本發(fā)明屬于生物組織培養(yǎng)，具體涉及到用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、肝臟是人體最重要的代謝器官之一，具有多種重要的生理功能，包括合成、代謝、分解和排泄物質(zhì)等。肝組織的細(xì)胞分離和培養(yǎng)對于研究肝臟的生理和病理過程，以及開展藥物代謝和毒性研究具有重要意義。主流的肝細(xì)胞分離方法為消化酶灌注法，這類方法對于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高效可行，但用于手術(shù)切割的人類肝組織樣本則難以開展。同時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的體外增殖培養(yǎng)也是一個(gè)核心瓶頸。即便分離時(shí)可以獲得大量高活率的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也難以系統(tǒng)性的開展科學(xué)研究，且通常不具備復(fù)刻重現(xiàn)的條件，因此研究人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液，包括促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的autgc-hpm培養(yǎng)液和誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞成熟的autgc-hdm培養(yǎng)液；

3、50ml的autgc-hpm培養(yǎng)液由如下組分組成：10μl濃度為125μg/ml的hgf、10μl濃度為125μg/ml的fgf10、10μl濃度為250μg/ml的egf、8μl濃度為200μg/ml的wnt3a、25μl濃度為10mm的a8301、10μl濃度為10mm的y27632、5μl濃度為100μm的gastrinⅰ、500μl青霉素-鏈霉素，其余為autgc-sbm；

4、50ml的autgc-hdm培養(yǎng)液由如下組分組成：10μl濃度為125μg/ml的hgf、5μl濃度為250μg/ml的egf、100μl濃度為10mm的forskolin、25μl濃度為10mm的a8301、50μl濃度為10mm的sb431542、25μl濃度為1mm的iwp2、25μl濃度為100μm的dapt、5μl濃度為100μm的ldn193189、500μl青霉素-鏈霉素、其余為autgc-sbm；

5、500ml的autgc-sbm由如下組分組成：無機(jī)鹽母液10ml、氨基酸母液10ml、維生素母液10ml、葡萄糖4.46g、基礎(chǔ)母液5ml、其余為ddh2o；

6、所述egf為表皮生長因子、dapt為γ分泌酶抑制劑、iwp2為靶向膜結(jié)合的o-?；D(zhuǎn)移酶、sb431542是tgf-β受體激酶抑制劑、forskolin是腺苷酸環(huán)化酶激活劑、wnt3a是wnt3a蛋白、a8301是化學(xué)式為c6h6n2o的小分子抑制劑、y27632是atp競爭性的rock-i和rock-ii抑制劑、ldn193189是一種有效的選擇性bmp?i型受體抑制劑。

7、本發(fā)明還提供一種用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

8、人源肝組織的原代分離處理

9、s1、人源肝組織為非熱切手術(shù)獲得的具有細(xì)胞活性的樣本，或遠(yuǎn)離熱切切口處的具有細(xì)胞活性的樣本，以未進(jìn)行術(shù)前栓塞治療為宜，肝組織樣本在離體后8h內(nèi)完成原代分離；

10、s2、肝組織樣本離體后應(yīng)置入肝組織保存液(含肝素鈉/y27632)，保存的溫度為2～8℃，使用4℃的肝組織清洗液清洗表面殘留的血液以及脫落的紅細(xì)胞及死細(xì)胞；

11、s3、使用無菌鑷子及剪刀手術(shù)刀等工具在生物安全柜內(nèi)去除肝組織中肉眼可見的膽管及血管，去除膽管及血管的肝組織繼續(xù)使用4℃的肝組織清洗液清洗表面殘留的血液以及脫落的紅細(xì)胞及死細(xì)胞；

12、s4、使用組織剪刀或綜合剪刀剪切肝組織成0.5～3mm3大小的組織顆粒，使用消化酶重懸肝組織顆粒、37℃水浴震蕩(200rpm)消化18min；

13、s5、用巴氏吸管吹打肝組織消化酶懸液，加速表層細(xì)胞脫落，繼續(xù)消化7min然后使用巴氏吸管吹打肝組織消化酶懸液，使細(xì)胞充分脫落，用100μm細(xì)胞篩過濾肝組織消化酶懸液，除去未完全消化的組織顆粒，然后濾出液進(jìn)行離心；

14、s6、上步離心后去除上清，使用4℃的dpbs緩沖液重懸沉淀，再對懸液離心處理，預(yù)先使用1ml紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，待沉淀充分溶解后加入5ml紅細(xì)胞裂解液，4℃靜置2min；

15、s6、離心回收沉淀，使用10ml?dpbs清洗沉淀2次再次離心處理，然后接種，培養(yǎng)液使用autgc-hpm，培養(yǎng)液體積：4ml，培養(yǎng)條件：37℃，5％co2。

16、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞原代誘導(dǎo)培養(yǎng)

17、s7、每48h更換一次autgc-hpm培養(yǎng)液，原代細(xì)胞通常需要培養(yǎng)8～12天可形成典型的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞克隆團(tuán)，根據(jù)克隆團(tuán)的貼壁面積，單一克隆團(tuán)的大小決定是否進(jìn)行傳代；

18、s8、原代克隆團(tuán)整體貼壁面積占培養(yǎng)瓶底面積大于40％需要進(jìn)行傳代，或原代克隆團(tuán)中單一克隆團(tuán)直徑大于3mm時(shí)需要傳代；

19、s9、除去autgc-hpm，并加入2ml預(yù)熱至37℃的pbs緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶底面，除去autgc-hpm殘留，以及死細(xì)胞和免疫細(xì)胞；

20、s10、加入7ml預(yù)熱至37℃的pbs緩沖液，中和tryple并使用移液管將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管，離心回收細(xì)胞沉淀，然后使用18～25℃的pbs緩沖液清洗細(xì)胞沉淀，離心回收沉淀。

21、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)

22、s11、將autgc-hpm培養(yǎng)液更換為autgc-hdm，培養(yǎng)72h，每24h更換一次autgc-hdm，完成誘導(dǎo)激活，持續(xù)培養(yǎng)可促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)體內(nèi)的功能。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用機(jī)械剪切加酶解消化分離獲得未完全成熟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并通過autgc-hpm促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，后續(xù)使用autgc-hdm誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞成熟，該培養(yǎng)方法可以大量獲得與來源高度相似的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，為藥物研發(fā)等研究提供重要基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液，其特征在于，包括促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的autgc-hpm培養(yǎng)液和誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞成熟的autgc-hdm培養(yǎng)液；

2.用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：s8中傳代時(shí)使用的pbs緩沖液，tryple消化液，新的autgc-hpm培養(yǎng)液均需要預(yù)熱至37℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了用于人源肝組織分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，包括促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的AUTGC?HPM培養(yǎng)液和誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞成熟的AUTGC?HDM培養(yǎng)液，明采用機(jī)械剪切加酶解消化分離獲得未完全成熟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并通過AUTGC?HPM促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，后續(xù)使用AUTGC?HDM誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞成熟，該培養(yǎng)方法可以大量獲得與來源高度相似的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，為藥物研發(fā)等研究提供重要基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：周巖,周鍵,彭靖元,王珊珊,楊羽辰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海酶康生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9