本發(fā)明涉及一種協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法。

背景技術(shù)：

1、油茶餅粕是油茶生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除木質(zhì)纖維素外，還含有蛋白質(zhì)、多糖、多酚、茶皂素等生物活性成分，是制成微生物替代培養(yǎng)基的潛在材料。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，將已提取茶皂素的油茶餅粕浸提液作為培養(yǎng)基時(shí)，所制備的微生物絮凝劑對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率最高為86.1％，仍然存在絮凝率偏低的缺陷，另外，上述利用油茶餅粕浸提液制備微生物絮凝劑的方法中還需要額外添加蔗糖、酵母膏和無(wú)機(jī)鹽，這也使得生產(chǎn)成本難以有效降低。因此，如何利用油茶餅粕制備得到高產(chǎn)量、高絮凝率的微生物絮凝劑，對(duì)于降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，并實(shí)現(xiàn)油茶餅粕的高值化利用具有重要意義。

2、油茶餅粕中含有豐富的茶皂素，且茶皂素作為一種天然的非離子表面活性劑，具有生物可降解性、生物相容性好、毒性小等優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、日化、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中，因而從油茶餅粕中提取高價(jià)值的茶皂素值得研究。目前，茶皂素的工業(yè)提取方法主要為水提法和有機(jī)溶劑浸提法，其中水提法是茶皂素提取的傳統(tǒng)方法，主要是利用茶皂素易溶于熱水的性質(zhì)，用熱水作為溶劑提取茶皂素，該方法工藝簡(jiǎn)單，投資少成本低，但長(zhǎng)時(shí)間的熱水浸提造成茶皂素水解，大量的水溶性雜質(zhì)溶出。有機(jī)溶劑浸提法一般是使用一定比例的甲醇或乙醇作為溶劑，利用雜質(zhì)成分在醇類(lèi)溶劑中的微量溶解特性以提取茶皂素，該方法能耗小，但溶劑消耗量大，生產(chǎn)工藝復(fù)雜且設(shè)備要求高。提取獲得的茶皂素粗產(chǎn)品往往含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、單寧、色素等雜質(zhì)，粘度大、色澤深，在空氣中易吸潮凝結(jié)。在對(duì)產(chǎn)品純度具有要求時(shí)，一般需通過(guò)絮凝除雜、化學(xué)沉淀、重結(jié)晶、膜分離、樹(shù)脂吸附、凝膠色譜等方法將粗產(chǎn)品進(jìn)一步純化。其中，絮凝除雜處理可向上對(duì)接不同類(lèi)型的提取方案，向下兼容不同級(jí)別的純化路徑，處于茶皂素等植物功能成分提取制備過(guò)程的節(jié)點(diǎn)位置，對(duì)各類(lèi)工藝均表現(xiàn)出了廣泛的適用性和有效性。相較于化學(xué)絮凝劑，微生物絮凝劑具有安全無(wú)毒、可生物降解等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)絮凝沉淀物不含有害物質(zhì)，在茶皂素后續(xù)的高值化利用方面中具有潛在優(yōu)勢(shì)。因此，針對(duì)油茶皂素提取純化過(guò)程的復(fù)雜絮凝條件，以及產(chǎn)品收率、純度等多重目標(biāo)需求，若能利用油茶餅粕同時(shí)制備高收率和高純度的微生物絮凝劑和茶皂素，有利于最大程度的挖掘出油茶餅粕的價(jià)值潛力。

3、此外，微生物絮凝劑在使用之前大多需要使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取和純化，以有效去除絮凝劑和發(fā)酵液中沒(méi)有絮凝作用的多余化學(xué)成分，但是這會(huì)消耗的大量有機(jī)溶劑，不僅讓制作成本提高，同時(shí)對(duì)環(huán)境和人體健康存在著潛在的危害。與此同時(shí)，茶皂素的提取工藝中也需要用到大量的有機(jī)溶劑，一般是以甲醇或乙醇作為溶劑，通過(guò)利用雜質(zhì)成分在醇類(lèi)溶劑中的微量溶解特性以提取茶皂素。因此，若能將油茶皂素提取工藝中回收的有機(jī)溶劑應(yīng)用到微生物絮凝劑的制備中，不僅可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)溶劑循環(huán)利用，在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)降低工藝的成本。

4、因此，開(kāi)發(fā)出一種工藝簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉、環(huán)境友好的協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法，是十分有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種工藝簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉、環(huán)境友好的協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法，不僅能夠制備得到收率高且純度高的茶皂素，而且還能制備得到產(chǎn)量高且純度高的微生物絮凝劑。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法，包括以下步驟：

4、s1、將油茶餅粕與水混合，超聲，靜置，過(guò)濾，得到茶皂素粗提液和殘?jiān)?/p>

5、s2、將茶皂素粗提液和殘?jiān)旌线M(jìn)行水熱處理，過(guò)濾，得到油茶餅粕浸提液；

6、s3、取步驟s2中得到的油茶餅粕浸提液配置成油茶餅粕培養(yǎng)基，接種絮凝功能菌種子液進(jìn)行培養(yǎng)，離心，得到微生物絮凝劑粗品；

7、s4、將步驟s3中得到的微生物絮凝劑粗品與有機(jī)溶劑混合，靜置，離心，干燥，得到微生物絮凝劑純品；

8、s5、取步驟s1中得到的茶皂素粗提液與水混合，攪拌，靜置，使油水分層，保留水溶液；

9、s6、將步驟s4中得到的微生物絮凝劑純品制成微生物絮凝劑溶液，與步驟s5中得到的水溶液、助凝劑溶液混合進(jìn)行絮凝，靜置，過(guò)濾，得到液態(tài)茶皂素；

10、s7、對(duì)步驟s5中得到的液態(tài)茶皂素進(jìn)行一次濃縮，回收水分，得到濃縮物；

11、s8、將步驟s7中得到的濃縮物與有機(jī)溶劑混合進(jìn)行萃取，收集上層液；

12、s9、對(duì)步驟s8中收集得到的上層液進(jìn)行脫色、二次濃縮，回收有機(jī)溶劑，得到固態(tài)茶皂素。

13、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s7中，所述回收的水返回到步驟s1中，或返回至步驟s5中。

14、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s9中，所述回收的有機(jī)溶劑返回到步驟s4中，或返回至步驟s8中。

15、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s1中，所述油茶餅粕與水的比例為30g～200g∶1l；所述油茶餅粕在使用之前還包括以下處理：將油茶餅粕烘干，粉碎，過(guò)40目～60目篩，得到油茶餅粕顆粒。

16、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s1中，所述超聲在溫度為40℃～60℃下進(jìn)行；所述超聲的時(shí)間為20min～50min。

17、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s1中，所述油茶餅粕與水的比例為50g～150g∶1l。

18、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s2中，所述水熱處理在溫度為111℃～126℃下進(jìn)行；所述水熱處理的時(shí)間為10min～50min。

19、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s2中，所述油茶餅粕浸提液中多糖的含量為800mg/l～15000mg/l，蛋白質(zhì)的含量為1500mg/l～24000mg/l，scod的含量為8000mg/l～110000mg/l。

20、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述油茶餅粕培養(yǎng)基的制備方法為：將油茶餅粕浸提液、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀混合，得到油茶餅粕培養(yǎng)基。

21、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述油茶餅粕培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的濃度為1.0g/l～2.0g/l，磷酸氫二鉀的濃度為3.0g/l～5.0g/l。

22、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述油茶餅粕培養(yǎng)基的ph值為5～9。

23、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述絮凝功能菌種子液的接種量為所述油茶餅粕培養(yǎng)基體積的4％～5％。

24、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述培養(yǎng)為：在溫度為30℃～35℃、轉(zhuǎn)速為130rpm～150rpm條件下培養(yǎng)12.0h～24.0h，在溫度為20℃～25℃、轉(zhuǎn)速為100rpm～120rpm條件下培養(yǎng)24.0h～72.0h。

25、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm～10000rpm；所述離心的時(shí)間為8min～10min；

26、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s3中，所述絮凝功能菌種子液的制備方法包括以下步驟：

27、(1)將絮凝功能菌菌種接種到固體活化培養(yǎng)基中，在溫度為30℃～35℃下培養(yǎng)12.0h～24.0h，得到一級(jí)種子菌落；所述固體活化培養(yǎng)基的配方為：10.0g/l的蛋白胨，3.0g/l的牛肉膏，5.0g/l的氯化鈉，20.0g/l的瓊脂粉，ph值為7～8；所述絮凝功能菌菌種為多粘類(lèi)芽孢桿菌、乳酸菌、丁酸梭菌和鹽單胞菌中的一種；所述多粘類(lèi)芽孢桿菌為ga1；

28、(2)將步驟(1)中得到的一級(jí)種子菌落接種到液體增殖培養(yǎng)基中，在溫度為25℃～30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm～150rpm的條件下培養(yǎng)12.0h～24.0h，得到絮凝功能菌種子液；所述液體增殖培養(yǎng)基的配方為：10.0g/l的蛋白胨，3.0g/l的牛肉膏，5.0g/l的氯化鈉，ph值為7～8。

29、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s4中，所述微生物絮凝劑粗品與有機(jī)溶劑的體積比為1～2∶1～3。

30、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s4中，所述有機(jī)溶劑為丙酮和/或乙醇；所述有機(jī)溶劑在使用之前還包括以下處理：在溫度為4℃下預(yù)冷12h～24h。

31、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s4中，所述靜置在溫度為4℃下進(jìn)行；所述靜置的時(shí)間為24h～48h；所述離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm～10000rpm；所述離心的時(shí)間為8min～10min。

32、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s5中，所述茶皂素粗提液與水的體積比為2～4∶1；所述攪拌在搖床上進(jìn)行；所述攪拌的時(shí)間為2h～5h；所述靜置的時(shí)間為5h～12h。

33、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述微生物絮凝劑溶液由微生物絮凝劑純品與水混合后制得；所述微生物絮凝劑純品與水的質(zhì)量比為1∶100～200。

34、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述水溶液與所述微生物絮凝劑溶液的體積比為100∶1～2。

35、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述水溶液與所述助凝劑溶液的體積比為100∶2～3。

36、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述助凝劑溶液中的助凝劑為氯化鈣、石灰中的至少一種；所述助凝劑溶液中助凝劑的質(zhì)量濃度為8％～10％。

37、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述絮凝為：在轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的條件下攪拌3min～5min，在轉(zhuǎn)速為30r/min～60r/min的條件下攪拌3min～5min。

38、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s6中，所述靜置的時(shí)間為10min～30min。

39、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s8中，所述有機(jī)溶劑為丙酮和/或乙醇。

40、上述的方法，進(jìn)一步改進(jìn)的，步驟s9中，采用活性炭或雙氧水對(duì)步驟s8中收集得到的上層液進(jìn)行脫色。

41、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

42、(1)本發(fā)明提供了一種協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法，以油茶餅粕為原料分別制成茶皂素粗提液和油茶餅粕浸提液，一方面，利用油茶餅粕浸提液制成油茶餅粕培養(yǎng)基，并接種絮凝功能菌進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)完成后通過(guò)離心去除菌體，以及在有機(jī)溶劑的作用下對(duì)微生物絮凝劑進(jìn)行純化，有效去除發(fā)酵液中沒(méi)有絮凝作用的多余化學(xué)成分，由此可以獲得高產(chǎn)量和高純度的微生物絮凝劑；另一方面，將茶皂素粗提液與水混合，去除茶皂素粗提液中殘留的油脂，消除了油脂對(duì)后續(xù)絮凝純化過(guò)程所帶來(lái)的不利影響，同時(shí)也能減少茶皂素產(chǎn)品中油脂的含量，在此基礎(chǔ)上，利用所制備的高純度微生物絮凝劑和助凝劑對(duì)經(jīng)除油后的茶皂素粗提液進(jìn)行絮凝，在助凝劑溶液和微生物絮凝劑的共同作用下，不僅可以絮凝去除懸浮顆粒，而且也能吸附去除多糖、蛋白、棕色素及單寧等可溶性雜質(zhì)，同時(shí)能夠最大程度的保留茶皂素，在確保高收率的同時(shí)也能獲得高純度的液態(tài)茶皂素，最后通過(guò)濃縮、萃取和脫色，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，提升茶皂素的品質(zhì)，并獲得更高純度的固態(tài)茶皂素。除此之外，還能回收水和有機(jī)溶劑，并能實(shí)現(xiàn)水和有機(jī)溶劑的循環(huán)共用，在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)降低工藝成本。本發(fā)明中，需要先將微生物絮凝劑純品配制成微生物絮凝劑溶液，再與助凝劑溶液混合，這有利于提高絮凝效果，進(jìn)而能夠確保對(duì)體系中各種雜質(zhì)的有效去除，這是因?yàn)槿糁苯踊旌希齽┡c微生物絮凝劑之間會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致它們的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，從而不利于提高絮凝效果，而且直接混合，會(huì)導(dǎo)致混合后的物質(zhì)無(wú)法在水中均勻分散，導(dǎo)致某些區(qū)域的絮凝劑或助凝劑的濃度過(guò)高，而其他區(qū)域則濃度不足，這些缺陷的存在都不利于提高絮凝效果。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法具有以下優(yōu)勢(shì)：(a)有機(jī)溶劑的用量少，為了提高微生物絮凝劑的產(chǎn)量，常規(guī)微生物絮凝劑的純化方法中，有機(jī)溶劑的用量通常是發(fā)酵液體積的2倍至3倍，而本發(fā)明中，有機(jī)溶劑的用量最低可為微生物絮凝劑粗品體積的50％，此時(shí)，微生物絮凝劑的產(chǎn)量為6.21g/l，達(dá)到了2倍體積有機(jī)溶劑提取量的95.9％，大幅縮減了提取工藝中有機(jī)溶劑的使用量，更為重要的是，本發(fā)明中，微生物絮凝劑與茶皂素的提取共用一套有機(jī)溶劑的循環(huán)利用體系，能夠?qū)崿F(xiàn)有機(jī)溶劑的循環(huán)共用，從而能夠進(jìn)一步降低有機(jī)溶劑的用量；(b)微生物絮凝劑的產(chǎn)量高且純度高，例如，所制備的微生物絮凝劑中胞外聚合物的分子量集中在4.4×105-4.6×105da，相較于傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)絮凝劑分子量具有更高的一致性，有利于單一比例有機(jī)溶劑的集中提取，同時(shí)，有機(jī)溶劑的體積為微生物絮凝劑粗品的50％時(shí)，提取得到的微生物絮凝劑分子量平均值達(dá)到了最高的4.6×105da，具有更加集中的分子量分布范圍和更強(qiáng)的絮凝活性官能團(tuán)峰值水平，表現(xiàn)出更加優(yōu)異的絮凝能力，具體是，該微生物絮凝劑對(duì)高嶺土懸濁液絮凝率可達(dá)99.1％，且在沒(méi)有磷酸鹽輔助的作用下亦能達(dá)到98.9％，更為重要的是，所制備的微生物絮凝劑具有適宜的分子量水平及分布范圍，有利于絮凝劑組分在絮凝過(guò)程中的同步分離，降低了絮凝劑在上清液中的殘留風(fēng)險(xiǎn)，減少了對(duì)后繼茶皂素產(chǎn)品的雜質(zhì)干擾；(c)茶皂素產(chǎn)品的收率高且品質(zhì)高，其中高純度的茶皂素產(chǎn)品的收率最高達(dá)到89.93％，此外，對(duì)多糖、蛋白質(zhì)、單寧和棕色素的去除率最高分別達(dá)到58.4％、53.8％、54.1％和51.1％。本發(fā)明協(xié)同制備茶皂素和微生物絮凝劑的方法還具有工藝簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，使用價(jià)值高，應(yīng)用前景好。

43、(2)本發(fā)明中，通過(guò)優(yōu)化茶皂素粗提液與水的體積比為2～4∶1，在保證除油效果的前提下減少待處理水溶液的體積，進(jìn)而也可以減小后期工藝的處理難度和能耗。特別的，如果水的用量過(guò)高，會(huì)增加待處理樣品的體積，提高了工藝的難度和能耗；如果水的用量過(guò)低，會(huì)降低預(yù)處理的除油效果，同時(shí)降低水中提取的茶皂素含量。通過(guò)優(yōu)化水溶液與微生物絮凝劑溶液的體積比為100∶1～2，可以確保絮凝處理過(guò)程的穩(wěn)定性和高效性，此時(shí)，絮凝體的形成和沉降速度較快，可以縮短處理時(shí)間，提高處理效率，同時(shí)還可以避免過(guò)量投加造成的絮凝劑浪費(fèi)和投加量不足導(dǎo)致的絮凝效果不佳。通過(guò)優(yōu)化水溶液與助凝劑溶液的體積比為100∶2～3，可以加速懸浮物的凝聚，形成大而密實(shí)的絮體，從而有利于后續(xù)的沉淀或過(guò)濾過(guò)程，同時(shí)通過(guò)精確控制助凝劑的投加量，可以避免不必要的浪費(fèi)，降低藥劑成本。特別的，如果助凝劑的投加量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致溶液中的膠體顆?；炷?，形成過(guò)多的細(xì)小顆粒，這些顆粒不易沉降，反而會(huì)影響絮凝效果。通過(guò)優(yōu)化微生物絮凝劑粗品與有機(jī)溶劑的體積比為1～2∶1～3，可以在收獲產(chǎn)量高、純度高的微生物絮凝劑的同時(shí)，減少有機(jī)溶劑的消耗。特別的，如果有機(jī)溶劑用量過(guò)高，則工藝成本增加，同時(shí)對(duì)環(huán)境和健康帶來(lái)了潛在的危害；如果有機(jī)溶劑用量過(guò)低，則微生物絮凝劑無(wú)法被有效地全部提取，得到的產(chǎn)物產(chǎn)量低且純度低。

44、(3)本發(fā)明中，通過(guò)優(yōu)化超聲的條件，具體是在溫度為40℃～60℃下超聲20min～50min，在確保節(jié)能的條件下，可以利用熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，促進(jìn)油茶餅粕中的茶皂素能夠在較短時(shí)間內(nèi)溶出盡可能多，從而有利于提高茶皂素的收率，與此同時(shí)，通過(guò)對(duì)茶皂素粗提液和殘?jiān)幕旌衔镞M(jìn)行水熱處理，可以制備得到營(yíng)養(yǎng)成分豐富、各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適配性好的油茶餅粕浸提液。

45、(4)本發(fā)明中，通過(guò)優(yōu)化油茶餅粕與水的比例，具體是將二者的比例優(yōu)化為30g～200g∶1l，特別是，將二者的比例優(yōu)化為50g～150g∶1l，可以有效提高浸提液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，將其用于培養(yǎng)絮凝功能菌時(shí)，不但有利于形成以胞外聚合物為主要成分的高純度的微生物絮凝劑，而且還能顯著提高微生物絮凝劑的單位產(chǎn)量，有利于提高油茶餅粕的利用率，使得制備成本更低。

46、(5)本發(fā)明中，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)的條件，具體是將絮凝功能菌種子液接種到油茶餅粕培養(yǎng)基中，先在溫度為30℃～35℃、轉(zhuǎn)速為130rpm～150rpm條件下培養(yǎng)12.0h～24.0h，然后在溫度為20℃～25℃、轉(zhuǎn)速為100rpm～120rpm條件下培養(yǎng)24.0h～72.0h，在前階段發(fā)酵過(guò)程中微生物快速生長(zhǎng)，在后階段發(fā)酵過(guò)程中大量產(chǎn)絮，由此可以在減少發(fā)酵時(shí)間的同時(shí)也能獲得高產(chǎn)量、高純度的微生物絮凝劑，有利于大規(guī)模制備，便于工業(yè)化應(yīng)用。