濃度(大約0．1-5mM)的鈣離子的存在可能有用(Price等人，生物化學雜志244917(1969))。高效液相層析(HPLC)可用于最終的純化步驟。
本發(fā)明的RGS-GEF核酸可以包括RGS-GEF多肽的完整的編碼序列，或者是其部分片段。本發(fā)明的核酸還包括與任何RGS-GEF核苷酸序列100％互補的核苷酸序列，例如反義序列。
本發(fā)明的核酸可以從各種不同的途徑獲得?？梢詮腄NA或RNA，例如多聚腺嘌呤化的mRNA中獲得，例如從組織、細胞，或完整生物體中分離。該核酸可以直接從DNA或RNA，或從cDNA文庫中獲得。該核酸可以從處于特定發(fā)育期、具有所需基因型、表型的細胞(例如被致癌轉(zhuǎn)化的細胞或癌細胞)中獲得，等等。該核酸還可以經(jīng)化學合成。
本發(fā)明的核酸可包括只有RGS-GEF多肽的編碼序列；RGS-GEF多肽的編碼序列和附加的功能編碼序列，包括，例如前導序列，分泌序列，標記序列(如導向標記，酶標記，熒光標記等等)。本發(fā)明的核酸還包括RGS-GEF多肽的編碼序列和非編碼序列，例如5’端或3’端的非翻譯序列或分布在編碼序列之中的非翻譯序列，例如內(nèi)含子。
本發(fā)明的核酸還包括與上述核酸有效相連的表達控制序列。詞組“表達控制序列”指這樣的核酸序列，它調(diào)節(jié)由與之有效相連的核酸所編碼多肽的表達。表達的調(diào)節(jié)可以在mRNA水平上或是在多肽水平上。因此，表達控制序列包括與mRNA有關(guān)的元件和與蛋白質(zhì)有關(guān)的元件。這些元件包括啟動子，增強子(病毒的或細胞的)，核糖體結(jié)合序列，轉(zhuǎn)錄終止子等等。表達控制序列被有效連接到核苷酸編碼序列上，調(diào)整表達控制序列的定位方式，使之影響編碼序列的表達或使編碼序列得到表達。例如，當一個啟動子有效連接到編碼序列的5’端時，編碼序列由啟動子驅(qū)動開始表達。表達控制序列對于正?；騺碚f可以是異源的也可以是內(nèi)源的。
本發(fā)明的核酸可以根據(jù)核酸雜交進行選擇。兩條單鏈核酸樣品相互雜交的能力是它們的核苷酸序列互補性，例如核苷酸之間的堿基配對如A-T，G-C等等的一個量度。本發(fā)明因此還涉及與包含圖11，13，15和17中所列核苷酸序列的核酸雜交的核酸。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，例如有義鏈和反義鏈。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽可以與圖10-17中的核苷酸或氨基酸序列有一處或多處不同。對核苷酸和／或氨基酸序列的改變或修飾可以通過任何可行的方法來實現(xiàn)，包括定點誘變或隨機誘變。
編碼本發(fā)明的RGS-GEF多肽的核酸可以包含天然形成的GEF基因產(chǎn)生的核苷酸，例如天然形成的多態(tài)性，正?；蛲蛔凅w等位基因(核苷酸或氨基酸)，在天然哺乳動物如人、猴子、豬、小鼠、大鼠或兔的群體中發(fā)現(xiàn)的突變。術(shù)語天然形成的是指該核酸是從天然材料例如動物組織或細胞，體液，組培細胞，法醫(yī)學樣品中得到的。天然形成的突變包括核苷酸序列的缺失，替換，或添加。這些基因可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法通過核酸雜交進行檢測并分離。我們認識到，與其他癌基因相似，天然形成的GEF蛋白的變體將包括在GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域中具有缺失，替換，和添加的變體，這些變體在宿主細胞和生物體中產(chǎn)生病理條件。
編碼本發(fā)明的RGS-GEF多肽的核苷酸序列可含有在例如天然形成的基因，轉(zhuǎn)錄物，或cDNA中發(fā)現(xiàn)的密碼子，或者含有編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。
另外，本發(fā)明的核酸或多肽可以從任何所需的哺乳動物以及非哺乳動物體中得到。哺乳動物和非哺乳動物中的同系物可以根據(jù)各種方法得到。例如，與本發(fā)明的GEF的RGS結(jié)構(gòu)域，或是RGS-GEF的寡核苷酸選擇性雜交可用于選擇這種同系物，例如在Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)1989，第11章中描述的方法。這種同系物與前面鑒定的RGS結(jié)構(gòu)域或RGS-GEF核苷酸或多肽序列相比可以具有不同的核苷酸和氨基酸序列同一性和相似性。非哺乳動物體包括，如脊椎動物，無脊椎動物，斑馬魚，雞，果蠅，酵母(如釀酒酵母)，線蟲(C．elegans)，蛔蟲，原核生物，植物，擬南芥(Arabidopsis)，病毒，等等。
本發(fā)明的核酸可以包括，例如，DNA，RNA，合成的核酸，肽核酸，修飾的核苷酸，或者其混合物。DNA可以是雙鏈的或是單鏈的。組成核酸的核苷酸可以通過各種已知的方法連接起來，例如，根據(jù)不同的目的采用酯，氨基磺酸鹽，硫酰胺，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸酯，氨基甲酸酯，等等。連接方式可以根據(jù)不同的目的加以改變，例如抵抗核酸酶如RNase H和增加體內(nèi)的穩(wěn)定性，參見如美國專利5，378，825。
可以對核酸進行各種修飾，例如附著可檢測的標記(抗生物素蛋白，生物素，放射性元素)，和改善雜交、檢測或穩(wěn)定性的基團。該核酸還可以根據(jù)所需的方法附著到固體支持物上，例如硝酸纖維素，尼龍，瓊脂糖，重氮化纖維素，乳膠固形微球體，聚丙烯酰胺等等。參見美國專利5，470，967，5，476，925，5，478，893。
本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸和核酸探針。這種寡核苷酸或核酸探針可用于如檢測、定量、或分離測試樣品中的RGS-GEF核酸。檢測是各種不同的目的，包括研究、診斷、和法醫(yī)學所需要的。對于診斷目的來說，需要從組織、細胞、體液等獲得的樣品中鑒定特異RGS-GEF核酸序列的存在或其數(shù)量。在一個優(yōu)選方法中，本發(fā)明涉及在測試樣品中檢測靶RGS-GEF核酸的方法，該方法包括在能夠使靶與寡核苷酸有效雜交的條件下將測試樣品與寡核苷酸接觸，并檢測雜交情況。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸還可用于合成核酸的擴增如PCR中，例如Saiki等人，1988，科學，24153；美國專利4，683，20，或者用于差異顯示中(參見如Liang等人，核酸研究(Nucl．Acid Res．)，213269-3275，1993；USP 5，599，672；WO97-18454)。寡核苷酸可以經(jīng)常規(guī)鑒定，例如，差異顯示DH、PH、和RGS-GEF結(jié)構(gòu)域以及／或擴增含有這種序列的基因產(chǎn)物。
有義和反義核苷酸序列都是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的特定的核酸可用常規(guī)方法確定。RGS-GEF核酸可用作雜交探針從含有核酸混合物如Northern雜交的樣品中鑒定RGS-GEF核苷酸序列的存在。雜交可在嚴謹條件下進行以選擇與探針具有至少95％同一性(即互補性)的核酸，但是也可以采用低嚴謹條件。特定的RGS-GEF核苷酸序列可以在其5’端或3’端符合讀框地融合到各種核苷酸序列上，包括，例如，酶或表達控制序列等等的編碼序列。
根據(jù)所需的選擇性不同，雜交可以在不同的條件下進行，例如，按Sambrook等人，分子克隆，1989中所述。例如，為了特異地檢測RGS-GEF序列，寡核苷酸與靶核酸的雜交是在寡核苷酸僅僅與衍生RGS-GEF序列的GEF序列雜交的條件下進行的，例如，在該條件下寡核苷酸與靶100％互補。如果需要選擇具有小于100％的核苷酸互補性，至少約99％，97％，95％，90％，70％，67％的靶核酸，可以采用不同的條件。因為GEF基因的突變會引起疾病或病理條件，例如，癌癥，良性腫瘤，所以本發(fā)明的寡核苷酸可被用于診斷。例如，具有癌癥或其他與Rho信號傳導途徑有關(guān)(見下面)條件癥狀的患者可以使用本發(fā)明的寡核苷酸來診斷疾病，進行聚合酶鏈反應(yīng)然后進行DNA測序，并與其他癌基因寡核苷酸相結(jié)合，例如p53，Rb，p21，Db1，MTS1，Wt1，Bcl-1，Bcl-2，MDM2等等，以鑒定該序列是否正常。
本發(fā)明的寡核苷酸的大小可以是任意所需的，優(yōu)選地14-16寡核苷酸長，或者更長。這種寡核苷酸可以有非天然形成的核苷酸，例如肌苷。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸可以包含一個試劑盒，其中含有所需的緩沖液(例如，磷酸，三羥甲基氨基甲烷，等等)，檢測組合物等等。寡核苷酸可以用本領(lǐng)域已知的放射性或非放射性標記物加以標記，或者不標記。
反義核酸也可以從本發(fā)明的核酸中制備，優(yōu)選相應(yīng)于圖11，13，15，和17的RGS-GEF核苷酸序列的反義RGS-GEF核苷酸序列。反義RGS-GEF核酸可以各種方式加以利用，例如調(diào)節(jié)或調(diào)控含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白的表達，或者用于檢測RGS-GEF蛋白的表達，包括原位雜交。為了調(diào)節(jié)或調(diào)控表達，反義寡核苷酸可被有效地連接到表達控制序列上。
本發(fā)明的RGS-GEF核酸可以根據(jù)任何所需的方法加以標記。核酸可用放射性示蹤物加以標記，例如32P，35S，125I，3H，或14C，這些僅僅是最常用的示蹤物。放射性標記可根據(jù)任何方法進行，例如，使用放射性標記的核苷酸，多核苷酸激酶(用磷酸酶脫磷或不脫磷)或連接酶(根據(jù)要標記的末端)在3’端或5’端進行末端標記。還可以采用非放射性標記，使本發(fā)明的核酸與具有免疫特性(抗原，半抗原)、對某種試劑具有特異親和性(配體)、使可檢測的酶反應(yīng)進行完全的特性(酶或輔酶，酶底物，或其他參與酶反應(yīng)的物質(zhì))、或者具有如熒光或發(fā)射或吸收所需波長的光的典型物理特性的殘基結(jié)合起來。
本發(fā)明的RGS-GEF核酸，包括寡核苷酸，反義核酸，等等，可用于檢測完整器官、組織、細胞等的RGS-GEF核酸的表達，采用各種技術(shù)檢測，包括Northern雜交，PCR，原位雜交，等等。這種核酸在檢測失調(diào)表達時特別有用，例如RGS-GEF表達的細胞特異的和／或亞細胞的變化。RGS-GEF蛋白的水平可以單獨檢測或與其他基因產(chǎn)物(癌基因如p53，Rb，Wt1，等等)、轉(zhuǎn)錄物等等一起檢測。
根據(jù)所需目的不同，本發(fā)明的核酸可以在各種不同的系統(tǒng)中進行體外和體內(nèi)表達。例如，核酸可以被插入表達載體中，導入所需宿主，并在使該核酸編碼的多肽有效表達的條件下培養(yǎng)宿主。有效條件包括任何適于宿主細胞產(chǎn)生多肽的培養(yǎng)條件，包括有效的溫度，pH，培養(yǎng)基，培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基的添加物(例如，提高或誘導表達的添加物如丁酸，或如果編碼核酸靠近dhfr基因則添加氨甲喋呤)，放線菌酮(cyclohexamide)，細胞密度，培養(yǎng)皿等等?？梢酝ㄟ^任何有效的方法將核酸導入細胞中，例如，磷酸鈣沉淀法，電穿孔法，注射法，DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體融合，以及病毒轉(zhuǎn)染法。導入了本發(fā)明的核酸的細胞是被轉(zhuǎn)化的宿主細胞。該核酸可以存在于宿主細胞的染色體外或者整合到染色體上?？梢允欠€(wěn)定存在的或者是短暫存在的。根據(jù)與宿主細胞的相容性選擇表達載體。宿主細胞包括，哺乳動物細胞，如COS-7，CHO，HeLa，LTK，NIH3T3，酵母，昆蟲細胞，如Sf9(S．frugipeda)和果蠅，細菌，如大腸桿菌，鏈球菌，芽孢桿菌，酵母，真菌細胞，植物，胚胎干細胞(如哺乳動物，如小鼠或人)，癌細胞或腫瘤細胞Sf9的表達可以采用類似于Graziani等人，癌基因(Oncogene)，7229-235，1992的方法進行。相似地，表達控制序列的選擇根據(jù)與宿主的相容性和所需的目的，例如高拷貝數(shù)，高含量，誘導，提高，控制表達。可以使用的其他序列包括增強子如SV40、CMV、可誘導啟動子，細胞類型特異元件，或能夠選擇性表達或特異細胞表達的序列。
被標記的多肽可用于，例如結(jié)合檢測中，如鑒定與p115 Rho-GEF結(jié)合或附著的物質(zhì)，用于追蹤p115 Rho-GEF在細胞中的運動，用于體外、體內(nèi)、或原位系統(tǒng)中，等等。
本發(fā)明的核酸或多肽還可以為基本上純化?；旧霞兓侵冈摵怂峄蚨嚯谋换旧蠌钠渌怂峄蚨嚯闹蟹蛛x出來，就是說，該核酸或多肽是主要的和有活性的成分。
本發(fā)明的另一方面涉及RGS-GEF多肽參與的生物學途徑的調(diào)節(jié)，特別是病理條件，例如細胞增殖(如癌)，生長控制，形態(tài)發(fā)生，應(yīng)力纖維形成，以及整聯(lián)蛋白介導的相互作用，如胚胎發(fā)育，腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移，程序化細胞死亡，止血，白細胞歸巢(homing)和激活，骨吸收，血塊凝縮，以及細胞對機械應(yīng)力的反應(yīng)。參見，例如，Clark和Brugge，科學，268233-239，1995；Bussey，科學，272225-226，1996。因此，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)RGS-GEF多肽活性的方法的所有方面，包括給予有效劑量的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，有效劑量的調(diào)節(jié)RGS-GEF多肽活性的化合物，或者有效劑量的編碼RGS-GEF多肽或其生物學活性片段的核酸。被調(diào)節(jié)的RGS-GEF的活性包括與Gα亞單位結(jié)合或?qū)α亞單位的GAP活性。對活性的調(diào)節(jié)可以是提高，降低，拮抗，和促進RGS-GEF的表達或活性。
本發(fā)明還涉及特異識別RGS-GEF多肽的抗體。抗體，如多克隆的、單克隆的、重組的、嵌合的抗體，可以根據(jù)任何所需的方法進行制備。例如，為了制備單克隆抗體，可以將圖10，12，14，或16的RGS-GEF多肽經(jīng)皮下和／或腹膜內(nèi)施用給小鼠，山羊，或兔子，使用佐劑或不使用佐劑，多肽的劑量要能夠有效引起免疫反應(yīng)?？贵w也可以是單鏈或Fab?？贵w可以是IgG，亞型，IgG2a，IgG1等等。
RGS-GEF特異的抗體指該抗體識別GEF多肽RGS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列內(nèi)的特定的氨基酸序列，或是識別包括GEF多肽RGS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在內(nèi)的特定的氨基酸序列。因此，特異抗體對見于GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列即表位的結(jié)合，與對通過免疫印跡檢測檢測到的和／或測量的不同表位的氨基酸序列相比，具有更高的親和性。因此，特異于p115 Rho-GEF的RGS結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的表位，或者是包括RGS結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的表位的抗體可用于檢測樣品中表位的存在，例如，可以將含有p115 Rho-GEF基因產(chǎn)物的組織樣品同不含該表位的樣品區(qū)分開來。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以制備與GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體，例如，利用合成肽庫或aptamer(例如Pitrung等人，美國專利5，143，854；Geysen等人，1987，免疫學方法雜志(J．Immunol．Methods)102259-274；Scott等人，1990，科學，249386；Blackwell等人，1990，科學，2501104；Tuerk等人，1990，科學，249505)。
與GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體和其他配體，以及與p115Rho-GEF的RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)合的特異抗體和其他配體，可以各種方式加以利用。它們包括，但不限于，作為治療、診斷和商業(yè)研究的工具，例如，測定p115 Rho-GEF多肽在動物、組織、細胞內(nèi)等的水平，鑒定p115 Rho-GEF的細胞定位和／或分布，純化p115 Rho-GEF或含有部分p115 Rho-GEF的多肽，調(diào)節(jié)p115 Rho-GEF的功能，等等?？贵w可用于Western雜交、ELIZA、免疫沉淀、RIA，等等。本發(fā)明涉及這些檢測方法、組合物和進行檢測的試劑盒，等等。
本發(fā)明的抗體可用于在各種樣品，包括組織、細胞、體液、血液、尿、腦脊液中檢測含有GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域的多肽或片段。本發(fā)明的方法包括在本領(lǐng)域已知的有效條件下，接觸與圖10，12，14，或16的RGS-GEF多肽結(jié)合的配體，以結(jié)合、檢測配體和肽之間特異的結(jié)合。特異結(jié)合，是指配體附著到特定的氨基酸序列上，例如圖10，12，14，或16中所示的RGS結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列，或者是包括這些序列在內(nèi)的氨基酸序列，或其衍生物?？贵w或其衍生物因此可用于抑制含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白的表達。含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF多肽的水平可以單獨檢測或與其他基因產(chǎn)物一起檢測。特別地，含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF多肽的量(例如其表達水平)，可以與相同或不同樣品，如p21、p53、Rb、WT1等中其他多肽的量相比(例如作為比值)。
GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域的配體可以與其他抗體一起使用，例如識別癌的致癌標記的抗體，包括Rb，p53，c-erbB-2，癌基因產(chǎn)物，等等。一般地，對GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域特異的試劑可用于診斷和／或法醫(yī)學研究，研究可以根據(jù)任何所需的方法，例如美國專利5，397，712；5，434，050；5，429，947。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動物，例如，非人哺乳動物，例如含有RGS-GEF多肽的小鼠。轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)已知的方法制備，包括，例如，將重組基因注射到1-細胞胚胎的原核中，將人工酵母染色體摻入胚胎干細胞中，基因定向(targeting)方法，胚胎干細胞方法學。參見如美國專利4，736，866；4，873，316；5，082，779；5，304，489；5，174，986；5，175，384；5，175，385；5，221，778；Gordon等人，美國國家科學院院報(proc．Natl．Acad．Sci．)777380-7384(1980)；Palmiter等人，細胞，41343-345(1985)；Palmiter等人，遺傳學年度評述(Ann．Rev．Genet．)20465-499(1986)；Askew等人，分子細胞生物學(Mol．Cell．Bio．)134115-4124，1993；Games等人，自然，373523-527，1995；Valancius和Smithies，分子細胞生物學，111402-1408，1991；Stacey等人，分子細胞生物學，141009-1061，1994；Hasty等人，自然，350243-246，1995；Rubinstein等人，核酸研究，212613-2617，1993。本發(fā)明的核酸可被導入任何非人哺乳動物，包括小鼠(Hogan等人，1986，《小鼠胚胎操作實驗手冊》(Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)，豬(Hammer等人，自然，315343-345，1985)，羊(Hammer等人，自然，315343-345，1985)，牛，大鼠，或靈長類。另參見，例如，Church，1987，生物技術(shù)進展，513-19；Clark等人，生物技術(shù)進展，520-24；以及DePamphilis等人，1988，生物技術(shù)(BioTechniques)，6662-680。另外，定做的(custom)轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠能夠從商業(yè)上得到。這些轉(zhuǎn)基因動物可用于癌癥模型或作為模型評價RGS-GEF多肽過量表達的效果。
一般地，本發(fā)明的核酸，多肽，抗體，等等可按美國專利5，501，969，5，506，133，5，441，870；WO 90／00607；WO 91／15582中所述進行制備和利用。
本發(fā)明的其他方面涉及調(diào)節(jié)下列相互作用和效果的分子的檢測或鑒定方法GEF的RGS結(jié)構(gòu)域與其同源結(jié)合底物的相互作用；GEF的RGS結(jié)構(gòu)域與Gα亞單位的相互作用；G蛋白亞單位對含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白的鳥嘌呤核苷酸交換活性的刺激效果；具有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白對G蛋白亞單位的GTP酶激活蛋白的效果。
活性可以各種方式進行調(diào)節(jié)，例如增強、激活、刺激、阻遏、預(yù)防、抑制，等等。調(diào)節(jié)分子可以是激動劑、拮抗劑，或具有其部分活性。調(diào)節(jié)分子可以是任何類型的分子，包括但不限于小分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸，等等。一般地，具有體外活性的化合物可用于體內(nèi)調(diào)節(jié)與含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白有關(guān)的生物學途徑，例如，治療與上述生物學和細胞活性有關(guān)的病理條件。調(diào)節(jié)分子可以含有相同或不同分子的混合物。
GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的結(jié)合底物是能夠被RGS結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合的任何物質(zhì)，包括Gα12家族的成員。參見，例如，Strathman和Simon，美國國家科學院院報，885582，1991。例如，鑒定或檢測調(diào)控或調(diào)節(jié)G蛋白α亞單位與含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白結(jié)合分子的方法，如p115 Rho-GEF，可以根據(jù)本發(fā)明進行。在一個實施例中，GTP結(jié)合的α亞單位或其衍生物與含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白或其片段在存在或不存在供試分子時一起溫育，確定供試分子的存在是否調(diào)節(jié)GEF蛋白和G蛋白α亞單位的結(jié)合。溫育是在有效條件下進行的，就是說，是在結(jié)合或附著可以發(fā)生的條件下進行的。結(jié)合可以以一種或多種方式檢測。例如，GEF蛋白或結(jié)合底物被標記使其可以被檢測；將被標記的結(jié)合的組分從被標記的自由組分中分離出來；并確定被可檢測結(jié)合標記的GEF蛋白或結(jié)合底物的量?？蓹z測的標記物可以是任何所需的成分，例如，放射性的，熒光的，等等。這種檢測可以在固相或液相中進行。
在本發(fā)明的一個方面，需要鑒定調(diào)節(jié)Gα12家族亞單位如Gα12和Gα13與GEF(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、或DrhoGEF2)的結(jié)合的分子。進行檢測時可以使用完整的GEF蛋白，或其含有RGS結(jié)構(gòu)域、或RGS結(jié)構(gòu)域的生物學活性亞片段的任何亞片段。進行檢測時通常是用Gα亞單位的GTP結(jié)合狀態(tài)的穩(wěn)定類似物，包括與GDP-AIF4-或GTPγS結(jié)合的α亞單位。例如，結(jié)合檢測可以根據(jù)下面實施例5中描述的步驟進行，其中COS細胞被用myc-標記多肽(如p115 Rho GEF)或其片段的核酸構(gòu)件轉(zhuǎn)染，多肽和α亞單位的復(fù)合體檢測是通過沉淀第一抗體對一種組分形成的任何結(jié)合復(fù)合體，并檢測與第二抗體形成的第二結(jié)合組分的量。結(jié)合檢測還可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行，例如通過將一種組分結(jié)合到柱子上，然后確定與柱子結(jié)合的第二個標記組分的量。相關(guān)的檢測方法還在如Berman等人，1996，生物化學雜志，27127209中被公開。
分離或檢測調(diào)控或調(diào)節(jié)RGS-GEF多肽對GTP酶活性(如Gα亞單位的GTP酶活性)的刺激作用的分子的方法，也可以根據(jù)本發(fā)明進行。例如，在有效條件下Gα亞單位與具有GTP酶刺激作用的RGS-GEF多肽在存在或不存在供試抑制劑時溫育，確定供試抑制劑的存在是否調(diào)控其刺激作用。進行檢測時可以使用完整的RGS-GEF多肽、GEF蛋白，或其含有RGS結(jié)構(gòu)域、或RGS結(jié)構(gòu)域的生物學活性亞片段的任何亞片段。RGS-GEF多肽可以是p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2，或其生物學活性片段。例如，檢測進行時可以利用p115 Rho GEF與α12或α13亞單位按照此處討論的實施例中描述的方法，以及利用本領(lǐng)域熟知的其他變化或檢測方法進行。例如，檢測可以根據(jù)下面的實施例5進行，加入Gα亞單位與[γ-32P]GTP，在各種條件下，包括存在RGS-GEF多肽時，通過離心檢測混合物后測定上清液中32Pi的量，來確定其水解程度。相關(guān)的檢測方法在如Berman等人，1996，生物化學雜志，27127209中也被公開。
鑒定或檢測調(diào)控激活的Gα亞單位對具有GEF介導的單體G蛋白核苷酸交換的RGS-GEF多肽的刺激作用的分子的方法，也可以根據(jù)本發(fā)明進行。例如，第一步檢測是通過將激活的Gα亞單位與GEF蛋白(例如p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2，或是其保留了GEF活性的生物學活性片段)和單體G蛋白在存在或不存在供試調(diào)控物時溫育，確定供試調(diào)控物是否對激活的Gα亞單位刺激GEF介導的單體蛋白核苷酸交換的能力具有抑制、增強等作用。參見Hart等人，1996，生物化學雜志22125452。供試調(diào)控物還可以通過第二次檢測加以評價，在檢測中所述GEF蛋白和單體G蛋白，沒有G蛋白亞單位，在存在或不存在供試調(diào)控物下溫育以確定供試調(diào)控物是否對GEF介導的單體蛋白的核苷酸交換具有任何作用，然后比較第一次檢測和第二次檢測中的調(diào)控作用以確定第一次檢測中的調(diào)控作用是否有別于第二次檢測中的調(diào)控作用，從而說明，供試調(diào)控物調(diào)控的是激活的Gα亞單位與GEF蛋白的相互作用而不是GEF蛋白與單體G蛋白的相互作用。例如，對GEF介導的鳥嘌呤核苷酸交換的刺激作用可以根據(jù)下面的實施例6進行測定，其中RhoA與[3H]GDP一起加入，在各種條件下通過在后面的溫育之前用過濾法確定結(jié)合的GDP，而測定GDP從RhoA的解離。(參見例如，Northrup等人，生物化學雜志257，11416-11423(1982))。
鑒定能夠模擬激活的Gα亞單位對GEF介導的單體G蛋白的核苷酸交換的刺激作用的分子的方法，也可以根據(jù)本發(fā)明進行。該方法包括鑒定對GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物，然后將GEF蛋白和單體G蛋白在存在或不存在供試化合物時溫育，確定供試化合物是否表現(xiàn)出對GEF介導的單體G蛋白的核苷酸交換具有刺激作用。對GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物的鑒定可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)完成。例如，將RGS多肽結(jié)合到柱子上，將供試化合物的混合物過柱確定是否有化合物選擇性地結(jié)合柱子。
鑒定能夠模擬GEF多肽的RGS結(jié)構(gòu)域?qū)α亞單位的GTP酶活性刺激作用的分子或分子混合物的方法，也可以根據(jù)本發(fā)明進行。該方法包括鑒定對Gα亞單位表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物，然后將GTP承載的Gα亞單位在存在或不存在供試化合物時溫育，確定供試化合物是否表現(xiàn)出對Gα亞單位的GTP酶活性的刺激作用。對Gα亞單位表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物的鑒定可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)完成。例如，可將Gα12結(jié)合到一種底物上，并與含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF多肽和供試化合物一起溫育，以確定供試化合物是否與RGS結(jié)構(gòu)域競爭與Gα亞單位的結(jié)合。
RGS-GEF組分或其衍生物對致癌轉(zhuǎn)移活性的調(diào)控可以根據(jù)各種已知的步驟測定，例如Eva和Aaronson，自然，316273-275，1985；Hart等人，生物化學雜志，26962-65，1994。在該方法中可以在任何時間加入某一化合物(例如在細胞預(yù)處理時，加入RGS-GEF以后，等等)以確定它對RGS-GEF組分的致癌轉(zhuǎn)移活性的作用。還可以使用各種細胞株。
單體GTP酶介導的信號傳導的其他檢測方法可以根據(jù)本發(fā)明通過本領(lǐng)域已知的類似方法完成，例如，如在美國專利5，141，851；5，420，334；5，436，128；以及5，482，954；WO94／16069；WO93／16179；WO91／15528；WO90／00607中所述。
本發(fā)明因此還涉及對與含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白介導的信號傳導有關(guān)疾病和病理學條件的治療和預(yù)防，例如，癌，與非正常細胞增殖有關(guān)的疾病。例如，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，該方法包括給需要治療的對象給予一定量的能夠有效治療疾病的化合物，其中的化合物是含有RGS的GEF蛋白對Gα亞單位GTP酶活性刺激作用的調(diào)控物，或者該化合物是Gα亞單位對GEF介導的單體GTP酶核苷酸交換刺激作用的調(diào)控物。治療疾病指延緩它的發(fā)生、延緩疾病的發(fā)展、改善或延緩疾病的臨床和病理學癥狀。調(diào)控化合物，或化合物的混合物可以是合成的、天然形成的、或是二者的結(jié)合。調(diào)控混合物包括氨基酸、核苷酸、碳氫化合物、脂類、多糖，等等。調(diào)控化合物優(yōu)選調(diào)節(jié)含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白表達的化合物，例如，抑制或增加其mRNA、蛋白質(zhì)的表達或加工，或是調(diào)節(jié)GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域與Gα亞單位相互作用的化合物。為了治療疾病，該化合物或混合物可以制成藥物組合物，它含有藥學上可接受的載體和其他對于熟練工人來說很明白的賦形劑。參見，例如《雷氏藥物科學》(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)第八版，Mack出版公司，1990。這種組合物還可以含有有效劑量的其他化合物，特別是對于癌癥的治療。
實施例實施例1．鑒定Rho GEF與調(diào)節(jié)G蛋白信號傳導的蛋白質(zhì)之間的同源性RGS家族蛋白是G蛋白信號傳導的負調(diào)節(jié)物。已鑒定了本家族的19個哺乳動物成員，它們都編碼含有被稱為RGS盒的同源性核心的蛋白質(zhì)。
對一種Rho特異的GEF，p115-GEF序列的檢查顯示一個對RGS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域具有特異同源性的N-端區(qū)，RGS蛋白包括RGS4、RGS2、GAIP、RGS12，和RGS14(圖1)。對另外三種Rho GEF蛋白，Lsc、KIAA380，和DrhoGEF的分析也顯示它們含有對RGS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域具有特異同源性的區(qū)域(圖1)。
RGS4和AIF4-激活的Gαil復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，RGS4的功能核心(RGS盒)含有折疊為兩個小亞結(jié)構(gòu)域的9個α-螺旋(Tesmer等，細胞，89，251(1997))。RGS盒顯示出具有對Gα亞單位的GAP活性(Popov等人，美國國家科學院院報，94，7216(1997))。RGS盒的疏水核心殘基在RGS家族成員中是保守的，它們對于結(jié)構(gòu)和GAP活性的穩(wěn)定性很重要(Tesmer等，細胞，89，251(1997)和Srinivasan等人，生物化學雜志，273，1529(1998)。RGS4通過與Gαil的三個轉(zhuǎn)換區(qū)相互作用，主要是通過穩(wěn)定GTP水解的過渡態(tài)而刺激Gαil的GTP酶活性(Tesmer等，細胞，89，251(1997))。
形成RGS結(jié)構(gòu)域的核心的大多數(shù)疏水殘基在p115 Rho GEF中是保守的(23個殘基中有17個是保守的)(圖1)。序列對比中缺口的位置相應(yīng)于RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的α-螺旋的環(huán)。這種同源性提示p115 GEF的N-端區(qū)可能具有與RGS4盒結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)，并擁有GAP活性。相反，RGS4與Gαil(GDP-AIF4-)的轉(zhuǎn)換區(qū)相接觸的殘基的保守性不高，而且p115 Rho GEF的任何GAP活性都將具有獨特的機制或與以前鑒定的那些具有顯著不同的特異性。
基因文庫搜索顯示另外三個具有與p115的RGS區(qū)同源的Rho-GEF成員。它們包括Lsc、KIAA380，和DrhoGEF2(圖1)。Lsc似乎是p115 Rho GEF的小鼠同系物而KIAA380似乎是果蠅DrhoGEF2的人同系物(Whitehead等人，生物化學雜志，271，18643(1996)；Barret等人，細胞，91，905(1997))。這四種Rho-GEF構(gòu)成新的也擁有Rho鳥嘌呤核苷酸交換活性的RGS相關(guān)家族蛋白。
四種已知含有RGS結(jié)構(gòu)域的GEF蛋白(p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380、DrhoGEF2)與RGS蛋白RET-RGS1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS7、RGS10、RGS12、RGS14、Rap1／2B．P．，和GAIP的RGS結(jié)構(gòu)域的序列對比顯示，四種GEF蛋白的RGS序列構(gòu)成新的亞RGS共有序列(圖18)。如圖18中底部的序列所示，新的亞RGS共有序列在同源序列對比中以13至14個氨基酸的大缺口表示，缺口的兩邊是保守氨基酸。實施例2．RHO GEF蛋白p115 RHO GEF刺激Gα13和Gα12亞單位的GTP酶活性。
測試p115 Rho GEF以確定其刺激Gα13和Gα12亞單位固有的GTP酶活性(GAP活性)的能力。
在Sf9細胞中表達Gα12并按Kozasa和Gilman，生物化學雜志270，1734(1995)中所述將其純化。Gα13的制備步驟相似，利用前面描述的桿狀病毒法(Singer和Miller，生物化學雜志，269，19796(1994))，將異源三體固定在Ni-NTA樹脂(Qiagen)上以后的洗滌和洗脫α亞單位時利用辛基糖苷(octylglucoside)。洗脫下來的Gα13進一步通過羥基磷灰石吸收和洗脫加以純化。Gα12或Gα13(20-30pmol)在30℃下并且存在5mM EDTA時分別與5μM[γ-32P]GTP(50-100cpm／fmol)溫育30或40分鐘。然后將樣品迅速在4℃通過Sephadex G50柱離心過濾，G50柱事先用緩沖液A(50mMNaHepes(pH8．0，1mM二硫蘇糖醇，5mM EDTA，0．05％聚氧乙烯10-月桂基醚)平衡，以除去游離的[γ-32P]GTP和[32Pi]。加入含有8mM MgSO4、1mM GTP和指定量p115的緩沖液A溶解的Gα和[γ-32P]GTP使GTP開始水解。反應(yīng)混合物在4℃或15℃下溫育。在指定時間取出一等份(50微升)與50mM NaH2PO4中的750μl 5％(w／v)Norit A混合。將混合物以2000轉(zhuǎn)／分離心5分鐘，400微升含有32Pi的上清液用液體閃爍計數(shù)法計數(shù)。
與Gα13和Gα12結(jié)合的GTP的水解是在15℃、有或沒有10nM全長p115(圖2，A)下進行的。在4℃、存在各種濃度的p115下測定與Gα13和Gα12結(jié)合的GTP的水解(圖2，B)。全長的p115能夠刺激一輪預(yù)先結(jié)合到Gα13亞單位的[γ-32P]GTP的水解。與Gα13同源性最近的Gα12的固有的GTP酶活性也受全長的p115刺激。在15℃下，Gα12(0．07min-1)和Gα13(0．24min-1)對GTP水解的Kcat被p115刺激分別增加了5倍和10倍(圖2，A)。用幾種Gα12和Gα13制品獲得了相似的結(jié)果。90℃處理p115可使該GAP活性失活。因為Gα13的水解速率很迅速，檢測在4℃進行以更好地估計p115對G蛋白的GTP酶活性初始速度的影響(圖2，B)。在這些條件下，100nMp115使Gα13的GTP酶活性增加80倍。相反，Gα12的水解速度僅增加6倍。盡管在p115的濃度低至1nM也能觀察到對兩種蛋白的刺激作用，但是在兩種溫度下的檢測說明與Gα12相比，p115是Gα13的更有效的GAP。
在沒有受體時，GTPγS與Gα結(jié)合和GTP的穩(wěn)態(tài)水解的限速步驟是GDP的釋放。p115既不能影響GTPγS與Gα13和Gα12結(jié)合的速度，也不能影響各亞單位的GTP酶活性的穩(wěn)態(tài)。因此，p115僅僅刺激Gα13和Gα12固有的GTP酶活性，而不影響它們的核苷酸交換速度。
RGS蛋白保守的RGS盒在體外足以表現(xiàn)GAP活性(Popov等人，美國國家科學院院報，94，7216(1997))。所以，谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶和p115的N端區(qū)的一個融合蛋白GST-RGS用于檢測GAP活性。該區(qū)含有RGS同源結(jié)構(gòu)域但不是p115的Db1或PH結(jié)構(gòu)域。在測試對Gα12和Gα13的GAP活性時，p115的這個“RGS結(jié)構(gòu)域”(10nM)幾乎與全長的p115具有同樣的活性(圖3)。相反，一個缺失了N端區(qū)的p115構(gòu)件是無效的。因此，該數(shù)據(jù)顯示RGS同源區(qū)負責p115的GAP活性。實施例3．p115 RHO-GEF不能刺激Gαi、Gαz、Gαq和Gαs亞單位的GTP酶活性p115的GAP活性對不同G蛋白亞單位的特異性的檢測如下。
Gαs按Lee等人，酶學方法(Meth．Enxymol．)，237，146(1994)中所述在大腸桿菌中表達并純化。Gαi、Gαz和GαqR183C按Kozasa和Gilman，生物化學雜志270，1734(1995)和Biddlecome等人，生物化學雜志，271，7999(1996)中所述在Sf9細胞中表達并純化。Gαi、Gαz和Gαs與5-10μM[γ-32P]GTP于5mM EDTA存在下在20℃(Gαs)或30℃(GαI和Gαz)下溫育20分鐘，并按上述Gα12和Gα13的方法檢測GAP活性。對Gαq的GAP活性檢測用突變的GαqR183C進行。在GαiR1178C中一個相似的突變顯著降低了GTP酶活性，但保留了對RGS蛋白的反應(yīng)(Berman等人，細胞，86，445(1996))。GαqR183C的低GTP酶活性使得[γ-32P]GTP對Gαq載承不用受體以加速核苷酸交換。GαqR183C與10μM[γ-32P]GTP在存在50mM Hepes(pH7．4)，0．1mg／ml BSA，1mM DTT，1mM EDTA，0．9mM MgSO4，30mM(NH4)2SO4，4％甘油，和5．5mMCHAPS時，在20℃下溫育2小時。將反應(yīng)混合物迅速通過SephadexG50柱過濾，G50柱事先用50mM Hepes(pH7．4)，1mM DTT，1mMEDTA，0．9mM MgSO4，0．1mg／ml BSA，和1mM CHAPS平衡。
此研究的結(jié)果說明在RGS4作為這些Gα亞單位的GAP的條件下，p115(100nM)不能刺激Gαi、Gαz或Gαq的GTP酶活性(圖4)。相似地，p115不能增加Gαs的GTP酶活性，p115 Rho GEF對RhoA或racl也不具有GAP活性。因此，p115是對Gα12和Gα13特異的GAP。實施例4．AIF4-激活形式的Gα亞單位選擇性抑制p115的GAP活性RGS蛋白已被證明具有對GDP-AIF4-結(jié)合形式的α亞單位具有高親和性，α亞單位的這種構(gòu)象與GTP水解的過渡態(tài)相似(Tesmer等人，細胞，89，251(1997)，Berman等人，生物化學雜志，271，27209(1996))。因此，GDP-AIF4-形式的Gα亞單位應(yīng)該同GαGTP競爭與p115的相互作用，并阻斷所觀察到的GAP活性。如圖5，A中所示，被GDP-AIF4-結(jié)合的Gα12和Gα13有效地抑制了p115對Gα12的GAP活性，而對形式相似的Gαs、Gαi和Gαq無效。另外，對GDP-AIF4-結(jié)合形式的Gα12和Gα13的滴定分析，表明這些亞單位在抑制Gα13的GAP活性方面具有相同的能力(圖5，B)。這些競爭分析顯示兩種G蛋白亞單位對p115具有相似的親和性，并且支持圖2中所示p115對亞單位不同的表觀效率。實施例5．體內(nèi)Gα13與p115 Rho GEF的結(jié)合下面的實驗證明Gα13與p115 Rho GEF以依賴GTP的方式相互作用。
按前面在Hart等人，生物化學雜志271，25452-25458(1996)中所述，構(gòu)建了缺失了RGS或DH結(jié)構(gòu)域的、EXV-myc標記的(對于COS細胞轉(zhuǎn)染)和pAc-Glu標記的(對于桿狀病毒表達)蛋白。在相同的載體中構(gòu)建了全長的蛋白。在pGEX4T-2(Pharmacia)中構(gòu)建了GST與p115 Rho GEF的前246個氨基酸的融合體。轉(zhuǎn)染，免疫沉淀和純化按前面在Hart等人，生物化學雜志271，25452-25458(1996)中所述進行。
在用myc標記的p115 Rho GEF轉(zhuǎn)染的COS細胞中，Gα13可以使用抗-myc抗體進行特異性免疫沉淀(圖6，A和B)。這種相互作用有賴于氟化鋁的存在，將氟化鋁加入以模擬Gα13的被激活的GTP結(jié)合狀態(tài)。另外，p115 Rho GEF的一種缺少RGS結(jié)構(gòu)域氨基端的截短突變體不能夠介導共免疫沉淀，而缺失了DH結(jié)構(gòu)域的全長蛋白介導共免疫沉淀。全長的和截短的Rho GEF蛋白的不同結(jié)合也可以利用Gα13的抗體免疫沉淀復(fù)合體來檢測(圖6，C)。與Gα12非常弱的相互作用是可檢測的，而Gαs、Gαi、Gαq和Gαz的抗體在抗myc免疫沉淀中檢測不到免疫活性帶，盡管事實上它們各自的抗原在全細胞裂解物中是可檢測到的。p115 Rho GEF和Gα13的共免疫沉淀可以在一種半純化系統(tǒng)中重現(xiàn)，在該系統(tǒng)中加入純化的Gα13以免疫沉淀p115 Rho GEF(圖6，D)，這提示直接的相互作用。直接的相互作用與觀察到的p115 Rho GEF刺激Gα13的GTP酶活性相一致，還說明p115 Rho可能是Gα13的效應(yīng)物。
Rho GEF蛋白KIAA380和α12G蛋白亞單位之間的結(jié)合也可以檢測到(圖9中KIAA380稱為FL147)。在用myc標記的KIAA380轉(zhuǎn)染的COS細胞中，可以利用抗-myc抗體將Gα12特異地免疫沉淀下來(圖9，A和B，KIAA380為FL147)。這種相互作用有賴于氟化鋁的存在，加入的氟化鋁模擬Gα13被激活的GTP結(jié)合態(tài)。實施例6．Gα13對p115 Rho GEF活性的刺激通過將RhoA和p115 Rho GEF在有或沒有Gα13時溫育，確定對其鳥嘌呤核苷酸交換的影響，來檢測Gα13影響p115 Rho GEF的交換活性的能力。
RhoA(2．5μM)與[3H]GDP在30℃溫育1小時，25μMGDP(10，000 cpm／pmol)溶解于50mM NaHepes，pH7．5，50mM NaCl，4mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇和0．1％ Triton X-100中。添加MgCl2至9mM、辛基糖苷至1％后，將Rho再溫育5分鐘，通過Sephadex-G50快速將Rho與游離GDP分開，Sephadex-G50事先用50mM NaHEPES，pH7．5，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇，5mMMgCl2，和1％辛基糖苷平衡。GDP從RhoA的解離在30℃下，在20微升的50mM NaHEPES，pH7．5，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇，5mM MgCl2，30mM AlCl3，5mM NaF，和5μMGTPγS中進行測定。除非特定說明，G蛋白α亞單位與AMF(30μM AlCl3，5mM MgCl2，和5mM NaF)在與其它蛋白混合前進行預(yù)溫育。如所示，用25μM GTPγS或GDPβS而不是AMF處理α亞單位，而且反應(yīng)不與AMF而是與5μM各種核苷酸溫育。加入[3H]-GDP-RhoA啟動反應(yīng)，結(jié)合的GDP通過在溫育前和溫育后進行過濾來測定(Norhtup等人，生物化學雜志，257，11416-11423(1982))。
Gαs和Gαi亞單位在大腸桿菌中表達以后被純化(Lee等人，酶學方法，237，146-164(1994))。Gαq和Gαz亞單位是在Sf9細胞中與六組氨酸標記的β和γ亞單位共表達的，并按(Kozasa和Gilman，生物化學雜志，270，1734-1741(1995))所述加以分離。Gα13的制備步驟與Gα12相似，將異源三體固定在Ni-NTA樹脂(Qiagen)上后，在洗滌和洗脫α亞單位時利用桿狀病毒(Singer等人，生物化學雜志，269，19796-19802(1994))和辛基糖苷。洗脫的Gα13通過羥基磷灰石的吸附和洗脫被進一步純化。從3升細胞中可以得到大約500μg純化的Gα13GST-RhoA在Sf9細胞中的表達，GST標記的切割和自由RhoA的分離按Singer等人，生物化學，271，4505-4510(1996)中所述進行。
這些研究表明Gα13能夠刺激全長p115 Rho GEF的活性，其方式依賴于p115 Rho GEF(圖7，A)和Gα13(圖7，B)的濃度。與Gα13非常接近的α亞單位Gα12在這些實驗中不能刺激p115 RhoGEF的活性(圖7，A)。對Rho交換能力的刺激還可以被監(jiān)測為Gα13激活態(tài)的函數(shù)。圖7，C所繪的數(shù)據(jù)證實對交換活性的刺激依賴于氟化鋁(AMF)或GTPγS，但不受GDPβS所模擬的失活的核苷酸態(tài)所刺激。一系列的其它α亞單位包括Gαq、Gαz、Gαs和GαI也不影響p115 Rho GEF的活性(圖7，D)。這些結(jié)果與圖6中激活的依賴Gα13的結(jié)合相一致，并說明Gα13與p115 Rho GEF的有效結(jié)合足以進行激活。實施例7．p115和Gα12的結(jié)構(gòu)域?qū)115核苷酸交換活性的影響p115 Rho GEF的RGS結(jié)構(gòu)域通常是自我抑制的，而與Gα13的結(jié)合則減輕這種抑制作用，對這一理論的檢查是通過比較全長的Rho-GEF與截短的Rho-GEF對Rho交換活性的影響。
p115蛋白的制備按上面實施例1中所述和Hart等人，生物化學雜志，271，25452-25458(1996)中所述進行。檢測結(jié)果示于圖8，B和C按上面的實施例5中所述進行。AMF為激活劑。
這些實驗的結(jié)果說明，缺少了RGS結(jié)構(gòu)域的截短的p115 RhoGEF與相同濃度的全長蛋白相比，表現(xiàn)出大大升高的Rho交換活性(圖8，A)。另外，加入所分離的RGS結(jié)構(gòu)域(以GST融合蛋白的形式)導致受Gα13刺激的p115 Rho GEF活性消失(圖8，B)。這些數(shù)據(jù)并不排除在p115 Rho GEF上存在其它的Gα13結(jié)合位點，但是它們確實暗示了通過RGS結(jié)構(gòu)域的基本作用方式。
根據(jù)p115 Rho GEF能夠激活Gα12和Gα13的GTP酶這一事實，Gα12不能激活p115 Rho GEF是令人困惑的。因此，進行了一個實驗，將Gα12加入到受Gα13刺激的p115 Rho GEF的檢測中(圖8，C)。結(jié)果說明Gα12能夠抑制Gα13與p115 Rho GEF的偶聯(lián)。該數(shù)據(jù)與一個模型相一致，在該模型中，Gα12同Gα13競爭與p115Rho GEF的RGS結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。但是，Gα12與p115 Rho GEF的結(jié)合很明顯不足以刺激Rho的交換活性。這些結(jié)果說明或者是Gα12與p115 Rho GEF的RGS結(jié)構(gòu)域的相互作用與Gα13有很大的不同，或者是存在另外的Gα13與p115 Rho GEF相互作用位點。
對于核酸、多肽、抗體等等的其它方面，可參考分子生物學、蛋白質(zhì)科學和免疫學的標準教科書。參考，例如，Davis等人(1986)，分子生物學基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevir科學出版公司，紐約；Hames等人(1985)，核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，IL出版社，分子克隆，Sambrook等人；現(xiàn)代分子生物學技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology)，F(xiàn)．M．Ausubel等人編著，John Wiley & Sons出版公司；現(xiàn)代人類遺傳學技術(shù)(CurrentProtocols in Human Genetics)，Nicholas C．Dracopoli等人編著，JohnWiley & Sons出版公司；現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學技術(shù)(Current Protocols inProtein Science)，John E．Coligan等人編著，John Wiley & Sons出版公司；現(xiàn)代免疫學技術(shù)(Current Protocols in Immunology)，John E．Coligan等人編著，John Wiley & Sons出版公司。此處引用的所有專利申請、專利和出版物的完整公開在此將其引入作為參考。
通過前面的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地掌握本發(fā)明的基本點，并且能夠在不違背本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對本發(fā)明進行各種改變或改造，以適應(yīng)各種用途和條件的要求。
權(quán)利要求
1．一種分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，它基本上由GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域組成。
2．一種分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，它含有GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域，前提是該多肽不含有DH結(jié)構(gòu)域或PH結(jié)構(gòu)域。
3．一種分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中多肽選自p115 Rho-GEF、Lsc、KIAA380，并且該多肽在RGS結(jié)構(gòu)域中突變，而且該多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中GEF蛋白是Rho GEF蛋白。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中Rho GEF蛋白是p115 Rho-GEF。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中Rho GEF蛋白選自Lsc、KIAA380和DrhoGEF2。
7．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
8．根據(jù)權(quán)利要求4的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
9．根據(jù)權(quán)利要求5的分離的RGS-GEF多肽或其生物學活性片段，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。10．一種分離的RGS-GEF核酸，它基本上由編碼含有GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的多肽的核苷酸序列組成。
11．一種分離的RGS-GEF核酸，它含有編碼具有GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域的多肽的核苷酸序列，其中多肽不包括DH結(jié)構(gòu)域或PH結(jié)構(gòu)域。
12．根據(jù)權(quán)利要求10或11的分離的RGS-GEF核酸，其中GEF蛋白是Rho GEF蛋白。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的分離的RGS-GEF核酸，其中Rho GEF蛋白是p115 Rho GEF。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的分離的RGS-GEF核酸，其中Rho GEF蛋白選自Lsc、KIAA380和DrhoGEF2。
15．根據(jù)權(quán)利要求10或11的分離的RGS-GEF核酸，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
16．根據(jù)權(quán)利要求12的分離的RGS-GEF核酸，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
17．根據(jù)權(quán)利要求13的分離的RGS-GEF核酸，其中多肽對G蛋白α亞單位具有特異結(jié)合親和性，或者是對G蛋白α亞單位具有GTP酶激活活性。
18．一種調(diào)控G蛋白α亞單位活性的方法，包括給哺乳動物施用有效劑量的權(quán)利要求1或4的多肽。
19．一種鑒定或檢測抑制或增強單體G蛋白鳥嘌呤核苷酸交換因子與G蛋白α亞單位結(jié)合的分子的方法，包括將G蛋白α亞單位或其片段與單體G蛋白核苷酸交換因子或其片段在存在或不存在供試分子的情況下溫育，確定供試分子的存在是否抑制或增強單體G蛋白鳥嘌呤核苷酸交換因子與G蛋白α亞單位的結(jié)合。
20．一種鑒定或檢測抑制或增強GEF對Gα亞單位GTP酶活性的刺激作用的分子的方法，包括將Gαα亞單位或其片段與GEF蛋白或其片段在存在或不存在供試分子的情況下溫育，確定供試分子的存在是否抑制或增強GEF蛋白對Gα亞單位GTP酶活性的刺激作用。
21．一種鑒定或檢測特異地抑制激活的Gα亞單位對單體G蛋白GEF介導的核苷酸交換的刺激作用的分子的方法，包括進行第一次檢測，將激活的Gα亞單位或其片段與GEF蛋白或其片段以及單體G蛋白或其片段在存在或不存在供試抑制劑下溫育，進行第二次檢測，將GEF蛋白或其片段和單體G蛋白或其片段在存在或不存在供試抑制劑的情況下溫育，確定是否供試抑制劑在第一次檢測中的抑制作用比供試抑制劑在第二次檢測中的抑制作用更強。
22．一種鑒定或檢測特異地增強激活的Gα亞單位對單體G蛋白GEF介導的核苷酸交換的刺激作用的分子的方法，包括進行第一次檢測，將激活的Gα亞單位或其片段與GEF蛋白或其片段以及單體G蛋白或其片段在存在或不存在供試增強劑條件下溫育，進行第二次檢測，將GEF蛋白或其片段和單體G蛋白或其片段在存在或不存在供試增強劑的情況下溫育，確定是否供試增強劑在第一次檢測中的增強作用比供試增強劑在第二次檢測中的增強作用更強。
23．一種鑒定或檢測模擬激活的Gα亞單位對單體G蛋白GEF介導的核苷酸交換刺激作用的分子的方法，包括鑒定對GEF蛋白的RGS結(jié)構(gòu)域或其片段表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物，將GEF蛋白或其片段與單體G蛋白或其片段在存在或不存在供試化合物的情況下溫育，確定供試化合物是否表現(xiàn)出對單體G蛋白GEF介導的核苷酸交換具有刺激作用。
24．一種鑒定或檢測模擬GEF蛋白RGS結(jié)構(gòu)域?qū)α亞單位GTP酶活性刺激作用的分子的方法，包括鑒定對Gα亞單位表現(xiàn)出結(jié)合親和性的供試化合物，將GTP和Gα亞單位在存在或不存在供試化合物的情況下溫育，確定供試化合物是否對Gα亞單位的GTP酶活性具有刺激作用。
25．根據(jù)權(quán)利要求19、20、21、22、23，或24的方法，其中GEF蛋白選自p115 Rho GEF、Lsc、KIAA380，和DrhoGEF2。
26．一種在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達由核酸編碼的多肽的方法，包括培養(yǎng)含有權(quán)利要求11的核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
27．一種含有權(quán)利要求11的核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
28．一種含有權(quán)利要求11的核酸的載體。
全文摘要
單體GTP酶鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)已被鑒定,它也含有一個與GTP酶激活蛋白(GAP)類似的RGS區(qū)。這些GEF蛋白之一的Rho GEF已被證明含有對異源三體G蛋白的α亞單位具有GAP活性的RGS序列。
文檔編號C07K14/435GK1293709SQ99804014
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月18日
發(fā)明者G·伯拉格, M·J·哈特, W·洛斯科, P·伯拉奇斯, P·斯特恩威斯, T·科扎薩, X·姜 申請人:昂尼克斯藥物公司, 德克薩斯州立大學董事會