本發(fā)明涉及核酸檢測，特別涉及一種用于檢測生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重引物組及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、近年來，泌尿生殖道感染疾病患者不斷增多，已婚婦女常見流行病學(xué)調(diào)查研究顯示此類感染患病率已成為婦科疾病之首。引起生殖道感染的病原體種類繁多、復(fù)雜，并且存在一定的無癥狀感染，給疾病的診治造成諸多困難。生殖道病原體感染通常會(huì)導(dǎo)致以下病癥：泌尿系統(tǒng)感染、陰道炎、盆腔炎等。生殖道病原體感染會(huì)增加男女不孕癥、孕產(chǎn)婦的異位妊娠、流產(chǎn)、早產(chǎn)等病癥的發(fā)生率；淋病、梅毒等感染可傳給子女，影響出生嬰兒的身體素質(zhì)和下一代的健康；生殖系統(tǒng)的慢性炎癥將增加hiv感染幾率。

2、生殖道感染會(huì)對(duì)人的生殖功能造成損害，是造成眾多患者不孕不育的一項(xiàng)重要原因。20%-60%的女性不孕中，是由生殖道病原體感染所引起的。陰道炎是極為常見的一種婦科疾病，居?jì)D女生殖道感染疾病之首，其發(fā)生、發(fā)展往往是多種因素共同作用的結(jié)果。生殖道病原體復(fù)雜多樣，包括細(xì)菌、霉菌、滴蟲、支原體、衣原體、淋球菌、病毒等，所引起的生殖道感染與陰道炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。由沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌、人型支原體、生殖支原體、解脲脲原體、乳頭瘤病毒等引發(fā)的性傳播疾病也可以對(duì)器官正常功能造成影響，誘發(fā)不孕癥。

3、臨床上引起生殖道感染的病原體復(fù)雜、多樣，診斷困難，迫切需要尋求一種特異性強(qiáng)、敏感性高，同時(shí)快速、經(jīng)濟(jì)的針對(duì)多重病原學(xué)的檢測手段，為臨床病原學(xué)的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前，臨床上生殖道感染病原體檢測方法主要有病原體培養(yǎng)法、免疫法和熒光定量pcr法等。病毒培養(yǎng)檢測法具有特異性高的特點(diǎn)，是臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)耗時(shí)、敏感性低、對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求高；細(xì)菌培養(yǎng)可以檢測耐藥情況，但樣本易污染，對(duì)結(jié)果影響較大；生殖道感染病原體免疫學(xué)檢測法常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，該法具有直觀、技術(shù)成熟、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)、操作繁瑣、靈敏度低、假陽性高等限制了其在臨床上的參考價(jià)值；熒光定量pcr技術(shù)具有敏感性高、檢測快速、成本相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn)，已在臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有的多重pcr試劑盒存在隨著檢測重?cái)?shù)的增加，引物二聚體形成的可能性上升，可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，降低靶標(biāo)擴(kuò)增效率，影響檢測靈敏度和特異性。盡管已有多重pcr檢測生殖系統(tǒng)的引物組和試劑盒的專利技術(shù)，但針對(duì)生殖系統(tǒng)中個(gè)別病原體的檢測，現(xiàn)有技術(shù)尚未提供一種快速、準(zhǔn)確且操作簡便的多重pcr檢測方法。

4、本發(fā)明提供的病原體標(biāo)志物及其引物在制備用于診斷生殖道感染的產(chǎn)品中的應(yīng)用，可以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的對(duì)生殖道感染相關(guān)的特定病原體診斷研究尚有不足的技術(shù)問題，如傳染性軟疣病毒和sneathia菌，且通常多重pcr檢測同一管檢測為4通道，也就是檢測4種病原體，本發(fā)明可同一管檢測為6種病原體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)的病原體檢測技術(shù)中存在的難以個(gè)別病原體漏檢和篩選復(fù)雜的問題，提供一種新的檢測生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重引物組及試劑盒，病原體包括傳染性軟疣病毒（molluscum?contagiosum?virus，mcv），sneathia菌（sneathia，sb），陰道加德納菌（gardnerella?vaginalis，gv），普雷沃氏菌屬（prevotella，pb），彎曲桿菌屬（campylobacter，cb），巨球型菌屬（megasphaera，mb），陰道阿托波菌（atopobium?vaginae，av），詹氏乳桿菌（lactobacillus?jensenii，lj），卷曲乳桿菌（lactobacillus?crispatus，lc），惰性乳酸桿菌（lactobacillus?iners，li）。

2、具體的，本技術(shù)提供的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種檢測10種生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重引物組，包括：

4、檢測傳染性軟疣病毒的正向引物如seq?id?no?.1所示，反向引物如seq?id?no?.2所示，熒光探針如seq?id?no?.3所示；

5、檢測sneathia菌的正向引物如seq?id?no?.4所示，反向引物如seq?id?no?.5所示，熒光探針如seq?id?no?.6所示；

6、檢測陰道加德納菌的正向引物如seq?id?no?.7所示，反向引物如seq?id?no?.8所示，熒光探針如seq?id?no?.9所示；

7、檢測普雷沃氏菌屬的正向引物如seq?id?no?.10所示，反向引物如seq?id?no?.11所示，熒光探針如seq?id?no?.12所示；

8、檢測彎曲桿菌屬的正向引物如seq?id?no?.13所示，反向引物如seq?id?no?.14所示，熒光探針如seq?id?no?.15所示；

9、檢測巨球型菌屬的正向引物如seq?id?no?.16所示，反向引物如seq?id?no?.17所示，熒光探針如seq?id?no?.18所示；

10、檢測陰道阿托波菌的正向引物如seq?id?no?.19所示，反向引物如seq?id?no?.20所示，熒光探針如seq?id?no?.21所示；

11、檢測詹氏乳桿菌的正向引物如seq?id?no?.22所示，反向引物如seq?id?no?.23所示，熒光探針如seq?id?no?.24所示；

12、檢測卷曲乳桿菌的正向引物如seq?id?no?.25所示，反向引物如seq?id?no?.26所示，熒光探針如seq?id?no?.27所示；

13、檢測惰性乳酸桿菌的正向引物如seq?id?no?.28所示，反向引物如seq?id?no?.29所示，熒光探針如seq?id?no?.30所示。

14、在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述熒光探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。

15、在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述熒光基團(tuán)選自atto?425、fam、rox、cy5、cy5.5和vic中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為bhq1、bhq2和bhq3中的任一種。

16、第二方面，基于同一個(gè)發(fā)明創(chuàng)造，本發(fā)明還提供了一種用于檢測生殖系統(tǒng)疾病病原體的試劑盒，所述試劑盒中包含如第一方面所述的檢測10種生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重引物組。

17、在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述試劑盒包含反應(yīng)液a、反應(yīng)液b、酶混合液、陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。

18、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液a包括反應(yīng)預(yù)混液、傳染性軟疣病毒正向引物、傳染性軟疣病毒反向引物、傳染性軟疣病毒熒光探針，sneathia菌正向引物、sneathia菌反向引物、sneathia菌熒光探針，陰道加德納菌正向引物、陰道加德納菌反向引物、陰道加德納菌熒光探針，普雷沃氏菌屬正向引物、普雷沃氏菌屬反向引物、普雷沃氏菌屬熒光探針，彎曲桿菌屬正向引物、彎曲桿菌屬反向引物、彎曲桿菌屬熒光探針，人核糖核酸酶正向引物、人核糖核酸酶反向引物、人核糖核酸酶熒光探針。

19、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液b包括反應(yīng)預(yù)混液、巨球型菌屬正向引物、巨球型菌屬反向引物、巨球型菌屬熒光探針，陰道阿托波菌正向引物、陰道阿托波菌反向引物、陰道阿托波菌熒光探針，詹氏乳桿菌正向引物、詹氏乳桿菌反向引物、詹氏乳桿菌熒光探針，卷曲乳桿菌正向引物、卷曲乳桿菌反向引物、卷曲乳桿菌熒光探針，惰性乳酸桿菌正向引物、惰性乳酸桿菌反向引物、惰性乳酸桿菌熒光探針，人核糖核酸酶正向引物、人核糖核酸酶反向引物、人核糖核酸酶熒光探針。

20、進(jìn)一步的，所述人核糖核酸酶（rp）的正向引物如seq?id?no?.31所示，反向引物如seq?id?no?.32所示，熒光探針如seq?id?no?.33所示；

21、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)預(yù)混液包括1×pcr反應(yīng)buffer和rnase?free?h2o。

22、進(jìn)一步的，所述酶混合液包括1u/μl?taq?dna聚合酶、0.2u/μl?udg酶。

23、10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測生殖系統(tǒng)疾病病原體的試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照品包含10種病原體和rp基因序列；陰性對(duì)照品為te?buffer。

24、進(jìn)一步的，反應(yīng)液a中，傳染性軟疣病毒（mcv），sneathia菌（sb），陰道加德納菌（gv），普雷沃氏菌屬（pb），彎曲桿菌屬（cb）與人核糖核酸酶?rnase片段這六者熒光探針的熒光基團(tuán)各不相同；反應(yīng)液b中，巨球型菌屬（mb），陰道阿托波菌（av），詹氏乳桿菌（lj），卷曲乳桿菌（lc），惰性乳酸桿菌（li）與人核糖核酸酶?rnase片段這六者熒光探針的熒光基團(tuán)各不相同；但反應(yīng)液a和反應(yīng)液b中的熒光基團(tuán)可以是一致的。

25、進(jìn)一步優(yōu)選的，反應(yīng)液a中，mcv的熒光探針的5’端標(biāo)記有atto?425熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1；sb的熒光探針的5’端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1；gv的熒光探針的5’端標(biāo)記有rox熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq2；pb的熒光探針的5’端標(biāo)記有cy5熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq3；cb的熒光探針的5’端標(biāo)記有cy5.5熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq3；rp的熒光探針的5’端標(biāo)記有vic熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1；

26、進(jìn)一步優(yōu)選的，反應(yīng)液b中，mb的熒光探針的5’端標(biāo)記有atto?425熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1；av的熒光探針的5’端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1；lj的熒光探針的5’端標(biāo)記有rox熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq2；lc的熒光探針的5’端標(biāo)記有cy5熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq3；li的熒光探針的5’端標(biāo)記有cy5.5熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq3；rp的熒光探針的5’端標(biāo)記有vic熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1。

27、試劑盒反應(yīng)原理如下：若在qpcr反應(yīng)過程中，若待檢樣本包含mcv，則裝有反應(yīng)液a的a管的標(biāo)記atto?425探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含sb，則裝有反應(yīng)液a的a管的標(biāo)記fam探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含gv，則裝有反應(yīng)液a的a管的標(biāo)記rox探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含pb，則裝有反應(yīng)液a的a管的標(biāo)記cy5探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含cb，則裝有反應(yīng)液a的a管的標(biāo)記cy5.5探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含mb，則裝有反應(yīng)液b的b管的標(biāo)記atto?425探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含av，則裝有反應(yīng)液b的b管的標(biāo)記fam探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含lj，則裝有反應(yīng)液b的b管的標(biāo)記rox探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含lc，則裝有反應(yīng)液b的b管的標(biāo)記cy5探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含li，則裝有反應(yīng)液b的b管的標(biāo)記cy5.5探針產(chǎn)生熒光信號(hào)。此外，a和b兩管均含有內(nèi)參基因，則標(biāo)記的vic探針應(yīng)產(chǎn)生熒光信號(hào)。

28、進(jìn)一步的，本發(fā)明的具體引物和熒光探針如表1所示：

29、表1：引物和熒光探針序列表

30、

31、

32、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)/有益效果：

33、本發(fā)明檢測生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重引物組及試劑盒可以同時(shí)特異靈敏地檢測10種病原體。生殖系統(tǒng)疾病病原體的多重pcr試劑盒包括10種寄生蟲的擴(kuò)增引物和熒光探針組合。其中，10種寄病原體擴(kuò)增反應(yīng)中含有多條不同病原體靶標(biāo)的熒光探針、引物、酶混合液、pcr反應(yīng)buffer等，可以在同一反應(yīng)體系中檢測是否存在傳染性軟疣病毒（mcv），sneathia菌（sb），陰道加德納菌（gv），普雷沃氏菌屬（pb），彎曲桿菌屬（cb）、巨球型菌屬（mb），陰道阿托波菌（av），詹氏乳桿菌（lj），卷曲乳桿菌（lc）和惰性乳酸桿菌（li），試劑盒里還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，從而監(jiān)控pcr檢測的準(zhǔn)確性。

34、本技術(shù)試劑盒含有udg酶，用于pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本技術(shù)試劑盒含有內(nèi)參對(duì)照，能夠顯示假陰性的發(fā)生，用以對(duì)待測樣本的采集、運(yùn)輸、提取和擴(kuò)增過程進(jìn)行監(jiān)控。本技術(shù)的試劑盒為特異性為100%，檢測靈敏度達(dá)到10?拷貝/ml，特異性好且檢測效率高。采用本技術(shù)試劑盒對(duì)待測樣本進(jìn)行生殖系統(tǒng)疾病病原體鑒定，待測樣本可為陰道分泌物，操作步驟簡單，檢測周期短。