本發(fā)明涉及細胞工程,具體涉及導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株、構建方法及應用。
背景技術:
1、血友病a(haemophilia?a,ha)是由f8?(factor?8)基因缺陷引起的最常見的單基因遺傳疾病之一,這種缺陷會導致f8因子在體內的合成障礙或分子結構異常,進而造成凝血因子f8的減少或完全缺失。由于血友病的x連鎖隱性遺傳,女性很少表現(xiàn)出血友病的癥狀。女性血友病最常見的發(fā)病機制是f8基因突變結合x染色體偏斜失活。更罕見的是,f8基因的純合性或復合雜合性突變以及染色體數(shù)目或結構的異常也會導致女性血友病。
2、與ha相關的最常見的異常是內含子1或22的反轉。其他ha病例是由分布在整個基因中的各種點突變引起的,包括錯義、無義、剪接位點、移碼突變和嚴重缺失,其中錯義突變是引起ha最常見的原因。人類f8基因位于x染色體xq28區(qū)域的長臂上,由26個外顯子和25個內含子組成。f8蛋白產(chǎn)物無酶活性。成熟的fviii蛋白由2332個氨基酸組成,分析人類f8基因發(fā)現(xiàn)該蛋白具有明顯的結構域結構,表示為a1-a2-b-a3-c1-c2。fviii在多個位點發(fā)生蛋白水解,產(chǎn)生200?kda重鏈和80?kda輕鏈,形成異源二聚體,這是fviii的主要分泌形式。hfviii異源二聚體在釋放到循環(huán)血液中后被水解為50kda、43kda和73kda的異源三聚體,它們是fviii的活化形式。
3、因此,有針對性的對女性血友病f8基因錯義突變開展遺傳學研究,明確致病基因及其致病機制,對血友病患者的遺傳咨詢和個體化治療具有潛在的臨床意義。
技術實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株、構建方法及應用,從而豐富f8基因突變數(shù)據(jù)庫,為今后ha的精準治療提供新策略。
2、本發(fā)明提供了導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株,包括fviii-?met721arg突變細胞株和fviii-?pro283thr突變細胞株。
3、優(yōu)選的,fviii-?met721arg突變細胞株的堿基序列如seq?id?no:1所示,氨基酸序列如seq?id?no:2所示;fviii-?pro283thr突變細胞株的堿基序列如seq?id?no:3所示,氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
4、優(yōu)選的,所述fviii-?met721arg/fviii-?pro283thr突變細胞株構建方法具體為:
5、s11、對bdd-fviii野生型質粒進行定點誘變,構建表達fviii-met721arg/fviii-pro283thr?cdna序列的質粒,其中fviii-?met721arg突變細胞株的突變位點為f8基因外顯子14上c.2162t>g?(p.met721arg),fviii-?pro283thr突變細胞株的突變位點為f8基因外顯子7上c.847c>a?(p.pro283thr);
6、s12、利用脂質體將含有cdna序列的fviii-met721arg/fviii-pro283thr質粒轉染進細胞中,經(jīng)藥物篩選得到fviii-?met721arg/fviii-pro283thr突變細胞株。
7、優(yōu)選的,bdd-fviii野生型質粒的堿基序列如seq?id?no:5所示,氨基酸序列如seqid?no:6所示。
8、優(yōu)選的,含有cdna序列的fviii-met721arg質粒是基于pcr的方法對bdd-fviii野生型進行定點誘變獲得,含有cdna序列的fviii-?pro283thr質粒是基于無縫克隆技術對bdd-fviii野生型進行定點誘變獲得。
9、優(yōu)選的,所述含有cdna序列的fviii-met721arg質粒/fviii-pro283thr質粒通過脂質體轉染的方法轉染至人胚腎細胞hek293t。
10、優(yōu)選的,所述藥物篩選為抗生素篩選,其中抗性藥物為嘌呤霉素。
11、優(yōu)選的,構建含有cdna序列的fviii-met721arg質粒時,定點誘變所使用的引物為:上游引物5'-tttcggaacagaggcaggaccgccttac-3',下游引物5'-ctgcctctgttccgaaagtctgagttgt-3';
12、構建含有cdna序列的fviii-pro283thr質粒時,定點誘變所使用的引物為:上游引物5'-tctgattggatgccacagga-3',下游引物5'-gcgatggttcctcacaagaa-3'。
13、本發(fā)明還提供了上述導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株或根據(jù)上述導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法獲得的兩個致病錯義突變的細胞株在預防、早期診斷或治療女性血友病中的應用。
14、與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
15、1、本發(fā)明不僅為女性血友病早期診斷和有效治療提供了研究方向和新的理論依據(jù),還在實踐上為研發(fā)治療血友病的特效藥物提供了新的分子靶點和細胞模型。
16、2、本發(fā)明兩種新突變的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了f8基因突變數(shù)據(jù)庫,還通過聯(lián)合兩種新突變的分子致病機制和隨機x染色體失活結果闡明了女性血友病的發(fā)病原因,為血友病患者計劃生育提供遺傳咨詢以及今后女性血友病的精準治療提供新策略。
1.導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株,其特征在于,包括fviii-met721arg突變細胞株和fviii-?pro283thr突變細胞株。
2.根據(jù)權利要求1所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株,其特征在于,fviii-?met721arg突變細胞株的堿基序列如seq?id?no:1所示,氨基酸序列如seq?id?no:2所示;fviii-?pro283thr突變細胞株的堿基序列如seq?id?no:3所示,氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
3.導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,所述fviii-?met721arg/fviii-?pro283thr突變細胞株構建方法具體為:
4.根據(jù)權利要求3所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,bdd-fviii野生型質粒的堿基序列如seq?id?no:5所示,氨基酸序列如seq?id?no:6所示。
5.根據(jù)權利要求4所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,?含有cdna序列的fviii-met721arg質粒是基于pcr的方法對bdd-fviii野生型進行定點誘變獲得,含有cdna序列的fviii-?pro283thr質粒是基于無縫克隆技術對bdd-fviii野生型進行定點誘變獲得。
6.根據(jù)權利要求5所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,所述含有cdna序列的fviii-met721arg質粒/fviii-pro283thr質粒通過脂質體轉染的方法轉染至人胚腎細胞hek293t。
7.根據(jù)權利要求6所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,所述藥物篩選為抗生素篩選,其中抗性藥物為嘌呤霉素。
8.根據(jù)權利要求7所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法,其特征在于,構建含有cdna序列的fviii-met721arg質粒時,定點誘變所使用的引物為:上游引物5'-tttcggaacagaggcaggaccgccttac-3',下游引物5'-ctgcctctgttccgaaagtctgagttgt-3';
9.根據(jù)權利要求1-2任意一項所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株或權利要求3-8任意一項所述的導致復合雜合女性ha患者的兩個致病錯義突變的細胞株的構建方法獲得的兩個致病錯義突變的細胞株在預防、早期診斷或治療女性血友病中的應用。