專利名稱：核糖核苷酸還原酶m1基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及核糖核苷酸還原酶Ml基因檢測試劑盒， 是通過利用SYBR GREEN I熒光定量PCR，檢測腫瘤組織中吉西他濱抗癌藥 敏感性相關(guān)基因，核糖核苷酸還原酶M1亞單位(RRM1)基因mRNA表達(dá)水 平的試劑盒。 技術(shù)背景核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase ,RR)是DNA合成通路中的限 速酶,它能逆轉(zhuǎn)二磷酸核苷酸為二磷酸脫氧核苷酸，后者是DNA合成和修復(fù)必 不可少的。RR包括2個亞單位:M1和M2 。 Ml亞單位控制底物的特異性和 整個酶的活性;M2亞單位攜帶接觸抑制區(qū),控制底物轉(zhuǎn)化。RRM1基因被認(rèn)為 是一種抑癌基因,能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，定位于染色體Uql5. 5區(qū)域著絲粒部分，該 區(qū)域稱為LOHllA, 75 y。的NSCLC患者有異質(zhì)性缺失，這種異質(zhì)性缺失與患者 預(yù)后差成正比。吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，主要作用于DNA合成期(S期)，也可阻止 Gl期向S期進(jìn)展,是細(xì)胞周期特異性藥物。吉西他濱作為一種前藥在細(xì)胞內(nèi)是 脫氧胸苷激酶磷酸化的良好底物,在酶的作用下轉(zhuǎn)化成吉西他濱一磷酸鹽、吉西 他濱二磷酸鹽、吉西他濱三磷酸鹽，其中吉西他濱二磷酸鹽、吉西他濱三磷酸鹽 為活性產(chǎn)物。吉西他濱三磷酸鹽插入DNA鏈后,可抑制DNA聚合,進(jìn)而抑制 DNA合成和修復(fù);吉西他濱二磷酸鹽可抑制核糖核苷酸還原酶,從而減少了 DNA合成和修復(fù)所需的脫氧核苷酸的量,使DNA合成發(fā)生障礙。當(dāng)RRM1表 達(dá)過高,則會干擾吉西他濱的代謝,產(chǎn)生耐藥。在一些回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，RRM1 與吉西他濱耐藥密切相關(guān),接受過吉西他濱和順鉑聯(lián)合治療的NSCLC患者，體 內(nèi)低RRM1 mRNA水平與生存時間成正比。免疫組化是檢測組織標(biāo)本中RRM1蛋白表達(dá)常用的方法，但大多數(shù)腫瘤患 者是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，大快腫瘤組織難以獲得。而實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)以其特異性強(qiáng)、所需組織少(活檢組織，脫落細(xì)胞等)、定量、敏感、方 便等優(yōu)點(diǎn)已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于腫瘤相關(guān)基因、病原體等諸多臨床檢 測。用定量RT-PCR法檢測藥物敏感相關(guān)基因來預(yù)測藥物療效是必然趨勢，而成熟、標(biāo)準(zhǔn)的試劑盒是定量PCR成功檢測的關(guān)鍵。目前熒光實(shí)時定量PCR所 使用的熒光化學(xué)方法主要有染料法(SYBRGreenI染料)和探針法。其中SYBR Green I染料法不需要設(shè)計(jì)合成序列特異性探針，而且熔點(diǎn)曲線來分析產(chǎn)物的 均一性有助于更準(zhǔn)確地分析和識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，是一種簡便，性價 比較高的實(shí)時監(jiān)測方法。 發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是為克服定量PCR探針法技術(shù)需要設(shè)計(jì)合成序列特異 性探針，檢測成本高的不足之處，采用SYBR Green I染料定量PCR技術(shù)，提 供一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒。本實(shí)用新型由盒體、襯墊，染料法(SYBR Green I染料)PCR反應(yīng)液、 Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照、陽性對照組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別染料法 (SYBR Green I染料)PCR反應(yīng)液、Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照、陽性對照。其中PCR反應(yīng)液的成份包含PCR緩沖液、SYBR Green I染料、MgCl2、 dNTPs、檢測用引物。檢測用引物有兩對檢測基因，RRM1;管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH )。其中RRM1引物RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTTGAPDH引物GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTCRRM1標(biāo)準(zhǔn)品序列為acc tggagccttg gcatttagac atctttgaat tccttgattt aaagaagaac acaggaaagg aagagcagcg tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg鄉(xiāng)tttgggg agaggaattt gagaaactat atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaasgttgt aGAPDH標(biāo)準(zhǔn)品序列為gaa ggtgaaggtc ggagtc咖g gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttc對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無RRMl表達(dá)的cDNA樣本， 陽性對照為有RRMl表達(dá)的cDNA樣本。本試劑盒保存于-4°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型主要用于在化療前通過檢測腫瘤組織中RRM1表達(dá)的水平來預(yù)測 患者對吉西他濱抗癌藥的敏感性，從而指導(dǎo)臨床化療方案的選擇，有利于患者 進(jìn)行個體化治療。本實(shí)用新型建立了利用SYBR Green I熒光染料PCR技術(shù)檢測RRM1表達(dá)的方 法，并經(jīng)檢測患者標(biāo)本證實(shí)該方法切實(shí)可行。SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝 中的雙鏈DNA結(jié)合染料，檢測靈敏度很高。但是，由于SYBR Green I與所有的 雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起 的假陽性會影響定量的精確性。在本檢測項(xiàng)目中，通過優(yōu)化引物和SYBR Green IPCR反應(yīng)液，避免了非特異性的擴(kuò)增，通過溶解曲線分析確定這種定量方法 不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。與探針 法相比較，方便且便宜。本試劑盒使用方法每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用無菌去離子水稀釋為1X108 一lX10'2拷貝/ml。擴(kuò)增檢測在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，總體積50ul,其中47.5ul PCR反應(yīng) 液，2.0ul檢測樣品(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)品、陽性和陰性對照)，0.5ulTaqDNA 聚合酶。反應(yīng)條件50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘共 40個循環(huán)，72'C10分鐘。溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物確定無非特異性擴(kuò)增，根據(jù) 所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算標(biāo)本中RRM1和GAPDH的量(拷貝/ul)。 RRM1 與GAPDH的比值即為RRM1表達(dá)指數(shù)。本實(shí)用新型具有的特點(diǎn)是探針法和SYBR Green I熒光染料法是實(shí)時定 量PCR中的常用方法，本實(shí)用新型通過優(yōu)化PCR的引物、SYBRGreenI熒光 染料和PCR的條件，避免了 SYBR Green I熒光染料的缺陷，非特異性的擴(kuò)增， 通過溶解曲線分析該試劑盒不僅保持了 PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基 因的特異性大大提高。本實(shí)用新型設(shè)計(jì)合理，與現(xiàn)有探針法相比較，不需要設(shè) 計(jì)熒光探針，使用方便而且成本低。

圖1為本實(shí)用新型試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為1X1012 -1X108拷貝/ul)擴(kuò)增曲線。圖3為GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線。圖5為RRM1標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為lX10^-lXl()S拷貝/ul)擴(kuò)增曲線。圖6為RRM1標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為RRM1標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅 用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。 實(shí)施例l參見圖l，本實(shí)用新型試劑盒由盒體l、襯墊2，染料法(SYBRGreen I 染料)PCR反應(yīng)液3、 Taq酶4、標(biāo)準(zhǔn)品5、陰性對照6、陽性對照7組成，襯 墊2上設(shè)有容器孔，分別放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反應(yīng)液3、 Taq酶4、標(biāo)準(zhǔn)品5、陰性對照6、陽性對照7。陰性對照6為無RRM1表達(dá)的cDNA樣本，陽性對照7為有RRM1表達(dá) 的cDNA樣本。實(shí)施例2 SYBR Green I熒光染料PCR技術(shù)檢測RRM1表達(dá)及應(yīng)用1. 材料組織總RNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,SYBR Green I熒光染料購于美國Invitrogen公司，pGEM -T Easy克隆系統(tǒng),Taq DNA 聚合酶購于美國Promega公司。7500型定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2. 引物及探針設(shè)計(jì)與合成分別以RRMl和GAPDH全長cDNA序列(GeneBank登錄號分別為BC0064981和NM-002046)為模板，在www.idtdna.com網(wǎng)上設(shè)計(jì)并分析引物，并根據(jù)基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。標(biāo)準(zhǔn)品PCR和檢測用PCR引物序列相同， RRMl -F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC RRMl -R TACAACTTTGCGGACACGACCTT GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC3. 檢測準(zhǔn)備品制備取卵巢癌癌組織，組織提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA, 取0.5ulcDNA在普通PCR儀上擴(kuò)增RRMl和GAPDH基因片段，凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物插入pGEM⑧-TEasy克隆系統(tǒng)，取陽性克隆，EcoR I酶切鑒定，RRM1 254bp,GAPDH226bp。測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/ul)。4. 標(biāo)本檢測30例經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌活檢癌組織標(biāo)本，標(biāo)本用組織提取試劑盒 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA。標(biāo)本cDNA、標(biāo)準(zhǔn)品(1X108—1 X10^拷貝/ul)、陽性和陰性對照各取2.0ul，總體積50ul，在熒光定量PCR儀 ABI7500上分別進(jìn)行RRM1和GAPDH擴(kuò)增。反應(yīng)條件50°C 2分鐘，95°C 10 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘共40個循環(huán)，72°C 10分鐘。溶解曲線分析擴(kuò) 增產(chǎn)物確定無非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)本中RRM1和 GAPDH的量(拷貝/ul)。 RRM1與GAPDH的比值即為RRM1表達(dá)指數(shù)。5. 結(jié)果GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果參見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線見參圖3，圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜 率為-3.19;相關(guān)系數(shù)為0.998。溶解曲線參見圖4，圖3溶解曲線表明GAPDH 擴(kuò)增無非特異性產(chǎn)物，特異性產(chǎn)物溶解溫度為S1.0。C。 RRM1標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果 參見圖5。標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖6，圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.63;相關(guān)系數(shù)為0.999。 溶解曲線參見圖7，圖中溶解曲線表明RRM1擴(kuò)增無非特異性產(chǎn)物，特異性產(chǎn) 物溶解溫度為84.0°C。(1) 30例患者組織檢測結(jié)果如下:IDGADra QtyRRM1 Qtyratio12.78E+102. 46E+080.0125. 07E+091. 58E+080. 0332.18E+101. 82E+080.0149.30E+082. 62E+092.8254.44E+105. 5犯+080.0167.87E+108.06E+070. 0072. 52E+101. 7犯+090. 0781.62E+102.12E+090. 1392.63E+070.00E+000. 00101.53E+095.35E+070. 03111.20E+097.96E+070. 07126.16E+080.00E+000. 00132.71E+080.00E+000. 00142. 0犯+090.00E+000. 00151.30E+097. 5犯+080. 58162.37E+090. 00E+000.00175.84E+070.OOE+000. 00186.18E+074.65E+070.75197.22E+101.09E+090. 02201.60E+086.26E+070. 39211. 51E+091.06E+090. 70226.09E+099.25E+080. 15236. 29E+077. 04E+071. 12241.75E+101.22E+090. 07251.35E+080. OOE+000. 00264. 76E+101. 2犯+090.03273.10E+111. 84E+090. 01281.66E+127. 63E+090. 00292. 87E+125. 15E+090. 00301.13E+121.66E+090. 00
權(quán)利要求1.一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒，由盒體(1)、襯墊(2)，染料法PCR反應(yīng)液(3)、Taq酶(4)、標(biāo)準(zhǔn)品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置染料法PCR反應(yīng)液(3)、Taq酶(4)、標(biāo)準(zhǔn)品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)。
專利摘要一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒，由盒體1、襯墊2，染料法PCR反應(yīng)液3、Taq酶4、標(biāo)準(zhǔn)品5、陰性對照6、陽性對照7組成，襯墊2上設(shè)有容器孔，分別放置染料法PCR反應(yīng)液3、Taq酶4、標(biāo)準(zhǔn)品5、陰性對照6、陽性對照7。本實(shí)用新型通過優(yōu)化PCR的引物、SYBR Green I熒光染料和PCR的條件，避免了SYBR Green I熒光染料的缺陷，非特異性的擴(kuò)增，本試劑盒不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。本實(shí)用新型設(shè)計(jì)合理，與現(xiàn)有探針法相比較，不需要設(shè)計(jì)熒光探針，使用方便而且成本低。
文檔編號G01N21/00GK201083678SQ200720183949
公開日2008年7月9日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者丹 蘇, 馬勝林 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院