本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，涉及一種快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human?inducedpluripotent?stem?cells，hipsc)是一種可以在體外無(wú)限自我復(fù)制，體內(nèi)可分化任何細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞，可作為再生醫(yī)學(xué)一種潛在的種子細(xì)胞來(lái)源，在治療各種疾病方面有著巨大的前景。目前，利用hipsc衍生的心肌細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞治療心肌梗死和神經(jīng)退行性疾病已開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗(yàn)，然而，hipsc的致瘤性是臨床應(yīng)用的一大問(wèn)題。hipsc衍生的細(xì)胞治療產(chǎn)品中剩余的未分化hipsc在體內(nèi)可形成畸胎瘤，在移植過(guò)程中具有潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)治療應(yīng)用的安全性提出了挑戰(zhàn)。因此，針對(duì)細(xì)胞藥物制劑的中間品、半成品和成品，開(kāi)發(fā)一種高效、快速、精準(zhǔn)檢測(cè)hipsc殘留量的檢測(cè)試劑盒，評(píng)估臨床應(yīng)用前的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，可為hipsc衍生的細(xì)胞藥物移植安全性提供一份保障。

2、目前為止，涉及體外檢測(cè)hipsc殘留的檢測(cè)試劑盒相關(guān)專利有2024.09.06公開(kāi)的一篇專利，即一種檢測(cè)ipsc殘留的引物探針組合物及試劑盒與應(yīng)用，專利號(hào)cn118600039a，此專利發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)主要是利用數(shù)字pcr進(jìn)行檢測(cè)hipsc殘留的試劑盒及其應(yīng)用。除專利公開(kāi)的試劑盒方法外，hipsc殘留的檢測(cè)技術(shù)方法主要有：1)培養(yǎng)法，即使用hipsc培養(yǎng)條件，培養(yǎng)待檢細(xì)胞10-14天，殘留的hipsc經(jīng)培養(yǎng)形成肉眼可見(jiàn)的克隆，這種方法檢測(cè)hipsc的殘留，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且培養(yǎng)過(guò)程中因培養(yǎng)基的不適宜或細(xì)胞狀態(tài)較差會(huì)導(dǎo)致部分hipsc細(xì)胞死亡丟失，難以形成克隆團(tuán)，造成假陰性結(jié)果，或形成的克隆團(tuán)是由其他細(xì)胞形成，造成假陽(yáng)性結(jié)果；2)流式細(xì)胞檢測(cè)法，即用干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(ssea3、ssea4、tra-1-81、tra-1-60等)的抗體標(biāo)記待檢細(xì)胞，流式陽(yáng)性細(xì)胞群比例為殘留的hipsc，該方法檢測(cè)靈敏度僅為千分之一，檢測(cè)限度低，達(dá)不到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求的檢測(cè)限度；3)免疫熒光染色法，即將待檢細(xì)胞種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，該方法靈敏度極低，同時(shí)對(duì)細(xì)胞鋪板密度和抗體的特異性要求較高，染色背景或處理過(guò)程不當(dāng)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，且對(duì)熒光顯微鏡的分辨率要求較高；4)qrt-pcr檢測(cè)法，即收集待檢細(xì)胞，提取細(xì)胞rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用sybr?green熒光染料法相對(duì)定量檢測(cè)干細(xì)胞特異性基因tdgf1、esrg等基因的表達(dá)水平，sybr?green熒光染料是非特異性的熒光染料，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈(包括非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體等)就會(huì)結(jié)合發(fā)光，檢測(cè)時(shí)可能會(huì)有假陽(yáng)性發(fā)生；5)利用數(shù)字pcr儀的引物探針組合物檢測(cè)方法，獲取殘留細(xì)胞基因的拷貝數(shù)。這種方法需要使用精密度較高的數(shù)字pcr儀，檢測(cè)成本較高，不適用于大眾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室；6)采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，在全基因轉(zhuǎn)錄組水平上分析hipsc殘留，得到準(zhǔn)確的結(jié)果，但檢測(cè)耗時(shí)，數(shù)據(jù)分析難度高需專業(yè)人員，且檢測(cè)成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒，從而有效解決現(xiàn)有hipsc殘留檢測(cè)對(duì)儀器要求高，常規(guī)檢測(cè)靈敏度差，過(guò)程復(fù)雜的技術(shù)問(wèn)題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一個(gè)方面，提供了一種快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒，所述試劑盒包括6種組分，分別為nanog基因引物探針組合物、taqmanfast?qpcr預(yù)混液、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒、陽(yáng)性對(duì)照品、靈敏度對(duì)照品、樣品稀釋緩沖液；所述nanog基因引物探針組合包括正向引物、反向引物和探針；所述正向引物核苷酸序列為seqid?no:1；所述反向引物核苷酸序列為seq?id?no:2；所述探針核苷酸序列為seq?id?no:3；5'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為fam，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為bhq1。

3、進(jìn)一步的，所述快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒pcr反應(yīng)總體系為20μl，分別為10μl?taqman?fast?qpcr預(yù)混液、7μl樣品稀釋緩沖液、1μlnanog基因引物探針組合物、2μl模板；所述模板指標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，陽(yáng)性對(duì)照品，靈敏度對(duì)照品及待測(cè)樣品cdna。

4、進(jìn)一步的，所述快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒pcr反應(yīng)程序?yàn)?4℃(3min)、94℃(5s)、60℃(30s)，重復(fù)循環(huán)40次。

5、進(jìn)一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒大小為3036bp，包含1175bp的tdgf1-nanog目的片段基因，所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)為9.47×1010copies/μl。

6、進(jìn)一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在構(gòu)建過(guò)程中包含擴(kuò)增引物對(duì)，分別為tdgf1基因擴(kuò)增引物，核苷酸序列為seq?id?no:4、seq?id?no:14，擴(kuò)增片段序列為seq?id?no:18；nanog基因擴(kuò)增引物，核苷酸序列為seq?id?no:15、seq?id?no:16，擴(kuò)增片段序列為seq?id?no:19；tdgf1-nanog融合pcr擴(kuò)增引物，核苷酸序列為seq?id?no:4、seq?id?no:17，擴(kuò)增片段序列為seq?id?no:20。

7、進(jìn)一步的，所述陽(yáng)性對(duì)照品為hipsc的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為1μg?rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cdna。

8、進(jìn)一步的，所述靈敏度對(duì)照品為0.01％hipsc和99.99％sh-sy5y混合細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為1μg?rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cdna；所述樣品稀釋緩沖液包含10mmtris-hcl(ph?8.0)和1mm?edta-na2(ph?8.0)。

9、示例性的，所述快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒，nanog基因作為檢測(cè)或評(píng)估hipsc殘留的生物標(biāo)志物。

10、示例性的，所述快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒，應(yīng)用于hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的快速檢測(cè)。

11、示例性的，所述快速檢測(cè)hipsc衍生細(xì)胞中hipsc殘留的試劑盒，用于在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中胚層分化的心肌前體細(xì)胞(hipsc-cvpc)、心肌細(xì)胞(hipsc-cm)、外胚層分化的多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞(hipsc-dap)、多巴胺能神經(jīng)元(hipsc-mda)和內(nèi)胚層分化的細(xì)胞治療藥物產(chǎn)品中hipsc的殘留量的檢測(cè)。

12、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是：本發(fā)明以taqman熒光探針定量pcr技術(shù)為主，形成qpcr-taqman熒光探針檢測(cè)試劑盒，通過(guò)檢測(cè)基因nanog的拷貝數(shù)，計(jì)算人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞中hipsc殘留量，通過(guò)taqman探針的使用，從而使得本技術(shù)試劑盒具有更高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)靈敏度可達(dá)萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之一，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計(jì)算獲得基因的拷貝數(shù)；通過(guò)利用nanog基因在hipsc中具有較高表達(dá)，但在分化細(xì)胞或成體功能細(xì)胞系中不表達(dá)，從而更加高效的實(shí)現(xiàn)hipsc來(lái)源的多種功能細(xì)胞中的hipsc的殘留的檢測(cè)。檢測(cè)成本更低，針對(duì)沒(méi)有數(shù)字pcr的企業(yè)也能高效的完成檢測(cè)，檢測(cè)效率更高。