本發(fā)明涉及種子活力，具體而言，涉及一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、西瓜(citrullus?lanatus)作為全球范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)效益直接受種子質(zhì)量的影響。種子的發(fā)芽率與活力不僅決定了幼苗的生長勢(shì)，也影響了最終產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。然而，低種子活力會(huì)導(dǎo)致一系列農(nóng)業(yè)問題，例如種子發(fā)芽速度慢、不均勻、出苗率低、幼苗生長潛力差、植株抗逆能力不足等。這些問題不僅會(huì)增加播種的成本，還會(huì)導(dǎo)致田間抗逆性減弱、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重影響農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)效益以及農(nóng)業(yè)企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，種子活力的提升及其有效評(píng)估方法的研究已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的技術(shù)問題，現(xiàn)有的種子活力研究和相關(guān)技術(shù)的局限性包括：

2、種子活力的高低通常受遺傳因素、環(huán)境條件和種子儲(chǔ)存條件等因素的影響。在種子發(fā)育過程中，環(huán)境條件如土壤水分、溫度、濕度、光照等均會(huì)影響其發(fā)芽性能。此外，采收、脫粒及儲(chǔ)存過程中可能的機(jī)械損傷和不良儲(chǔ)存條件(如高溫、高濕環(huán)境)也會(huì)導(dǎo)致種子活力的迅速下降。盡管如此，現(xiàn)有的種子活力評(píng)估手段大多依賴于傳統(tǒng)的物理或化學(xué)檢測(cè)方法，例如發(fā)芽率測(cè)試、染色體變異檢測(cè)等，這些方法往往耗時(shí)較長且無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)種子的實(shí)際生理狀態(tài)；分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展為種子活力的研究提供了新的思路。近年來，基于分子標(biāo)志物的種子活力檢測(cè)技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。分子標(biāo)志物指的是那些在種子發(fā)芽和活力變化過程中基因表達(dá)顯著變化的特定基因。這類基因能夠反映種子在特定環(huán)境下的活力水平，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。然而，盡管分子標(biāo)志物在其他作物中的研究已有所進(jìn)展，但對(duì)于西瓜種子活力相關(guān)的分子標(biāo)志物研究尚處于初級(jí)階段?，F(xiàn)階段，針對(duì)西瓜種子活力的分子標(biāo)志物尚未完全被鑒定出來，缺乏一種能夠有效快速評(píng)估西瓜種子活力的分子工具，這限制了對(duì)西瓜種子質(zhì)量的有效把控。

3、并且，現(xiàn)有的西瓜種子活力檢測(cè)方法主要依賴于種子的表型特征，如發(fā)芽率、發(fā)芽速度等。這些方法雖然在一定程度上能夠反映種子的發(fā)育狀態(tài)，但其檢測(cè)結(jié)果往往受到外部環(huán)境條件的強(qiáng)烈影響，難以在不同批次種子中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確評(píng)估。此外，傳統(tǒng)的發(fā)芽測(cè)試過程耗時(shí)較長，不適合大規(guī)模、高效的種子活力評(píng)估。

4、因此，急需一種能夠精準(zhǔn)、高效、快速鑒定西瓜種子活力的分子標(biāo)志物其相應(yīng)的西瓜種子活力的檢測(cè)技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)方法無法準(zhǔn)確、快速評(píng)估種子活力變化的缺陷，以及在檢測(cè)西瓜種子活力耗時(shí)長且受外部條件影響大，無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)種子活力的變化趨勢(shì)的問題。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物，所述西瓜種子活力分子標(biāo)志物核苷酸序列為cla97c02g040900和cla97c06g125700，其序列分別如seq?id?no:1、seq?id?no:2所示，所述cla97c02g040900用于編碼atp依賴性d?na解旋酶，所述cla97c06g125700用于編碼膨脹素蛋白。

3、本發(fā)明一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：通過檢測(cè)本發(fā)明中的西瓜種子活力分子標(biāo)志物，該分子標(biāo)志物的基因用于編碼atp依賴性dna解旋酶，該酶作用為通過水解atp供給能量來解開dna，它們常常依賴于單鏈的存在，并能識(shí)別復(fù)制叉的單鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要；本發(fā)明中的分子標(biāo)志物cla97c02g040900和cla97c06g125700能夠在西瓜種子老化過程中進(jìn)行早期、快速、準(zhǔn)確地反映種子的活力狀態(tài)評(píng)估，相比傳統(tǒng)方法只能在種子外部特征顯著變化時(shí)評(píng)估活力，本發(fā)明中的西瓜種子活力分子標(biāo)志能夠通過檢測(cè)其基因表達(dá)水平，其中cla97c02g040900基因用于編碼atp依賴性dna解旋酶，該酶作用為通過水解atp供給能量來解開dna。cla97c06g125700基因編碼膨脹素蛋白，為細(xì)胞壁的組成成分，能夠控制細(xì)胞壁的松弛；通過上述基因能夠在種子老化的早期階段就捕捉到活力下降的跡象，并且靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的物理和形態(tài)學(xué)評(píng)估方法，而且傳統(tǒng)方法容易受到外界環(huán)境(如溫度、濕度等)的影響，導(dǎo)致評(píng)估結(jié)果不準(zhǔn)確。本發(fā)明基于基因表達(dá)的分子水平檢測(cè)，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，受環(huán)境變化影響較小，總體來說，本發(fā)明中的西瓜種子活力分子標(biāo)志物通過引入分子標(biāo)志物和基因檢測(cè)手段，解決了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)西瓜種子活力檢測(cè)不及時(shí)、不準(zhǔn)確的技術(shù)難題，避免了傳統(tǒng)方法耗時(shí)長、靈敏度低的問題，能夠有效應(yīng)對(duì)種子儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中潛在的活力衰退風(fēng)險(xiǎn)，幫助研究者更好地管理種子的質(zhì)量和壽命。

4、在一種可能的實(shí)施方式中，所述西cla97c02g040900的正向引物和反向引物分別如seq?id?n0:3、seq?id?n0:4所示，所述cla97c06g125700的正向引物和反向引物分別如seq?id?n0:5、seq?id?n0:6所示；

5、其中，seq?id?n0:3和seq?id?n0:4的核苷酸序列分別如下：

6、cla97c02g040900-f：gcagctgcatcaaagcaaga；

7、cla97c02g040900-r：tgcaggcagctggtaacata；

8、其中，seq?id?n0:5、seq?id?n0:6的核苷酸序列分別如下：

9、cla97c06g125700-f：ctcacgccacattctacggt；

10、cla97c06g125700-r：gtactcagagctgccgtgtt。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案的正向引物和反向引物，能夠通過設(shè)計(jì)上述特異性引物，對(duì)標(biāo)志物基因cla97c02g040900進(jìn)行精確的擴(kuò)增和檢測(cè)，進(jìn)一步地提供了在分子水平上提供了對(duì)西瓜種子活力的快速、準(zhǔn)確評(píng)估的方案。

12、本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種所述西瓜種子活力分子標(biāo)志物的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的檢測(cè)方法無法快速、準(zhǔn)確評(píng)估種子活力的問題，提供一種基于分子標(biāo)志物的高效、準(zhǔn)確的活力檢測(cè)方法，能夠早期發(fā)現(xiàn)種子老化跡象，并為種子儲(chǔ)存和栽培提供更科學(xué)的指導(dǎo)。

13、本發(fā)明還提供了一種所述西瓜種子活力分子標(biāo)志物的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括通過所述西瓜種子活力分子標(biāo)志物對(duì)西瓜種子活力進(jìn)行鑒定，其包括以下步驟：

14、s1：收集西瓜種子樣本，并在進(jìn)行引發(fā)處理以提升種子活力；

15、s2：對(duì)所述步驟s1收集的西瓜種子樣本進(jìn)行rna提取，獲得總rna；

16、s3：將所述步驟s2獲得的總rna通過反轉(zhuǎn)錄合成cdna；

17、s4：通過所述步驟s3獲取的cdna，采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)cla97c02g040900基因和cla97c06g125700基因的的表達(dá)水平；

18、s5：通過所述步驟s4獲得的cla97c02g040900基因和cla97c06g125700基因的表達(dá)水平評(píng)估西瓜種子的老化狀態(tài)。

19、本發(fā)明一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物的應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中的應(yīng)用將現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法改為基于活力分子標(biāo)志物cla97c02g040900基因表達(dá)水平的檢測(cè)方法，能夠有效提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率，傳統(tǒng)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)雖然是廣泛使用的種子活力檢測(cè)方法，但存在檢測(cè)周期長、受環(huán)境因素影響大、難以實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè)的問題，而本發(fā)明中的應(yīng)用通過檢測(cè)與種子活力密切相關(guān)的分子標(biāo)志物基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，直接評(píng)估種子的老化狀態(tài)，能夠在種子出現(xiàn)明顯物理變化之前進(jìn)行早期診斷；本發(fā)明中，cla97c02g040900基因的表達(dá)水平與西瓜種子的老化狀態(tài)高度相關(guān)：當(dāng)種子開始老化時(shí)，該基因的表達(dá)水平會(huì)顯著上調(diào)。因此，通過實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)該基因的表達(dá)，可以精準(zhǔn)反映種子的活力水平。而傳統(tǒng)的發(fā)芽率測(cè)試是通過種子是否發(fā)芽來間接評(píng)估種子活力，往往在種子已經(jīng)喪失活力后才能檢測(cè)到活力下降，而通過分子標(biāo)志物檢測(cè)可以更早地識(shí)別活力衰退，基于本發(fā)明的應(yīng)用，能夠更快速、準(zhǔn)確地評(píng)估種子活力狀態(tài)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)不僅能在短時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)(通常幾個(gè)小時(shí))，而且能夠給出種子活力的定量結(jié)果，這為種子儲(chǔ)存、銷售和種植等決策提供了更加科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)；本發(fā)明的應(yīng)用，通過分子生物學(xué)手段，提供了一種更加準(zhǔn)確、高效且定量的種子活力評(píng)估方法，從根本上解決了這一技術(shù)問題。通過對(duì)基因表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)方法中依賴外部環(huán)境、不具備早期檢測(cè)能力等缺陷，為種子質(zhì)量控制提供了全新的技術(shù)路徑；本發(fā)明中的一種西瓜種子活力分子標(biāo)志物的應(yīng)用中的各技術(shù)以及各步驟的技術(shù)特征(如cla97c02g040900基因的特異性引物設(shè)計(jì)、rna提取和反轉(zhuǎn)錄步驟、qpcr技術(shù)的應(yīng)用等)相互關(guān)聯(lián)，共同實(shí)現(xiàn)了早期、高效、準(zhǔn)確的種子活力評(píng)估，在步驟組合之后，本發(fā)明中的應(yīng)用至少具備以下技術(shù)進(jìn)步：

20、1.靈敏度高：通過分子層面的標(biāo)志物檢測(cè)，能夠檢測(cè)到微小的基因表達(dá)變化，確保早期發(fā)現(xiàn)種子活力衰退；

21、2.特異性強(qiáng)：cla97c02g040900基因的特異性引物設(shè)計(jì)能夠確保檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度，避免了非特異性擴(kuò)增的干擾；

22、3.定量分析：通過qpcr方法，能夠定量分析種子活力水平，而不是現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)方法的僅僅依賴發(fā)芽與否的簡(jiǎn)單二分法；

23、4.早期預(yù)測(cè)能力：相比于傳統(tǒng)發(fā)芽率檢測(cè)方法，能夠更早識(shí)別出種子老化狀態(tài)，有助于提前采取措施，避免不必要的損失。

24、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s1中，所述引發(fā)處理包括：將所述西瓜種子樣本通過浸水吸漲6h以上，瀝干水分；置于25-30℃、濕度60-70％的引發(fā)環(huán)境中20h以上，使其活力提升，引發(fā)結(jié)束后將其放于40-50℃的溫度下回干6h以上，收集樣本。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案能夠顯著提高西瓜種子活力檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率，在上述處理中，通過浸水吸漲、引發(fā)處理和回干處理能夠有效激活種子的代謝活動(dòng)，促進(jìn)種子細(xì)胞恢復(fù)活力：通過浸水吸漲6h以上，種子細(xì)胞吸收充足的水分，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)，從而激活代謝通路；緊接著，將種子置于25-30℃、濕度60-70％的引發(fā)環(huán)境中20h以上，可以進(jìn)一步促進(jìn)種子的呼吸作用和生理活性，從而加速種子的活力恢復(fù)；而回干處理中則通過將種子置于40-50℃環(huán)境下6h以上，去除多余水分，使種子達(dá)到適合rna提取的含水量水平，同時(shí)保持種子的活力狀態(tài)。最后，經(jīng)過吸脹和發(fā)芽處理，確保獲得足夠樣本進(jìn)行rna提取和后續(xù)的基因檢測(cè)。。

26、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s2包括：將所述步驟s1處理后的西瓜種子樣本通過液氮冷凍后，用破碎機(jī)將種子磨成粉末，隨后通過天根rnaprep?pure多糖多酚植物總rna試劑盒方法提取其rna，測(cè)定其濃度后，在-80℃的溫度下保存。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案能夠獲得高純度、高穩(wěn)定性的總rna樣本，為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)cla97c02g040900基因的表達(dá)水平奠定了基礎(chǔ)。這種高質(zhì)量的rna提取方法能夠確?；虮磉_(dá)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，避免了現(xiàn)有技術(shù)中因rna純度低或降解問題導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的情況；具體的：在上述可能的實(shí)施方式中，通過液氮冷凍處理，能夠迅速將種子樣本冷凍，避免種子細(xì)胞內(nèi)的rna被降解，并使用破碎機(jī)將種子快速磨成粉末，增加樣本的表面積，便于高效提取rna；隨后，采用天根rnaprep?pure多糖多酚植物總rna試劑盒，能夠有效去除西瓜種子中豐富的多糖和多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)在植物樣品中常常干擾rna的提取和純化，導(dǎo)致rna質(zhì)量下降，通過使用該試劑盒，可以獲得高純度的總rna樣品，避免了常見的rna降解和污染問題。

28、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s3包括：加入2μg所述步驟s2合成的rna，配置反應(yīng)體系為12-xμl?rnase?free?ddh2o、4μl?4×gdna?wiper?mix、xμl模板rn?a，混勻后在42℃反應(yīng)2min，去除基因組dna；隨后加入4μl?5×hiscript?llqrtsu?permixll，混勻后再50℃反應(yīng)15min，再置于85℃下反應(yīng)5s，產(chǎn)物用于后續(xù)的熒光定量pcr反應(yīng)，或保存于-20℃。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案通過去除基因組dna和高效反轉(zhuǎn)錄，獲得的cdna質(zhì)量高，模板純度好，確保后續(xù)熒光定量pcr的特異性和靈敏度。

30、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s4中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)cla97c02g040900基因和cla97c06g125700基因的的表達(dá)水平的操作包括：

31、熒光定量pcr反應(yīng)體系為：10μl?sybr?mix、4μl?ddh2o、0.5μl?f?primer、0.5μl?rprimer、5μl?cdna，且所述cdna為在原模板基礎(chǔ)上稀釋10倍所得的產(chǎn)物；

32、熒光定量pcr反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃5min，變性95℃10s，退火60℃30s，40個(gè)循環(huán)，并且以西瓜actin基因clact作為內(nèi)參基因進(jìn)行反應(yīng)。

33、在一種可能的實(shí)施方式中，所述西瓜actin基因clact的正向引物和反向引物分別如seq?id?n0:7、seq?id?n0:8所示，包括：clact-f：ccatgtatgttgccatcca?g；clact-r：ggatagcatggggtagagca。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，能夠快速、靈敏地檢測(cè)cla97c02g040900基因的表達(dá)水平，并通過內(nèi)參基因clact校正不同樣本間的實(shí)驗(yàn)誤差，確保每個(gè)樣本間的對(duì)比具有可比性和一致性，通過pcr反應(yīng)體系優(yōu)化后的反應(yīng)條件，確保了在每次循環(huán)中特異性擴(kuò)增目標(biāo)基因，熒光信號(hào)穩(wěn)定可靠；通過上述檢測(cè)方法，能夠精確評(píng)估西瓜種子的活力狀態(tài)和老化程度，相較于現(xiàn)有技術(shù)，上述可能的實(shí)施方式在基因表達(dá)定量檢測(cè)中提高了檢測(cè)靈敏度和特異性，減少了非特異性擴(kuò)增的干擾，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性；同時(shí)，通過內(nèi)參基因的引入和優(yōu)化的pcr程序，進(jìn)一步提升了檢測(cè)的精確性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，使其更適合大規(guī)模樣本的檢測(cè)和分析。

35、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s5結(jié)束后，還包括步驟s6：cla97c02g040900基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，其包括：提取樣本總rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cdna產(chǎn)物，再利用包含5′-t7啟動(dòng)子的序列擴(kuò)增目的基因片段，利用t7?rna聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到正義鏈mrna，dnase酶處理，純化后測(cè)定mrna濃度，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)的梯度稀釋，得到一系列濃度相差10倍的樣品，以此為模板進(jìn)行qrt-pcr擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品的ct值相對(duì)目的基因mrna的濃度的負(fù)對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其公式為：ct＝0.9306x+11.25。

36、在一種可能的實(shí)施方式中，所述步驟s6中，所述步驟s6中，當(dāng)ct≥31.47，即表達(dá)量≤4.38*103mrna拷貝數(shù)時(shí)，發(fā)芽率不受影響；當(dāng)表達(dá)量在ct≤28.63，即表達(dá)量≥3.62*104mrna拷貝數(shù)時(shí)，發(fā)芽速率上升，預(yù)示活力的提升。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用上述技術(shù)方案，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)熒光定量pcr的c?t值與目標(biāo)基因mrna濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，該標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠精確地將檢測(cè)樣本的ct值轉(zhuǎn)化為目標(biāo)基因mrna的具體拷貝數(shù)；上述可能的實(shí)施方式通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，得到一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，確保了目標(biāo)基因的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，同時(shí)，ct值與種子發(fā)芽率的相關(guān)性進(jìn)一步表明，目標(biāo)基因的表達(dá)水平可以有效預(yù)測(cè)種子的發(fā)芽速率和活力狀態(tài)；通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的引入，不僅提升了qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還為種子活力的評(píng)價(jià)建立了客觀的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)，能夠精確判斷種子的發(fā)芽狀態(tài)和活力水平；與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠更好地將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際的種子性能相結(jié)合，為種子篩選和種質(zhì)改良提供了可靠的檢測(cè)手段，適用于大規(guī)模樣本的精準(zhǔn)分析與監(jiān)測(cè)。